翁清清，易芳羽，郁 瑩，葛蘇鈺，張 穎

氟牙癥(dental fluorosis)是慢性氟中毒在人體內(nèi)最早出現(xiàn)的臨床表征[1]，主要表現(xiàn)為釉質(zhì)的白堊斑、著色、缺損樣改變及嚴重的磨損等，影響了許多患者的身心健康。2015年第四次全國口腔健康流行病學調(diào)查報告顯示全國12歲年齡組氟牙癥患病率為13.4%[2]，較十年前11.7%的患病率有所上升[3]。截至2017年，全國氟牙癥患病人數(shù)2 700萬余人[4]。氟牙癥病因明確，但具體的致病機制尚不明確。前期有研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的成釉細胞在過量氟刺激下存在自噬(autophagy)，能在一定程度保護細胞免受凋亡，且具有劑量依賴性[5-6]，但缺乏體內(nèi)驗證的研究報道。因此，本研究利用Wistar大鼠飲用不同濃度含氟水建立氟牙癥大鼠模型，通過腹腔注射自噬抑制劑3-MA干預(yù)大鼠自噬水平，通過檢測大鼠切牙成釉細胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和p62蛋白的表達改變和細胞凋亡水平，探索自噬在氟牙癥大鼠切牙成釉細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡Wistar大鼠48只，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(實驗動物生產(chǎn)許可證：北京SYXK(京)2016-0011)。

1.1.2 主要試劑設(shè)備 Beclin1多克隆抗體(ab207612，Abcam)，LC3B多克隆抗體(ab48394，Abcam)，p62多克隆抗體(ab56416，Abcam)，Cleaved Caspase-3 多克隆抗體(9661，CST)，3-MA(S2767，Selleck)；石蠟切片機(LEICA RM2016，德國)，石蠟包埋機(KD-BM，中國)。

1.1.3 動物模型建立 大鼠在上海實驗動物研究中心無特定病原體(SPF)級動物房飼養(yǎng)(實驗動物使用許可證：SYXK(滬)2019-0003)，適應(yīng)環(huán)境1周后，采用隨機數(shù)字法將大鼠隨機分為6組，每組8只，雌雄各半。A組：飲用常規(guī)飲用水，腹腔注射1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)；B組：飲用氟離子濃度為75 mg/L的飲用水，腹腔注射1 mL PBS；C組：飲用氟離子濃度為150 mg/L的飲用水，腹腔注射1 mL PBS；D組：飲用常規(guī)飲用水，腹腔注射10 mg/kg 3-MA；E組：飲用氟濃度為75 mg/L的飲用水，腹腔注射10 mg/kg 3-MA；F組：飲用氟濃度為150 mg/L的飲用水，腹腔注射10 mg/kg 3-MA；腹腔注射給藥每隔2 d于上午9點進行。各組大鼠自由飲水飲食，共飼養(yǎng)8周。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 大鼠飼養(yǎng)8周后二氧化碳窒息處死，切牙拍照后取雙側(cè)下頜骨置于4% 多聚甲醛中固定24 h，隨后用10% 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)脫鈣，6周后石蠟包埋切片備用。

1.2.2 大鼠切牙HE染色 常規(guī)HE染色觀察各模型組大鼠切牙成釉細胞形態(tài)改變。

1.2.3 免疫組織化學染色 大鼠下頜骨切片脫蠟復(fù)水，抗原修復(fù)，PBS浸泡10 min，3% H2O2溶液浸泡10 min，0.25% Triton X-100破膜15 min；10%山羊血清封閉30 min，一抗按說明書比例稀釋后4 ℃濕盒孵育12 h，室溫復(fù)溫1 h，PBS沖洗2 min × 3次；二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗2 min × 3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液室溫孵育，顯微鏡下控制顯色時間，待顯色合適，PBS沖洗2 min × 3次；蘇木精染液復(fù)染細胞核，分化液分化，脫水封片，于正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學分析

在高倍鏡下，每張免疫組化切片隨機選取3個視野，免疫組化陽性值定量用Image J軟件分析，得到的數(shù)據(jù)使用采用SPSS 22.0軟件包進行雙因素方差分析檢驗，P<0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況

各組大鼠生長狀態(tài)良好，行為活潑，毛色正常，體質(zhì)量增長趨勢基本一致。隨著飲水中氟離子濃度增高，大鼠切牙氟牙癥表現(xiàn)明顯，表現(xiàn)為釉面橫紋、白堊色樣改變，高氟飲水大鼠切牙出現(xiàn)明顯磨損。同時，相同飲水條件下，腹腔注射3-MA的大鼠下切牙切端磨損明顯(圖1)。

