王云威,王景雪
(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)
近年來(lái),隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變,我國(guó)的糖尿?。ㄓ绕涫?型糖尿?。┗疾÷食拭黠@的上升趨勢(shì),糖尿病已成為腫瘤、心血管疾病之外的又一大慢性非傳染性疾病[1]。糖尿病一般表現(xiàn)為高血糖癥狀,其病因是胰島β細(xì)胞分泌功能發(fā)生障礙,從而造成患者體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝紊亂,加大了患者心血管疾病等并發(fā)癥的發(fā)病概率[2]。古典醫(yī)書(shū)記載了對(duì)糖尿病“養(yǎng)陰生津,平衡陰陽(yáng)”的主要醫(yī)治方法[3]?,F(xiàn)代西醫(yī)主要是通過(guò)服用降糖藥物(二甲雙胍、阿卡波糖等)或注射胰島素來(lái)降低血糖治療糖尿病。
隨著人們生活質(zhì)量以及對(duì)醫(yī)療水平要求的提高,降低糖尿病治療過(guò)程的痛苦已經(jīng)成為廣大糖尿病患者的迫切訴求。因此,從中草藥中尋找高效、安全的預(yù)防和治療糖尿病天然產(chǎn)物,具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值?,F(xiàn)在已經(jīng)有大量的研究發(fā)現(xiàn),許多中草藥都有降低血糖水平的作用,其中包括生芪[4]、地黃[5]、黃連[6]、當(dāng)歸[7]、葛根[8]、鐵皮石斛等。鐵皮石斛具有的藥用價(jià)值,是一種珍貴的藥材[9],其最主要的藥用成分是石斛多糖,除此之外還含有石斛堿、黃酮和一些微量元素[10-13]。諸多研究證明鐵皮石斛多糖具有抗氧化、抗衰老和提高免疫力等藥理作用[14-16]。湯志遠(yuǎn)等證明從鐵皮石斛莖提取物中分離得到的多糖具有降血糖的作用[17]。宓文佳等證明鐵皮石斛根提取物中分離得到的多糖也具有良好的降血糖的療效[18],鐵皮石斛膏、鐵皮石斛當(dāng)歸復(fù)方提取液在2型糖尿病小鼠降糖方面也具有顯著效果[19-20]。本實(shí)驗(yàn)以鐵皮石斛多糖(Dendrobium officinale polysaccharide,DOP)為單味藥,研究其對(duì)糖尿病小鼠降糖降脂的作用,為鐵皮石斛多糖及其制劑用于治療糖尿病提供藥理學(xué)依據(jù)。
4 周齡ICR小鼠,雄性,體質(zhì)量(20±3)g,購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(晉)2015-0001;使用正常小鼠飼料飼喂小鼠,飼料購(gòu)買(mǎi)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于(24±2)℃的恒溫恒濕室內(nèi)。
鐵皮石斛由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室實(shí)驗(yàn)房種植,取其莖用于多糖提取。
鹽酸二甲雙胍片 天津太平洋制藥有限公司;胰島素 南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒 北京索萊寶公司;四氧嘧啶、戊巴比妥鈉 美國(guó)Sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
BXM-50VE型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;3K15型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司;GA-3型血糖儀 深圳三諾生物傳感股份有限公司;AR124CN型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司;LGJ-1ON型超低溫冰箱 北京亞星儀器公司。
1.3.1 糖尿病小鼠模型的建立及分組
選取體質(zhì)量(25±3)g的健康純系ICR小鼠100 只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,然后全部禁食不禁水24 h后,從中隨機(jī)選取10 只腹腔注射生理鹽水作為正常組,其余90 只小鼠按100 mg/kg mb的劑量腹腔注射四氧嘧啶溶液,每隔1 d注射一次,共注射3 次。之后正常飼喂3 d后,禁食12 h后用血糖儀進(jìn)行尾部采血統(tǒng)計(jì)血糖濃度,以空腹血糖濃度不低于11.1 mmol/L為2型糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)。
