鮑宏剛，王勇敢，朱立強(qiáng)，徐志勇，蘇芳菊，楊海青*

(1解放軍中部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院心內(nèi)科，山西 大同 037000；2聯(lián)勤保障部隊(duì)解放軍第940醫(yī)院心血管內(nèi)科，蘭州 730050)

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是細(xì)胞在應(yīng)激原刺激作用下合成的一組蛋白質(zhì)，以分子伴侶形式直接作用于蛋白分子，通過(guò)影響細(xì)胞信號(hào)途徑發(fā)揮抗應(yīng)激和細(xì)胞保護(hù)作用。其中，HSP70家族作為熱休克蛋白家族中重要組成部分，在生物細(xì)胞中含量最高，可誘導(dǎo)性最強(qiáng)，具有保護(hù)細(xì)胞免受刺激損傷，促進(jìn)受損細(xì)胞修復(fù)、抗炎、抗凋亡、耐受缺血或缺氧損傷等生物學(xué)性能[1-3]。熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSP70升高可使心肌梗死面積減少，使缺血再灌注心肌收縮功能恢復(fù)加快[4]。HSP70的高表達(dá)具有抗氧化功能，可防止氧化蛋白質(zhì)聚集[5,6]。Kim等[7]將高表達(dá)HSP70基因?qū)氪笫篌w內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌組織高表達(dá)的HSP70可抑制一氧化氮合酶的活化，減少一氧化氮的生成，從而提高心肌細(xì)胞對(duì)缺血的耐受性，減少心肌梗死面積。有研究指出，對(duì)谷氨酰胺進(jìn)行預(yù)處理，可誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)，減少擬行心臟外科手術(shù)患者的心肌損傷[8]。自由基損傷是心肌發(fā)生缺血壞死的重要環(huán)節(jié)[9,10]。而HSP70可通過(guò)降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)的表達(dá)增強(qiáng)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的清除能力，進(jìn)而增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗氧化能力，降低活性自由基的損傷[11,12]。但丙氨酰谷氨酰胺(alanyl-glutamine，Ala-Gln)是否可通過(guò)誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)，降低MDA活性，減輕SOD水平而在心肌梗死中起到保護(hù)作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究選擇Ala-Gln作為谷氨酰胺的供體誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，旨在觀察Ala-Gln在大鼠心肌梗死中的作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠體質(zhì)量為(160±20)g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物使用許可證號(hào)2007000524909)。

1.1.2 主要藥品及試劑 注射用丙氨酰谷氨酰胺購(gòu)自海南靈康制藥有限公司。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。槲皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司。伊文思藍(lán)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)供應(yīng)站。兔抗鼠HSP70抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。羊抗兔生物素標(biāo)記性二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。DAB染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。MDA試劑盒、SOD試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的建立 將36只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為4組，即假手術(shù)組、模型組、治療組、槲皮素組，每組9例。將大鼠固定在自制動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，用硫代硫酸鈉脫毛，以3.5%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉，氣管插管并連接海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn)的小動(dòng)物呼吸機(jī)。逐層打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包，找到左冠狀動(dòng)脈主干后，以其為標(biāo)志，于左心耳下方2 mm處進(jìn)針，無(wú)損傷帶針縫合線(xiàn)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，當(dāng)結(jié)扎區(qū)域心肌變白，心電圖肢導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段上抬≥0.2 mV，則判斷為造模成功。36只SD大鼠均順利完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)。造模成功后，治療組按0.75 mg/kg給予Ala-Gln溶液(Ala-Gln+生理鹽水配成濃度為3.3%的溶液)，腹腔注射1次/d，連續(xù)7 d；槲皮素組在給予Ala-Gln溶液前6 h，按100 mg/kg給予槲皮素(槲皮素是分布于植物界的一種黃酮類(lèi)復(fù)合物，具有廣泛的生物學(xué)功能，是一種HSP70抑制劑)腹腔注射，注意在使用時(shí)需先溶解于DMSO中，1次/d，連續(xù)7 d；假手術(shù)組在相同冠狀動(dòng)脈部位只穿線(xiàn)，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈；模型組與假手術(shù)組分別于腹腔注射與槲皮素組等量的生理鹽水。

1.2.2 大鼠心肌組織病理改變 取部分心肌組織置于中性甲醛溶液中固定24 h后，石蠟包埋并切成5 μm薄片，用蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色。在光學(xué)顯微鏡下，每張切片在缺血區(qū)隨機(jī)選擇4個(gè)高倍視野(×400)，觀察心肌組織學(xué)變化。

