陳淑豪，劉 沖，丁來錢，何玫娟，李經(jīng)民※

（1.大連理工大學機械工程學院，遼寧大連 116024；2.大連理工大學遼寧省微納技術及系統(tǒng)重點實驗室，遼寧大連 116024）

0 引言

細胞是生命體的基本單元，細胞層面的各類研究在探尋生命規(guī)律、研究疾病病理、藥物開發(fā)及篩選等方面有不可或缺的價值[1]。細胞培養(yǎng)作為生命科學領域中最重要的研究技術，關鍵在于如何在體外構建與在體細胞生存環(huán)境相似的微環(huán)境[2-3]。已有大量研究表明細胞生存的三維微環(huán)境中各種細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、細胞之間及細胞與細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）相互粘附作用中的多種信號積極參與了調(diào)節(jié)細胞生長、分化、繁殖及凋亡等生命活動[4-5]。

近年來，微流控技術快速發(fā)展，被廣泛應用于細胞研究。微流控芯片憑借其體積小、高通量、試劑消耗少、樣本量需求小等優(yōu)越性能，可對細胞進行二維或三維培養(yǎng)[6]。相比二維環(huán)境，三維培養(yǎng)能更真實還原細胞的生長特性和行為表現(xiàn)[7]。三維細胞培養(yǎng)微流控芯片設計已成為當前的研究熱點。Benjamin等[8]設計了一種三層微流控裝置用于模擬腫瘤細胞穿過血管的過程。裝置中層的微孔parylene膜能模擬血管壁的支撐結構，并對其進行水凝膠處理為細胞提供三維生長環(huán)境。Carlos 等[9]設計的微流控裝置能對3D-ECM 水凝膠進行圖案化，通過建模分析了微器件中集成三維凝膠的微結構尺寸，并觀察了三維空間中乳腺癌細胞受巨噬細胞影響的表型。Ioannis 等[10]開發(fā)了一種基于微流控技術的構建三維血管界面的方法，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移時內(nèi)皮屏障功能。芯片中引入生物水凝膠形成三維的觀測界面。劉軍山等[11]制作并驗證了一種用于細胞三維培養(yǎng)的集成微柱陣列的微流控芯片，對微柱間距進行了優(yōu)化設計。Supriya 等[12]開發(fā)的三維細胞培養(yǎng)微流控平臺可以研究腫瘤與內(nèi)皮細胞之間的雙向串擾。綜合分析各種三維細胞培養(yǎng)微流控器件，微柱結構包裹ECM模擬材料（如鼠尾膠原），能在相鄰微空間實現(xiàn)生物化學信息交流，適用于模擬在體微環(huán)境下的細胞生長。但芯片的微結構設計對ECM 水凝膠包裹效果的影響，以及芯片設計在構建仿生三維微環(huán)境和構建用于對比的不同微環(huán)境的研究仍有待完善。

本文設計了一種可建立不同三維微環(huán)境的細胞培養(yǎng)微流控芯片。在建模仿真優(yōu)化芯片微結構設計的同時，對細胞培養(yǎng)池兩側(cè)形成的不同小分子濃度分布微環(huán)境進行了實驗驗證。所設計的芯片能為細胞與微環(huán)境相互作用機制的研究提供一個新的技術平臺。

1 芯片設計及仿真分析

1.1 芯片整體結構設計

本文設計的三維細胞培養(yǎng)微流控芯片如圖1 所示。芯片選用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）制作成型，PDMS具有良好的生物相容性和透氣性，適合作為細胞培養(yǎng)的基底材料，且其透光性好便于觀察細胞生長的狀態(tài)[2]。芯片由下層結構片和上層蓋片組成，芯片的微結構主要包括細胞培養(yǎng)池、3D-ECM 水凝膠微通道、微柱和培養(yǎng)液微通道。在細胞培養(yǎng)池兩側(cè)設計具有間隙的微柱結構，使細胞培養(yǎng)池與兩側(cè)并置凝膠通道形成連續(xù)界面，允許細胞和旁通道微空間相互作用。芯片中心微通道上串聯(lián)3 個寬度600 μm 的圓形細胞培養(yǎng)池，樣本能以高密度植入培養(yǎng)池從而增大樣本數(shù)。兩側(cè)結構呈對稱設計，向外依次為凝膠微通道和最外側(cè)培養(yǎng)液微通道，寬度均為400 μm。水凝膠可以獨立地填充至2 個凝膠微通道，封裝在局部微柱中從而建立三維環(huán)境。通過調(diào)整最外側(cè)溶液成分可調(diào)節(jié)小分子擴散下微環(huán)境狀態(tài)。此外，芯片微柱結構的形狀設計影響水凝膠封裝的性能，研究分析了不同微柱對封裝3D-ECM 水凝膠的效果從而優(yōu)化芯片設計。確定微柱為直徑150 μm 的圓形結構，間隙為50 μm；凝膠微通道寬度為400 μm，高150 μm。