從成模小鼠中隨機(jī)選出50 只小鼠,然后隨機(jī)分成5 組,每組10 只,腹腔注射生理鹽水的作為正常對(duì)照組,苦味酸進(jìn)行標(biāo)記,分組及灌胃給藥情況如下:高劑量給藥組(DOP-H)(造模成功的糖尿病小鼠灌胃450 mg/kg mbDOP)、中劑量給藥組(DOP-M)(造模成功的糖尿病小鼠灌胃300 mg/kg mbDOP)、低劑量給藥組(DOP-L)(造模成功的糖尿病小鼠灌胃150 mg/kg mbDOP)、模型對(duì)照組(造模成功的糖尿病小鼠灌胃等量生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(造模成功的糖尿病小鼠灌胃250 mg/kg mb鹽酸二甲雙胍溶液)、正常對(duì)照組(正常飼養(yǎng)未進(jìn)行造模的小鼠灌胃等量生理鹽水)。每日早上8∶30定時(shí)給藥,灌胃時(shí)以0.1 mL/10 g mb為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行灌胃,每天一次,連續(xù)灌胃給藥4 周。
1.3.2 鐵皮石斛多糖提取率及含量測(cè)定
1.3.2.1 鐵皮石斛多糖的制備
鐵皮石斛多糖的制備按照邱現(xiàn)創(chuàng)等[21]的工藝流程制備。
1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
準(zhǔn)確稱(chēng)取400.0 mg干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖,加入適量去離子水溶解后,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容。取1 mL于50 mL的容量瓶中稀釋并定容,配成質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL和1.8 mL于干燥試管中,分別用去離子水補(bǔ)至2.0 mL,然后再加入體積分?jǐn)?shù)5%的苯酚溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)1.0 mL和5.0 mL濃硫酸。搖勻振蕩,置于室溫下20 min后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以2.0 mL去離子水按同樣量加入苯酚和濃硫酸為空白。以葡萄糖質(zhì)量濃度ρ/(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為A=13.952ρ-0.043 2(R2=0.999 1)。
1.3.2.3 鐵皮石斛多糖提取率測(cè)定
鐵皮石斛多糖提取率按式(1)計(jì)算。
1.3.2.4 鐵皮石斛多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定
本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定鐵皮石斛多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),并按式(2)計(jì)算。
式中:0.91表示多糖的校正系數(shù)。
1.3.3 鐵皮石斛多糖的分離純化及紫外光譜分析
1.3.3.1 鐵皮石斛多糖溶液蛋白質(zhì)的去除
利用Sevag法進(jìn)行鐵皮石斛多糖脫蛋白。向鐵皮石斛多糖溶液中加入Sevag試劑(氯仿和正丁醇的體積比為4∶1,多糖溶液和Sevag試劑的體積比為5∶1,磁力攪拌器攪拌40 min,4 000 r/min離心20 min除去蛋白層,重復(fù)上述操作,直到蛋白質(zhì)除盡為止。
1.3.3.2 鐵皮石斛多糖溶液脫色素
按照0.2 g/100 mL的量加入活性炭,60 ℃脫色1.5 h,除去鐵皮石斛多糖溶液中的色素。
1.3.3.3 鐵皮石斛多糖進(jìn)行纖維素凝膠樹(shù)脂DEAE-52洗脫純化
稱(chēng)取經(jīng)除蛋白、脫色后的粗多糖300 mg,然后加入10 mL的蒸餾水溶解,待溶解完全后經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾以備上樣。上樣量為300 mg/10 mL,流速為1 mL/min,先以去離子水洗脫,然后以0.1、0.2、0.3、0.5 mol/L的氯化鈉溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫,等量接收(5.0 mL/管)。用苯酚硫酸顯色法,并在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。可按吸光度將洗脫液分別收集為5 個(gè)部分(分別記為鐵皮石斛多糖洗脫l~5),并分別對(duì)其進(jìn)行減壓濃縮、凍干。對(duì)氯化鈉溶液洗脫下來(lái)的鐵皮石斛多糖洗脫1~5進(jìn)行脫鹽處理。去離子水將其分別溶解后,用透析袋以流水進(jìn)行透析48 h,再將其減壓冷凍干燥得到無(wú)鹽的鐵皮石斛多糖洗脫1~5。