A：0 mg/L；B：75 mg/L；C：150 mg/L；D：0 mg/L + 3-MA；E：75 mg/L + 3-MA；F：150 mg/L + 3-MA圖1 大鼠切牙形態(tài)顏色的改變Fig.1 Changes of morphology and color of rat incisors

2.2 大鼠成釉細胞形態(tài)改變

大鼠切牙成釉細胞呈單層柱狀排列，細胞核遠離基膜，隨著釉質(zhì)成熟，成釉細胞高度逐漸降低，寬度變窄。飲水中氟離子濃度增高，部分細胞核靠近基膜，成釉細胞下方乳頭層細胞由正常的乳頭狀變?yōu)闂l索狀。飲用同一濃度含氟飲用水時，腹腔注射3-MA組的大鼠成釉細胞排列紊亂，原有高柱狀結(jié)構(gòu)變矮(圖2)。

A：0 mg/L；B：75 mg/L；C：150 mg/L；D：0 mg/L + 3-MA；E：75 mg/L + 3-MA；F：150 mg/L + 3-MA；Bar:250 μm圖2 HE染色顯示大鼠切牙成釉細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變( ×200)Fig.2 HE staining revealed morphological changes of rat incisor ameloblasts ( ×200)

2.3 大鼠成釉細胞中自噬相關(guān)蛋白表達水平

免疫組化檢測各組大鼠下頜骨石蠟切片中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、自噬底物蛋白p62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)的定位和表達的改變，陽性染色為細胞質(zhì)呈棕黃色。結(jié)果顯示飲用75 mg/L含氟水的大鼠成釉細胞中Beclin1表達增加(P<0.05)，LC3和p62變化不明顯。相較之下，飲用150 mg/L含氟水的大鼠成釉細胞與正常組對比，Beclin1、LC3和p62蛋白水平變化均有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)。此外，在相同飲水條件下，腹腔注射3-MA組的大鼠成釉細胞中LC3和Beclin1蛋白表達量降低，而p62蛋白表達量升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3～6)。

與飲用正常水比較，*：P<0.05；飲用相同水情況下，與腹腔注射PBS比較，#：P<0.05A：Beclin1；B：LC3；C：p62；D：Cleaved Caspase-3圖3 大鼠下切牙成釉細胞中蛋白表達的定量結(jié)果Fig.3 Quantitative results of protein expression in rat lower incisor ameloblasets

A：0 mg/L；B：75 mg/L；C：150 mg/L；D：0 mg/L + 3-MA；E：75 mg/L + 3-MA；F：150 mg/L + 3-MA;Bar:20 μm圖7 大鼠下切牙成釉細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達水平(IHC ×400)Fig.7 Immunohistochemical staining of Cleaved Caspase-3 in rat lower incisor ameloblasts(IHC ×400)

2.4 大鼠成釉細胞活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)表達水平

免疫組化結(jié)果顯示Cleaved Caspase-3在各組大鼠成釉細胞細胞質(zhì)中均有表達，在飲用150 mg/L含氟水的大鼠成釉細胞中表達明顯增高，同時，腹腔注射3-MA使成釉細胞中Cleaved Caspase-3表達增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3D，圖7)。

3 討 論

氟牙癥是在牙齒釉質(zhì)形成期，長期接受過量氟，使成釉細胞受到損害，造成釉質(zhì)發(fā)育不良[1]，氟牙癥的致病機制一直以來受廣大研究者重視[7]。成釉細胞是上皮來源的唯一能產(chǎn)生硬組織的細胞，負責調(diào)控釉質(zhì)基質(zhì)的合成、分泌、重吸收和降解，是釉質(zhì)形成的關(guān)鍵[8]。大鼠切牙唇側(cè)可持續(xù)觀察到不同時期的成釉細胞，因此本研究采用4周齡Wistar大鼠，分別通過飲水加75 mg/L和150 mg/L氟離子，喂養(yǎng)8周后，觀察到大部分大鼠出現(xiàn)了明顯的氟牙癥樣改變，提示成功復(fù)制氟牙癥大鼠模型。