圖1 微流控芯片結構示意圖

1.2 微柱結構仿真優(yōu)化

為實現(xiàn)在芯片上建立模擬在體3D-ECM 的空間環(huán)境，在芯片中引入生物水凝膠材料（如鼠尾膠原）。芯片中帶間隙的微柱結構的設計影響區(qū)域圖案化水凝膠的效果。水凝膠溶液在微柱間隙的封裝由前進界面的壓力差決定，根據(jù)Younglaplace方程（方程表明，氣液壓力差是表面張力和界面曲率的函數(shù)）可計算溶液界面壓力差[9]，如下所示：

式中：γ 為溶液的表面張力；θs為液體與側(cè)壁的前進接觸角；θv為液體與上下壁的前進接觸角；w和h分別為微通道的寬度和高度。

圖2 模擬膠原溶液注入的幾何模型

水凝膠溶液注入過程中與微柱側(cè)壁的接觸角隨著微柱形狀變化而改變，在此對梯形、六邊形、八邊形和圓形（外接圓直徑均為150 μm）微柱封裝性能進行仿真分析。由于芯片設計在高度方向結構一致，可對水凝膠注入微通道建立二維模型進行模擬仿真，圖2所示為基本的梯形模型，箭頭方向表示水凝膠溶液的入口和出口，梯形側(cè)邊AB范圍內(nèi)分析水凝膠的封裝效果。根據(jù)水凝膠注入的微通道尺寸變化的影響[9]，選定微通道寬度為400 μm。根據(jù)對微柱間隙的相關研究[11]，微柱間隙設定50 μm。用Comsol 5.3兩相流-水平集物理場，模擬膠原溶液注入具有不同微結構芯片的過程。

仿真參數(shù)設置如下：（1）膠原溶液濃度為1 mg/mL，用流變儀測得的黏度為0.036 Pa·s，用液滴形狀分析儀測得的表面張力系數(shù)為0.060 N/m；（2）選定水凝膠溶液入口，設定入口壓力1 000 Pa；選定出口，設定出口壓力為0；（3）濕潤壁接觸角設置為41°，芯片的制作工藝中采用氧等離子表面處理鍵合兩層PDMS，也對微通道親疏水性進行改性，用液滴形狀分析儀測得膠原溶液與改性后的PDMS 接觸角為41°；（4）細化網(wǎng)格，使用瞬態(tài)求解器計算水凝膠注入不同微結構的封裝效果。結果如圖3 所示，水凝膠溶液在110 ms 可注滿模型，相比梯形微柱間隙溶液已經(jīng)有溢出，圓形微柱溶液界面未越過間隙。此外圓形微柱能長時間保持溶液界面不溢出間隙，對水凝膠溶液的封裝效果最佳。

圖3 不同形狀微柱封裝效果仿真結果對比

1.3 芯片兩側(cè)構建不同微環(huán)境的仿真分析

細胞生長的微環(huán)境中，控制周圍可溶性小分子濃度梯度，對于研究生物化學信號誘導生物反應的定量關系至關重要。本文對封裝水凝膠后芯片的三維空間中小分子擴散進行三維仿真。用Comsol 5.3 仿真軟件中的多孔介質(zhì)流動物理場和稀物質(zhì)傳遞物理場耦合，對單培養(yǎng)池的模型計算分析，獲得了小分子濃度隨時間變化的分布。仿真參數(shù)設置如下：（1）外側(cè)旁通道流動類型為層流，封裝水凝膠的微通道流動類型為多孔介質(zhì)流，壁面無滑移；（2）多孔基體滲透率為2×10-9m2，孔隙率為0.98（排液法測得）；（3）外側(cè)培養(yǎng)液兩通道入口速度為2 μL/min，出口處抑制回流且出口壓力為0；（4）葡萄糖作為培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物質(zhì)，在此用葡萄糖來代表微環(huán)境中小分子物質(zhì)，兩個培養(yǎng)液微通道入口濃度分別設為50 mmol/L（高糖）和10 mmol/L（低糖），葡萄糖擴散系數(shù)為0.96×10-9m2/s（37 ℃）。

分析結果如圖4 所示。在微流控芯片中，并置微通道的連續(xù)界面上（如截線）可以生成介于外側(cè)培養(yǎng)液通道葡萄糖濃度之間的濃度梯度，如圖4（a）所示。截線處的連續(xù)界面上，葡萄糖濃度梯度隨時間發(fā)生變化，如圖4（b）所示，芯片內(nèi)2 h可以形成較穩(wěn)定的濃度分布，保證了芯片內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定性。在培養(yǎng)池兩側(cè)的水凝膠微空間中構建了兩種不同的小分子濃度刺激（圖4（b）虛線標記處），形成了兩種不同的微環(huán)境。在培養(yǎng)池中三維培養(yǎng)細胞，可在培養(yǎng)池兩側(cè)的連續(xù)界面中對比研究不同微環(huán)境下的細胞生長特性。