1.2.3 免疫組化法觀察大鼠心肌組織中HSP70的表達(dá) 將心肌組織切片置于68 ℃烤箱中烤60 min后行免疫組化染色。在光鏡下觀察HSP70染色情況，每張切片隨機(jī)取4個(gè)非重疊無(wú)血管視野(×400)，利用Image-Proplus 5.0圖像掃描軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性物質(zhì)的平均光密度值。平均光密度值=累積光密度值/面積。

1.2.4 MDA和SOD的測(cè)定 通過(guò)脫臼法處死大鼠后立即取心臟組織100 mg，按1∶9的比例加入生理鹽水，玻璃勻漿器低溫下勻漿，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，取上清液。分別采用黃嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定MDA和SOD，嚴(yán)格按試劑盒操作要求進(jìn)行。

1.2.5 心肌梗死面積的測(cè)量 右心室取血后取出心臟，保留部分主動(dòng)脈，經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注心臟，以生理鹽水沖洗心臟，再次在相同部位結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，并用Evans blue染色劑從主動(dòng)脈逆行灌注心臟，區(qū)分非缺血部位和缺血部位，而后放入-20 ℃冰箱中冷凍15 min至心臟組織僵硬。垂直心臟長(zhǎng)軸方向，以手術(shù)刀切片，每片厚約1 mm，剔取左心室，濾紙干燥，電子天平稱(chēng)重測(cè)得左心室重量。再剔取左心室缺血部位稱(chēng)重并計(jì)算缺血心肌重量占左心室重量的百分比(以下簡(jiǎn)稱(chēng)IM/LV)。將左心室缺血部位切片放入1% TTC中，37 ℃水浴30 min，區(qū)分非梗死部位和梗死部位，剔取梗死區(qū)域的心肌組織，濾紙干燥后稱(chēng)重，并計(jì)算梗死心肌重量占左心室重量的百分比(以下簡(jiǎn)稱(chēng)NEC/LV)。

1.2.6 血清心肌酶的測(cè)定 待大鼠處死后，開(kāi)胸顯露心臟，右心室取血10 ml，離心后血漿置于-20 ℃冰箱中保存。血漿標(biāo)本解凍后應(yīng)用Hitach 7060型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肌酸磷酸激酶(creatine kinase，CK)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，試劑購(gòu)自科華-東菱公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心臟染色結(jié)果

大鼠心臟組織Evans blue染色結(jié)果可見(jiàn)，非缺血部位呈藍(lán)色，缺血部位則不染色；TTC染色結(jié)果可見(jiàn)，非梗死部位呈深紅色，梗死部位則呈蒼白色(圖1)。

圖1 4組大鼠心臟TTC染色結(jié)果

2.2 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠心肌纖維清晰，排列規(guī)則，無(wú)斷裂和缺血壞死(圖2A)。模型組、槲皮素組見(jiàn)片狀心肌組織壞死溶解，其間可偶見(jiàn)島狀或細(xì)帶狀存活心肌組織，肌纖維斷裂，肌絲斷裂溶解，心肌纖維扭曲、心肌細(xì)胞腫脹，核固縮或溶解(圖2B，D)。治療組心肌組織壞死明顯減輕(圖2C)。

圖2 4組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果

2.3 大鼠心肌組織中HSP70的含量

正常心肌細(xì)胞的HSP70分布于心肌細(xì)胞胞漿中，免疫組化染色陽(yáng)性呈棕黃色。4組HSP70免疫組化染色及半定量分析結(jié)果見(jiàn)圖3。其中，假手術(shù)組、模型組、槲皮素組HSP70表達(dá)水平分別為(0.154±0.036)、(0.151±0.033)、(0.151±0.025)ng/ml，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療組HSP70含量為(0.286±0.056)ng/ml，較其余各組均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 4組大鼠心肌組織HSP70免疫組化染色結(jié)果

2.4 大鼠心肌組織中MDA、SOD的含量

與模型組和槲皮素組相比較，治療組和假手術(shù)組中MDA水平明顯低于模型組和槲皮素組(P<0.01)，治療組與假手術(shù)組MDA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療組和假手術(shù)組中SOD水平明顯高于模型組和槲皮素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且治療組中SOD水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.01；表1)。

表1 4組大鼠心肌細(xì)胞中MDA和SOD含量比較

2.5 大鼠心肌缺血、心肌梗死面積百分比

假手術(shù)組中未見(jiàn)心肌缺血及心肌壞死，模型組較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯的心肌缺血及壞死，而治療組心肌缺血及壞死面積較模型組明顯縮小(P<0.01)，槲皮素組給予槲皮素后心肌缺血面積及梗死面積較治療組增大(P<0.01)，但與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表2)。

