陳夕軍 唐 滔 李麗麗 陳 宸 陳煜文 張亞芳 左示敏

水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族OsPGIP結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)特征分析

陳夕軍1,2,*唐 滔1李麗麗1陳 宸1陳煜文1張亞芳2左示敏2

1揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院, 江蘇揚(yáng)州 225009;2江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 教育部功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 揚(yáng)州大學(xué), 江蘇揚(yáng)州 225009

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein, PGIP)可特異性識(shí)別病原菌PG (polygalacturonase), 從而提高植物的抗病能力。研究表明水稻中共存在7個(gè)基因, 為明確OsPGIP家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)特征, 從水稻cDNA中擴(kuò)增各基因序列, 經(jīng)克隆、測(cè)序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬, 并測(cè)定其在生物逆境與非生物逆境脅迫下的表達(dá)量變化。經(jīng)多序列比較與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn), 相同或相近物種PGIP往往具有較高的相似性, 雖然多數(shù)OsPGIP親緣關(guān)系較近, 但它們并不能完全聚類在一起。7個(gè)OsPGIP蛋白均具有一個(gè)信號(hào)肽和9~11個(gè)LRR片段, 各LRR片段中均含有PGIP的特征結(jié)構(gòu)域xxLxLxx。二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊和隨機(jī)卷曲組成, 且多以隨機(jī)卷曲為主, 這些二級(jí)結(jié)構(gòu)以重復(fù)的隨機(jī)卷曲—α-螺旋—隨機(jī)卷曲—β-折疊組成線圈狀結(jié)構(gòu), 并按右手螺旋規(guī)則形成一個(gè)特定的凹面, 負(fù)責(zé)OsPGIP與有害生物PG的互作。7個(gè)OsPGIP蛋白多較穩(wěn)定, 且均為疏水蛋白、脂溶性好、具有跨膜結(jié)構(gòu)、定位于細(xì)胞外、有1到多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、在大腸桿菌中原核表達(dá)后基本不溶。經(jīng)生物和非生物逆境處理后, 水稻中不同基因的表達(dá)量上下調(diào)差異較大, 但表達(dá)量總和明顯上調(diào), 說(shuō)明在逆境條件下水稻可通過(guò)調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)量, 從而提高其抗逆性。

表達(dá)特征; 蛋白結(jié)構(gòu); 分析; 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白; 水稻

果膠和纖維素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁骨架的基本物質(zhì), 也是病原菌侵入寄主的首道屏障。在病原菌侵入寄主過(guò)程中, PG是其產(chǎn)生的第一個(gè)胞壁降解酶[1]。PGIP是植物細(xì)胞壁的重要組成部分, 除了可以與胞壁果膠形成復(fù)合物加固細(xì)胞壁外, 還能特異性結(jié)合病菌PG, 減輕PG對(duì)寄主細(xì)胞的破壞作用, 幫助寄主維護(hù)細(xì)胞的完整性, 從而阻礙病菌侵入, 降低病害嚴(yán)重度[2-3]。同時(shí), 由于病原菌PG活性被抑制, 其進(jìn)一步分解果膠裂解產(chǎn)物寡聚半乳糖醛酸苷(oligalacutronides, OG)的能力下降, 從而引起OG在寄主體內(nèi)富集, 這些具有激發(fā)子活性的OG又可激活寄主的防衛(wèi)反應(yīng), 進(jìn)一步提高寄主抗病性[4-7]。

要明確某個(gè)PGIP對(duì)病菌PG活性的抑制作用, 最直接的方法是用純化的PGIP蛋白進(jìn)行測(cè)定, 但以往研究多為從植物組織中提取PGIP, 這些蛋白可能包含著多個(gè)高度相似的PGIP異構(gòu)體, 所得結(jié)果也是這些PGIP共同的作用, 而不是單個(gè)個(gè)體[8]。因此, 要研究某一個(gè)PGIP的作用, 利用外源表達(dá)的方法獲得純PGIP蛋白是較好的途徑。但至目前為止, 已克隆的170個(gè)基因中僅有少數(shù)基因被研究, 因?yàn)樵谠S多表達(dá)系統(tǒng)中基因不能表達(dá), 或形成包涵體, 或表達(dá)條件要求苛刻, 或表達(dá)產(chǎn)物根本沒(méi)有活性[9-12]。因此, 在研究這些PGIP之前, 對(duì)其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè), 為進(jìn)一步研究提供理論支持非常重要。