圖4 芯片微環(huán)境的生化因子濃度變化分析

2 實驗與結果

2.1 微流控芯片制作

該微流控芯片采用澆注成型的方法制作。制作過程：（1）利用微加工技術制作模具，模具的制作工藝流程如圖5所示；（2）澆注PDMS 溶液，80 ℃下固化2 h 后拔模；（3）用等離子體清洗機對PDMS下層結構片和上層蓋片進行氧等離子體處理，對準鍵合完成芯片制作，芯片實物如圖6所示。

圖5 芯片結構片的制作工藝流程

圖6 芯片實物圖

圖7 芯片內(nèi)水凝膠的封裝

2.2 芯片三維微環(huán)境構建驗證

2.2.1 水凝膠封裝實驗

對優(yōu)化設計的微流控芯片注入Ⅰ型膠原溶液，驗證芯片微結構的封裝性能。稀釋5 mg/mL膠原溶液為1 mg/mL，稀釋溶液為0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS），并加入0.1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至中性。使用移液槍將30 μL 膠原溶液注入微通道入口。在工具顯微鏡下實驗驗證了圓形微柱的水凝膠封裝效果最佳，將膠原溶液灌注至芯片的水凝膠微通道，5 s可注滿單個微通道，且在微柱間隙產(chǎn)生穩(wěn)定的氣液界面。水凝膠封裝在微柱區(qū)域且放置長時間不會溢出，如圖7所示，紅色染料染色水凝膠便于觀察。

2.2.2 不同三維微環(huán)境建立驗證

圖8 小分子擴散實驗平臺

為了研究芯片中細胞培養(yǎng)池兩側(cè)形成的微環(huán)境分布，對完成封裝凝膠的芯片進行小分子擴散實驗。實驗中用熒光素鈉（擴散系數(shù)0.36×10-9m2/s）模擬生化因子，與葡萄糖的擴散速度相近。利用倒置熒光顯微鏡搭建實驗平臺，如圖8所示?？刂莆⒆⑸浔眉訅和瑫r驅(qū)動芯片外側(cè)2個旁通道的熒光素溶液流動，形成穩(wěn)定的層流狀態(tài)，流速為2 μL/min。2個旁通道中以濃度比5∶1的熒光素鈉溶液進行第1組實驗，其中高濃度一側(cè)熒光素濃度為50 μmol/L。設置顯微鏡每隔5 min拍照一次，實驗記錄了兩側(cè)三維凝膠通道的熒光擴散狀態(tài)，從而進行兩側(cè)水凝膠空間微環(huán)境對比。此外，調(diào)整熒光素鈉濃度比2∶1進行第2組實驗，高濃度一側(cè)熒光素濃度為40 μmol/L。

熒光素鈉在芯片三維空間擴散如圖9所示。利用Matlab軟件對熒光圖像進行處理，表征熒光素鈉在膠原水凝膠微環(huán)境分析區(qū)域（圖9（a）標記處）的擴散情況。芯片中熒光素分子可在2.5 h擴散穩(wěn)定，形成了穩(wěn)定的濃度梯度。在同組實驗中，對稱2 個水凝膠旁通道可形成兩種不同濃度的穩(wěn)定微環(huán)境，如圖9（b）所示。第1 組實驗結果顯示，在兩側(cè)的三維基質(zhì)空間形成了差距較大的高低兩種穩(wěn)定的小分子濃度分布；第2組實驗在兩側(cè)三維基質(zhì)環(huán)境中減緩了濃度差距，也形成了不同的穩(wěn)定小分子濃度環(huán)境。這實現(xiàn)了芯片中培養(yǎng)池兩側(cè)不同小分子濃度微環(huán)境的控制。

圖9 芯片微環(huán)境內(nèi)熒光素濃度表征

3 結束語

本文設計了一種能構建不同三維微環(huán)境的細胞培養(yǎng)微流控芯片。通過建模仿真優(yōu)化了芯片結構設計，確定了圓形微柱用于封裝水凝膠，并模擬兩個三維基質(zhì)空間中的小分子擴散分布。利用微加工工藝制作芯片，并驗證了芯片封裝水凝膠構建三維微環(huán)境的效果。設計實驗驗證了芯片內(nèi)部建立擴散小分子高低兩種濃度的微環(huán)境，通過調(diào)節(jié)不同的外側(cè)培養(yǎng)液組分可控制多種穩(wěn)定微環(huán)境的形成。芯片可用于體外模擬細胞生長與微環(huán)境相互作用的各種分析研究。