自噬是細胞內(nèi)質(zhì)量控制系統(tǒng)的重要組成部分，外界刺激造成的細胞器損傷將啟動自噬途徑進行清除、降解和回收利用，對維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義[9-10]。自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和p62是自噬的常用標志物[11]，Beclin1和LC3參與了自噬體的形成，表達水平與自噬作用強度相一致。而p62作為溶酶體標志物，參與自噬降解過程，其表達水平與自噬作用強度相反。Caspase-3是參與細胞凋亡過程的重要蛋白，被上游凋亡級聯(lián)反應(yīng)激活為Cleaved Caspase-3后執(zhí)行細胞程序性凋亡[12]，因而Cleaved Caspase-3的表達水平可以反映Caspase-3的活性和細胞凋亡情況[13]。

本研究結(jié)果顯示，當飲水中氟離子添加量為75 mg/L時，大鼠切牙出現(xiàn)釉面橫紋，靠近切牙切端的成熟期成釉器組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，乳頭層呈條索狀。此時，成釉細胞自噬水平稍有增高，細胞凋亡不明顯。繼續(xù)加大飲水中氟離子劑量(150 mg/L)時，大鼠切牙出現(xiàn)明顯磨損，較多成釉細胞細胞核偏向基膜。成釉細胞中Beclin1、LC3和Cleaved Caspase-3表達增加，p62表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義，提示細胞自噬水平和凋亡水平明顯增高。研究顯示，隨著飲水中氟離子濃度增高，大鼠成釉細胞自噬水平逐漸增高[5]，引起成釉細胞損傷呈劑量依賴性[14]，與本研究結(jié)果一致。自噬和凋亡是重要的細胞內(nèi)物質(zhì)周轉(zhuǎn)機制，兩者之間的相互作用關(guān)系可總結(jié)為[15]：①自噬與凋亡相互獨立；②自噬抑制凋亡保護細胞；③在低劑量刺激下自噬抵抗凋亡保護細胞，過量的刺激下凋亡誘導(dǎo)自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘詸C制。到目前為止，尚不能判斷氟刺激下大鼠成釉細胞中自噬和凋亡的關(guān)系。

在氟牙癥相關(guān)的研究中，僅有少量文獻報道自噬在過量氟刺激下成釉細胞中的表達水平及作用[5-6,14,16]。為了研究自噬和凋亡之間的作用關(guān)系，本研究采用腹腔注射3-MA的方法，在氟牙癥動物模型上抑制自噬，探索抑制自噬對成釉細胞凋亡的影響。3-MA是一種選擇性PI3K抑制劑，作用于Vps34和PI3Kγ，可以阻斷自噬體形成，是一種常用的自噬抑制劑[11]。3-MA給藥頻率、劑量和方式與實驗設(shè)計相關(guān)，目前尚無統(tǒng)一的給藥標準。本研究結(jié)合文獻[17-19]，選用每隔2 d腹腔注射10 mg/kg 3-MA的方式，持續(xù)給藥8周。結(jié)果顯示，3-MA作用后大鼠成釉細胞中表達Beclin1和LC3降低，p62表達增高，提示3-MA抑制了大鼠成釉細胞自噬水平。與此同時，自噬抑制使成釉細胞中Cleaved Caspase-3表達明顯增高，細胞凋亡增加，與文獻結(jié)果一致[16]，提示自噬在一定程度上可以抑制凋亡保護成釉細胞。近來，自噬功能障礙加重氟化物引起的細胞毒性作用也得到了證實[20-21]。

2014年，Suzuki的研究第一次從細胞應(yīng)激的角度初步探討了氟作用下成釉細胞自噬途徑的存在，提出了氟化物刺激沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)并啟動自噬以保護細胞免受氟化物暴露的傷害[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，過量氟引起大鼠成釉細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[22-23]，進而使細胞中產(chǎn)生大量錯誤折疊的蛋白及一些受損的細胞器[24]。這些異常大分子和受損細胞器可以通過自噬途徑進行清除，進而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，避免細胞損傷或死亡。然而，自噬在口腔疾病中通常具有雙刃劍的作用[25]，任何過度的自噬活動會對細胞造成一定程度的損傷，甚至引起細胞凋亡和死亡[26]。本研究證實自噬可以抵抗凋亡從而保護細胞，但尚不能明確過量的氟刺激下是否誘導(dǎo)自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘詸C制。

綜上，氟牙癥大鼠成釉細胞中存在自噬，且高濃度氟刺激對自噬的誘導(dǎo)作用加強。自噬通過某種途徑抵抗細胞凋亡，在一定程度上保護成釉細胞免受損傷。本研究為探索氟牙癥的發(fā)病機制和對氟牙癥的預(yù)防及干預(yù)提出了一種新的思路，對于氟化物刺激下成釉細胞自噬和凋亡之間的關(guān)系，以及自噬具體通過什么途徑減少大鼠成釉細胞凋亡仍需進一步研究。