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        皮膚鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌組織中VEGF、COX-2及ID-1的表達(dá)及臨床意義

        2020-11-28 08:19:32黃林陳江艷
        關(guān)鍵詞:比值新生陽性

        黃林,陳江艷

        (重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院 1.皮膚科,2.腫瘤科,重慶 402260)

        鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)及基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma, BCC)是皮膚惡性腫瘤中最常見的亞型,近年來發(fā)病率逐年升高,需要引起高度重視[1]。SCC、BCC 的發(fā)病早期無明顯臨床表現(xiàn),當(dāng)出現(xiàn)特異性改變時(shí)往往已處于中晚期,極易貽誤有效治療時(shí)機(jī)。同時(shí),SCC 與BCC 的治療方法存在差異,且早期鑒別診斷較困難。因此,尋求疾病的早期診斷方法有利于鑒別診斷并及時(shí)進(jìn)行針對(duì)性治療,從而提升預(yù)后質(zhì)量。皮膚SCC、BCC 形成的重要環(huán)節(jié)是新生血管的形成,既往研究表明,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)及分化抑制因子-1(Inhibitor of DNA differentiation-1, ID-1)等可能對(duì)新生血管存在加速效應(yīng),對(duì)SCC、BCC 的形成具有促進(jìn)作用[2]。本研究檢測(cè)VEGF、COX-2 及ID-1 在皮膚SCC、BCC 中的表達(dá),以探討其臨床意義和應(yīng)用前景,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料

        選取2016年3月—2019年3月重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院收治的皮膚惡性腫瘤患者76 例,SCC 組和BCC 組均38 例。其中,男性62 例,女性34 例;年齡30 ~73 歲,平均(63.64±6.30)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①惡性腫瘤經(jīng)病理檢查確診;②臨床資料完整且隨訪完成;③與患者進(jìn)行詳細(xì)溝通并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①已接受放療等其他影響本研究的治療;②受身體條件限制不適合研究或不配合研究;③存在心、肺等嚴(yán)重器官衰竭的癥狀。采用配對(duì)的方式選取30 例無惡性腫瘤的同期皮膚移植患者為對(duì)照組。SCC 組及BCC組的組織取材部位包括頭皮、面部、四肢等,對(duì)照組的組織來源于皮膚移植的剩余材料。3 組患者的性別構(gòu)成比、平均年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)備案。

        1.2 方法

        1.2.1 試劑和儀器兔抗人VEGF、COX-2、ID-1抗體購自英國Abcam 生物有限公司,磷酸鹽緩沖液(PBS)、辣根過氧化物酶(HRP)、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)購自北京科展生物科技有限公司,RT-PCR 儀、Invitrogen 凝膠成像系統(tǒng)購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

        表1 兩組患者術(shù)前基線資料的比較

        1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)VEGF、COX-2 及ID-1的陽性表達(dá)率[3]對(duì)皮膚組織進(jìn)行包埋、切片、脫蠟及抗原修復(fù)處理。一抗選用兔抗人VEGF、COX-2、ID-1 抗體,采用PBS 稀釋,PBS 作為對(duì)照。二抗選用羊抗兔多克隆抗體,采用HRP 稀釋,染色后封存處理。光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)出棕色顆粒為VEGF、COX-2 及ID-1 陽性表達(dá)。

        1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA的表達(dá)[4-5]對(duì)皮膚組織提取總RNA,行RT-PCR 檢測(cè)。具體步驟:96℃預(yù)變性5 min,92℃變性2 min,55℃退火30 s,75℃延伸3 min;重復(fù)25 個(gè)循環(huán)獲取PCR 產(chǎn)物。此后行電泳分離,并利用Invitrogen 凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳各條帶進(jìn)行平均灰度值的測(cè)定,并與標(biāo)準(zhǔn)條帶(β-actin)進(jìn)行比較,以其比值作為mRNA表達(dá)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