1.3.4 小鼠體質(zhì)量記錄與空腹血糖濃度測(cè)定
實(shí)驗(yàn)期間每7 d記錄小鼠體質(zhì)量,統(tǒng)計(jì)小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)。分別于給藥第1、2、3、4周,各組小鼠禁食不禁水12 h后尾部取血,用血糖儀測(cè)定血糖濃度。
1.3.5 小鼠血脂指標(biāo)檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用摘除眼球法取小鼠血清,送至武漢塞維爾生物科技公司檢測(cè)胰島素、尿素氮、肌酐、糖化血清蛋白、血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity liptein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density liptein cholesterol,LDL-C)水平及T-AOC。
1.3.6 血糖-時(shí)間曲線(xiàn)下面積和胰島素敏感指數(shù)計(jì)算
整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d進(jìn)行小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn),小鼠禁食不禁水12 h后,尾靜脈采血測(cè)空腹血糖濃度,給藥15 min后,按照2 g/kg mb劑量腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的葡萄糖溶液,然后分別于30、60、120 min后尾靜脈采血測(cè)定血糖濃度。
1.3.6.1 血糖-時(shí)間曲線(xiàn)下面積計(jì)算
血糖-時(shí)間曲線(xiàn)下面積(area under curve,AUC)計(jì)算參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行,AUC按式(3)計(jì)算。
式中:BG0為0 h的血糖濃度/(mmol/L);BG1為1 h的血糖濃度/(mmol/L);BG2為2 h的血糖濃度/(mmol/L)。
1.3.6.2 胰島素抵抗指數(shù)計(jì)算
根據(jù)測(cè)定的空腹血糖和空腹胰島素含量,按式(4)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment was applied to assess the status of insulin resistance,HOMA-IR)。
在90 只小鼠建模過(guò)程中,驚厥死亡3 只,11 只小鼠空腹血糖濃度未達(dá)到成模水平,最后建模成功率為84.4%。
精確稱(chēng)取10 g鐵皮石斛粉,按照1.3.2.1節(jié)的方法進(jìn)行鐵皮石斛多糖的提取,最后得到鐵皮石斛粗多糖2.123 g,鐵皮石斛多糖的提取率為21.23%。
苯酚-硫酸法顯色后,在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定分離純化后鐵皮石斛多糖溶液的吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程A=13.952ρ-0.043 2(R2=0.999 1)計(jì)算鐵皮石斛多糖樣品的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),所得到的鐵皮石斛粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.75%。
紫外光譜分析結(jié)果如圖1所示,經(jīng)分離純化后的鐵皮石斛多糖在210 nm波長(zhǎng)附近出現(xiàn)多糖具有的特征吸收峰(最大吸收峰),且在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收峰,表明分離純化鐵皮石斛多糖中幾乎不含有核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
圖1 鐵皮石斛多糖紫外光譜分析結(jié)果Fig. 1 Ultraviolet spectroscopic analysis of Dendrobium candidum polysaccharides
表1 鐵皮石斛多糖對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響(n= 10)Table 1 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on body mass of diabetic mice (n= 10)