表2 4組大鼠心肌缺血和心肌梗死面積百分比比較

2.6 大鼠血清中CK、AST、LDH的含量

血清CK、AST、LDH在模型組、治療組、槲皮素組中的含量均高于假手術(shù)組(P<0.01)，且治療組CK、AST、LDH含量較模型組和槲皮素組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而槲皮素組與模型組CK、AST、LDH含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表3)。

表3 4組大鼠心肌細(xì)胞中CK、AST、LDH含量比較

2.7 HSP70與MDA、SOD、CK、AST、LDH、IM/LV、NEC/LV的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，大鼠心肌組織中HSP70的含量與MDA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.811，P<0.001),與SOD呈正相關(guān)(r=0.973，P<0.001)；大鼠心肌組織中HSP70的含量與CK、AST、LDH呈負(fù)相關(guān)(r=-0.827、-0.862、-0.888，均P<0.001)，與IM/LV、NEC/LV呈負(fù)相關(guān)(r=-0.908、-0.694，均P<0.001)。

3 討 論

自由基損傷是心肌發(fā)生缺血壞死的重要環(huán)節(jié)[10，11]。氧自由基對(duì)心肌的損害主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，即氧自由基與心肌細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸結(jié)合，引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，進(jìn)而引起細(xì)胞生物分子結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞功能損傷，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。MDA是氧自由基生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，可間接反映心肌組織中氧自由基含量的變化；而SOD是生物體產(chǎn)生的一種天然抗氧化物，通過(guò)歧化反應(yīng)清除體內(nèi)生成的氧自由基，對(duì)氧自由基損傷具有保護(hù)作用[13，14]。

HSP70家族作為HSP家族中重要組成部分，在生物細(xì)胞中含量最高，可誘導(dǎo)性最強(qiáng)，具有保護(hù)細(xì)胞免受刺激損傷，促進(jìn)受損細(xì)胞修復(fù)及抗炎、抗凋亡、耐受缺血或缺氧損傷等生物學(xué)功能[1-3]。HSP70高表達(dá)可減少心肌梗死面積，改善心肌收縮功能[3，6]。HSP70高表達(dá)還可減少擬行心臟外科手術(shù)患者的心肌損傷[9]。HSP70可通過(guò)降低MDA的表達(dá)、增強(qiáng)SOD的清除能力進(jìn)而起到增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗氧化能力，降低活性自由基的損傷的作用[11，12]。由此推測(cè)，HSP70的誘導(dǎo)劑Ala-Gln可能對(duì)缺血心肌具有一定的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)手術(shù)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立大鼠缺血心肌模型，通過(guò)大鼠心肌病理染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞壞死，且部分心肌組織出現(xiàn)了纖維化，心肌缺血面積、梗死面積、心肌酶含量較假手術(shù)組增加，模型組MDA表達(dá)水平高于假手術(shù)組，而假手術(shù)組SOD含量則較模型組降低。上述結(jié)果表明，造模成功后心肌細(xì)胞發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物MDA，而且SOD表達(dá)的減少，使心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力降低，造成心肌損傷。此外，治療組造模后30 min給予腹腔注射Ala-Gln，其心肌組織HSP70表達(dá)水平顯著高于其他3組，雖然心肌缺血面積、心肌梗死面積及心肌酶的含量高于假手術(shù)組，但與模型組比較卻下降，且MDA水平較模型組下降，SOD水平卻較模型組升高，提示Ala-Gln對(duì)心肌梗死具有保護(hù)作用，這可能與誘導(dǎo)心肌組織中HSP70表達(dá)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、提高心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力有關(guān)。而槲皮素組在給予HSP70抑制劑后，HSP70的表達(dá)水平較治療組降低，且心肌缺血面積、心肌壞死面積、心肌酶、MDA、SOD與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明Ala-Gln對(duì)心肌梗死的保護(hù)作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)心肌組織HSP70表達(dá)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、提高心肌細(xì)胞清除氧自由基能力來(lái)實(shí)現(xiàn)的，抑制劑抑制了HSP70的表達(dá)，導(dǎo)致保護(hù)作用也隨之消失。

綜上所述，Ala-Gln對(duì)心肌梗死具有保護(hù)作用，該保護(hù)作用主要表現(xiàn)在減少心肌缺血面積、減少心肌梗死面積以及降低心肌酶的含量。其機(jī)制可能與Ala-Gln誘導(dǎo)心肌組織HSP70表達(dá)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、提高心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力有關(guān)。Ala-Gln目前在臨床上已被廣泛應(yīng)用，具有肯定的安全性和有效性，故Ala-Gln誘導(dǎo)HSP70表達(dá)升高用于心肌梗死的防治具有潛在的臨床價(jià)值。