        1.2.4 Western blotting 法 檢 測(cè)VEGF、COX-2 及ID-1 的蛋白相對(duì)表達(dá)量[6-7]PBS 緩沖液沖洗皮膚組織,加入裂解液500 μl,低溫15 000 r/min 離心3 min,留取上清液。加入SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)膜,封閉后在低溫環(huán)境加入VEGF、COX-2 及ID-1 的一抗,搖床過夜后加入二抗,隨后進(jìn)行洗膜和顯色以檢測(cè)蛋白表達(dá)。以β-actin 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,測(cè)定VEGF、COX-2及ID-1 蛋白表達(dá)的絕對(duì)值及與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比值,以降低研究誤差。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間的比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用例(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn)和χ2分割法;相關(guān)性分析采用Pearson 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 3 組VEGF、COX-2 及ID-1 陽性表達(dá)的比較

        3 組VEGF、COX-2 及ID-1 的陽性表達(dá)見圖1~3。3 組VEGF、COX-2 及ID-1 的陽性表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步兩兩比較,SCC組與BCC 組高于對(duì)照組(P<0.05);SCC 組高于BCC組(P<0.05)。見表2。

        圖1 3 組VEGF 的表達(dá) (SP×200)

        圖2 3 組COX-2 的表達(dá) (SP×200)

        圖3 3 組ID-1 的表達(dá) (SP×200)

        2.2 3 組VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較

        3 組VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 及蛋白表達(dá)的比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步兩兩比較,SCC 組與BCC 組高于對(duì)照組(P<0.05);SCC組高于BCC 組(P<0.05)。見表3、4 和圖4、5。

        2.3 SCC 組及BCC 組中VEGF、COX-2 及ID-1表達(dá)的相關(guān)性

        對(duì)SCC組及BCC組中VEGF、COX-2 及ID-1的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明:VEGF 與COX-2呈正相關(guān)(r=0.353,P=0.027),VEGF 與ID-1 呈正相關(guān)(r=0.395,P=0.015),COX-2 與ID-1 呈正相關(guān)(r=0.437,P=0.007)。

        表2 3 組VEGF、COX-2 及ID-1 陽性表達(dá)的比較例(%)

        表3 3 組VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 表達(dá)的比較(±s)

        表3 3 組VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 表達(dá)的比較(±s)

        注:①與對(duì)照組比較,P <0.05;②與BCC 組比較,P <0.05。

        組別 n VEGF mRNA COX-2 mRNA ID-1 mRNA SCC 組 38 0.93±0.13①② 0.71±0.10①② 0.92±0.12①②BCC 組 38 0.54±0.10① 0.62±0.12① 0.63±0.11①對(duì)照組 30 0.23±0.08 0.40±0.09 0.18±0.08 F 值 241.033 8.690 8.648 P 值 0.000 0.009 0.009

        表4 3 組VEGF、COX-2 及ID-1 蛋白表達(dá)的比較 (±s)

        表4 3 組VEGF、COX-2 及ID-1 蛋白表達(dá)的比較 (±s)

        注:①與對(duì)照組比較,P <0.05;②與BCC 組比較,P <0.05。絕對(duì)值為蛋白水平,比值為蛋白水平與標(biāo)準(zhǔn)蛋白β-actin 水平的比值。

        VEGF COX-2 ID-1絕對(duì)值 比值 絕對(duì)值 比值 絕對(duì)值 比值SCC 組 38 9.26±2.49 6.47±0.24①② 0.78±0.05①② 3.39±0.28①② 0.47±0.06①② 5.59±0.23①② 0.68±0.09①②BCC 組 38 9.33±2.27 4.96±0.22① 0.62±0.08① 2.48±0.27① 0.38±0.04① 4.11±0.21① 0.55±0.10①對(duì)照組 30 9.25±2.34 3.57±0.10 0.41±0.06 1.34±0.25 0.24±0.05 2.25±0.19 0.34±0.09 F 值 0.012 462.577 82.393 275.372 139.424 552.684 31.068 P 值 0.978 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000組別 n β-actin(標(biāo)準(zhǔn)值)

        圖4 3 組VEGF、COX-2 及ID-1 mRNA 的表達(dá)

        圖5 3 組VEGF、COX-2 及ID-1 蛋白的表達(dá)