由表1可知,造模成功后小鼠體質(zhì)量與正常組小鼠相比體質(zhì)量減輕,經(jīng)鹽酸二甲雙胍和鐵皮石斛灌胃治療的2型糖尿病小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì),而無(wú)治療的2型糖尿病小鼠體質(zhì)量一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),未治療的2型糖尿病小鼠的體質(zhì)量明顯低于正常組小鼠以及經(jīng)鹽酸二甲雙胍和鐵皮石斛灌胃治療的2型糖尿病小鼠體質(zhì)量。
糖化血清蛋白因受環(huán)境作用較小,所以能夠穩(wěn)定地反映機(jī)體過(guò)去1~2 周內(nèi)的血糖水平[22],而空腹血糖濃度則能實(shí)時(shí)反映機(jī)體血糖水平,但易受外界環(huán)境干擾。
表2 鐵皮石斛多糖對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖濃度和糖化血清蛋白濃度的影響(n= 10)Table 2 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on fasting blood glucose and glycated serum protein in diabetic mice (n = 10)
由表2可知,與模型組小鼠相比,鐵皮石斛多糖灌胃組小鼠空腹血糖濃度和糖化血清蛋白濃度均顯著降低(P<0.05)。由表2中也可看出,鐵皮石斛多糖高劑量組與鹽酸二甲雙胍組的降糖效果基本一致。以上結(jié)果表明鐵皮石斛多糖具有明顯的降糖效果。
作為糖尿病中常見(jiàn)的并發(fā)癥——糖尿病腎病嚴(yán)重?fù)p傷了患者的腎臟,給患者帶來(lái)了極大病痛,且極易造成糖尿病患者的病亡[23-24]。已有研究證明,因糖尿病引起的早期腎臟病變可用機(jī)體的血清尿素氮和肌酐來(lái)進(jìn)行輔助診斷[25-26]。
表3 鐵皮石斛多糖對(duì)糖尿病小鼠血清尿素氮、肌酐濃度的影響(n= 10)Table 3 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on serum ureanitrogen and creatinine levels in diabetic mice (n= 10)
由表3可知,模型組小鼠的血清肌酐、尿素氮極顯著高于正常組小鼠(P<0.01)。鐵皮石斛多糖灌胃組小鼠血清肌酐、尿素氮濃度與模型組小鼠相比均顯著降低(P<0.05),且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。鐵皮石斛多糖高劑量組對(duì)2型糖尿病小鼠血清肌酐和尿素氮濃度的降低效果與鹽酸二甲雙胍效果基本一致,表明鐵皮石斛多糖能夠改善糖尿病小鼠的腎臟損傷。
表4 鐵皮石斛多糖糖尿病小鼠血脂代謝的影響(n= 10)Table 4 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on lipid metabolism in diabetic mice (n= 10)
糖尿病患者一般都患有嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝紊亂癥狀,長(zhǎng)期嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝紊亂極大地增加了冠心病并發(fā)癥的幾率,從而給患者帶來(lái)了極大的健康威脅。由表4可知,與正常組小鼠相比,模型組小鼠TC、TG、LDL-C濃度極顯著增高(P<0.01),HDL-C濃度極顯著降低(P<0.01)。鐵皮石斛多糖高劑量組對(duì)2型糖尿病小鼠血脂代謝紊亂的改善效果與鹽酸二甲雙胍的效果基本一致。以上結(jié)果表明鐵皮石斛多糖可以改善糖尿病小鼠血脂代謝異常。
表5 鐵皮石斛多糖對(duì)糖尿病小鼠糖耐量、胰島素水平和胰島素抵抗性的影響(n= 10)Table 5 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on glucose tolerance, insulin content and insulin resistance in diabetic mice (n= 10)
由表5可知,模型組給予葡萄糖前后各時(shí)間點(diǎn)的血糖濃度及AUC均極顯著高于正常組,糖耐量異常(P<0.01)。與模型組比較,灌胃4 周后,鐵皮石斛多糖高、中劑量組給予葡萄糖前后各時(shí)間點(diǎn)的血糖濃度及AUC均顯著降低(P<0.05)。表明鐵皮石斛多糖能夠改善糖尿病小鼠的糖耐量異常狀況。與正常組相比,模型組小鼠胰島素水平極顯著降低(P<0.01),而模型組小鼠胰島素抵抗性極顯著增高(P<0.01)。與模型組小鼠相比,鐵皮石斛多糖高、中劑量組小鼠的胰島素水平均顯著提高(P<0.05),而胰島素抵抗性均顯著降低(P<0.05)。鐵皮石斛多糖高劑量組對(duì)2型糖尿病小鼠胰島素含量和胰島素抵抗性的改善與鹽酸二甲雙胍的效果基本一致。以上結(jié)果表明鐵皮石斛多糖可以提高2型糖尿病小鼠胰島素水平和降低糖尿病小鼠胰島素抵抗性。
表6 鐵皮石斛多糖對(duì)糖尿病小鼠SOD、CAT活力和T-AOC的影響(n= 10)Table 6 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on SOD and CAT activity and T-AOC in diabetic mice (n= 10)
由表6可知,與正常組小鼠相比,模型組小鼠肝臟和胰腺的SOD、CAT活力和T-AOC極顯著降低(P<0.01)。與模型組小鼠相比,鐵皮石斛多糖灌胃小鼠肝臟和胰腺的SOD、CAT活力T-AOC均得到極顯著提高(P<0.01),呈現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)效應(yīng)。以上結(jié)果表明鐵皮石斛多糖可以提高糖尿病小鼠肝臟和胰腺的抗氧化水平。
當(dāng)今一些不良的飲食、作息習(xí)慣導(dǎo)致糖尿病發(fā)病率愈發(fā)大眾化和年輕化,其中2型糖尿病占到90%以上[27]。目前,對(duì)于糖尿病的治療主要是采用西藥降糖和注射胰島素的方法,長(zhǎng)期注射胰島素給患者帶來(lái)了很大的痛苦,因此開(kāi)發(fā)具有降糖降脂作用的功能型保健品,對(duì)于糖尿病的輔助治療具有重要的實(shí)踐意義。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1)鐵皮石斛多糖對(duì)2型糖尿病小鼠具有良好的降糖效果,其中鐵皮石斛多糖高劑量的降糖效果與鹽酸二甲雙胍降糖效果基本一致。這一研究結(jié)果與湯志遠(yuǎn)[17]、李秀芳[28]等研究結(jié)果一致。2)鐵皮石斛多糖對(duì)2型糖尿病小鼠的血脂代謝紊亂也具有良好的改善效果,與模型組小鼠相比,鐵皮石斛多糖高劑量組小鼠的LDL-C、TC、TG水平明顯降低,而HDL-C水平增加。張文等[29]利用猴頭菌粉多糖和李新萍等[30]利用山藥多糖灌胃糖尿病小鼠,也發(fā)現(xiàn)相應(yīng)多糖具有明顯的降脂作用。3)糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素抵抗指數(shù)評(píng)價(jià)結(jié)果表明鐵皮石斛多糖能夠提高糖尿病小鼠對(duì)葡萄糖的耐受力,增加糖尿病小鼠血清胰島素水平和降低胰島素抵抗指數(shù)。腎功能檢測(cè)結(jié)果表明高劑量的鐵皮石斛多糖能夠極顯著地降低糖尿病小鼠血清肌酐和尿素氮濃度(P<0.01),從而改善糖尿病小鼠的腎臟的損傷情況,這與穿心蓮、姜黃素對(duì)2糖尿病引起的腎臟病變具有一定的治療作用的結(jié)果基本一致[31-32]。
研究表明,氧化應(yīng)激是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能衰退的重要因素,氧化應(yīng)激導(dǎo)致活性氧和活性氮產(chǎn)生過(guò)多,其中活性氧可直接損傷β細(xì)胞[33-34]。CAT能夠降低生物體內(nèi)過(guò)氧化氫的水平,從而減少自由基和過(guò)氧化脂質(zhì)的形成。SOD能夠把有害的超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫,進(jìn)而在CAT的作用下轉(zhuǎn)化為對(duì)生物體無(wú)危害作用的水[35-36]。小鼠肝臟和胰腺抗氧化性酶活力測(cè)定結(jié)果表明,鐵皮石斛多糖能夠極顯著提高糖尿病小鼠肝臟和胰腺的SOD、CAT活力和T-AOC(P<0.01),從而增強(qiáng)清除自由基的能力和降低活性氧的產(chǎn)生,發(fā)揮抗氧化應(yīng)激,修復(fù)肝臟和胰腺氧化損傷的作用。這說(shuō)明抗氧化應(yīng)激是鐵皮石斛多糖提高胰島素含量和緩解胰島素抵抗,從而抗糖尿病的原因。?;荻Y等[37]研究表明,鐵皮石斛多糖能夠抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致的JNK信號(hào)通路激活,從而保護(hù)胰島細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)以四氧嘧啶誘導(dǎo)的ICR2型糖尿病小鼠為材料,研究了鐵皮石斛降糖降脂作用。結(jié)果表明:鐵皮石斛多糖提高糖尿病小鼠肝臟和胰腺的抗氧化能力的作用、具有良好的降糖降脂作用、增加糖尿病小鼠血清胰島素水平和降低胰島素抵抗指數(shù)、改善糖尿病小鼠的癥狀,這為鐵皮石斛多糖用于輔助治療糖尿病提供了一定的藥理學(xué)依據(jù)。