        3 討論

        SCC 與BCC 是皮膚科常見的難治性惡性腫瘤,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,與多基因改變相關(guān),且早期無特異性表現(xiàn),當(dāng)疾病確診時(shí)往往已處于惡化的中晚期,不利于及時(shí)治療及預(yù)后恢復(fù)[8-9]。因此,SCC 與BCC 的早期診斷較困難,需要研究預(yù)測(cè)其早期特異性改變的指標(biāo),以達(dá)到早期診治、改善預(yù)后的目的[10-11]。

        腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移過程的重要促進(jìn)因素是新生血管的形成。VEGF 具有較好的促血管作用,可促進(jìn)血管的新生并提升其通透能力,因此通過檢測(cè)VEGF 水平可以較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)腫瘤血管狀況[12-13]。既往研究表明,在肺癌、十二指腸癌等多種惡性腫瘤中,VEGF 均呈高表達(dá),且其成分與腫瘤的侵襲性具有相關(guān)關(guān)系[14-15]。COX-2 在炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用,另外,還參與腫瘤進(jìn)展的多個(gè)重要環(huán)節(jié),包括新生血管生成、誘導(dǎo)增殖并阻滯凋亡等;因此COX-2 可見于多種腫瘤[16-17]。ID 屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)反式作用因子家族,可通過與堿性HLH 蛋白(bHLH)結(jié)合而抑制蛋白的分化轉(zhuǎn)錄[18-19]。既往基因組學(xué)研究表明,ID-1 可通過體內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)癌細(xì)胞的發(fā)生、進(jìn)展及凋亡過程產(chǎn)生干預(yù),可特異性阻滯癌細(xì)胞周期,阻滯細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,與體內(nèi)原癌基因的效果類似[20]。

        本研究結(jié)果表明,3 組VEGF、COX-2 及ID-1 的陽性表達(dá)率、mRNA 及蛋白表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SCC 組與BCC 組均高于對(duì)照組;SCC 組均高于BCC 組。以上結(jié)果與KARSTEN 等學(xué)者[21]的研究結(jié)果類似。

        本研究對(duì)VEGF、COX-2 及ID-1 在SCC、BCC及對(duì)照組的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明其變化規(guī)律類似,具有共同的表達(dá)趨勢(shì),可能存在相關(guān)關(guān)系,共同對(duì)疾病進(jìn)行調(diào)節(jié)。為此本研究進(jìn)一步對(duì)SCC 組及BCC 組中VEGF、COX-2 及ID-1 表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析,結(jié)果表明,VEGF、COX-2 及ID-1 3 者之間的表達(dá)均呈正相關(guān)??梢奦EGF、COX-2 及ID-1 聯(lián)系密切,采用聯(lián)合檢測(cè)的手段有利于SCC、BCC 疾病的精確診斷,尤其對(duì)早期診斷具有重要的臨床意義[22-23]。

        本研究結(jié)果提示VEGF、COX-2 及ID-1 的表達(dá)存在協(xié)同效應(yīng)。在疾病診斷中可考慮檢測(cè)VEGF、COX-2 及ID-1 以對(duì)腫瘤惡性程度和進(jìn)展能力進(jìn)行有效評(píng)估,尤其適宜用于早期診斷。治療中可考慮通過阻滯ID-1 的表達(dá)過程和活化VEGF 以抑制腫瘤新生血管的生成,可能對(duì)干預(yù)腫瘤的細(xì)胞周期、阻滯腫瘤的進(jìn)展具有一定作用[24]。這一點(diǎn)有待于長時(shí)程、大樣本量的臨床研究。

        綜上所述,皮膚SCC 與BCC 的發(fā)生、發(fā)展與VEGF、COX-2 及ID-1 的高表達(dá)有關(guān),且3 者的表達(dá)呈正相關(guān),有利于促進(jìn)腫瘤新生血管的形成并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移。因此,聯(lián)合檢測(cè)VEGF、COX-2 及ID-1 的表達(dá)對(duì)皮膚SCC 與BCC 具有重要的早期診斷意義,同時(shí)阻滯其表達(dá)通路有利于抑制疾病的進(jìn)展,具有較好的臨床意義。

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