在植物體中,基因多以家族形式存在, 雖然這些基因在遺傳上具有高度的相似性, 但其應(yīng)對(duì)不同病原物或其他逆境因子時(shí), 表達(dá)水平有顯著差異; 即使是相同的基因, 在植物生長(zhǎng)的不同發(fā)育階段, 其表達(dá)量亦有不同[13-15]。如菜豆中有4個(gè), 在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中, 僅在所有組織中表達(dá), 而和只在根部微弱表達(dá),則在幼葉、下胚軸、根和豆莢中均不表達(dá)[16]。在受到病菌侵染和機(jī)械損傷等逆境或OG、水楊酸和植物激素等具有誘導(dǎo)作用的因子處理后, 多個(gè)基因均有不同的應(yīng)答, 只有在所有處理?xiàng)l件下表達(dá)量均無(wú)明顯變化[17-18]。據(jù)目前已有報(bào)道, 水稻中共存在7個(gè)基因[19-21]。Lu等[19]研究發(fā)現(xiàn), 在粳稻品種中花11中, 7個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)順式調(diào)控元件組成多樣, 其對(duì)各種植物激素處理的反應(yīng)也各不相同。為了更加明確各基因的表達(dá)特征, 本研究選用抗、感紋枯病水稻品種并通過(guò)低溫、遮光和接種病原菌等逆境處理, 以研究不同條件下各基因的表達(dá)水平, 為進(jìn)一步將這些基因應(yīng)用于水稻抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株: 水稻紋枯病菌YN-7, 由本實(shí)驗(yàn)室分離自江蘇水稻紋枯病病株。供試水稻: YSBR1 (抗)、徐稻3號(hào)(中感)和Lemont (高感)均由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻抗病分子遺傳與育種研究組提供。

1.2 OsPGIP基因的克隆與測(cè)序

水稻基因組DNA提取參照Khanuja等[22]的方法。RNA提取采用賽默飛世爾科技公司(中國(guó))植物RNA提取試劑盒, 反轉(zhuǎn)錄cDNA使用天根生化科技(北京)有限公司FastKing RT試劑盒。根據(jù)NCBI和參考文獻(xiàn)中各基因相關(guān)序列, 使用Primer V5.0軟件設(shè)計(jì)本研究所需引物(表1)。所有引物由寶生物工程有限公司(大連TaKaRa公司)合成。分別以水稻基因組DNA和cDNA為底物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物連接至克隆載體pMD19-T, 陽(yáng)性克隆子送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

以“Polygalacturonase inhibiting protein”為關(guān)鍵詞從NCBI中搜索相關(guān)蛋白序列, 去除非PGIP或未明確釋意為PGIP的序列, 將這些序列與本實(shí)驗(yàn)中克隆基因的翻譯產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

表1 擴(kuò)增各OsPGIP基因所用引物

1.4 OsPGIP結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析與信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析分別使用網(wǎng)站(https://www.predictprotein.org/)和(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行在線分析, 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用網(wǎng)站(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)和(http://www. ch.embnet.org/software/COILS_form.htm)在線服務(wù), 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)則分別使用網(wǎng)站(http://swissmodel. expasy.org/)的SWISS-MODEL、(http://www.cbs.dtu. dk/services/)的CPHmodels和(http://scratch.proteomics. ics. uci.edu/)的SCRATCH等軟件。所有三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果均經(jīng)網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/assess)進(jìn)行修改和評(píng)價(jià), 然后用PyMOL V2.3軟件進(jìn)行圖像處理。

1.5 OsPGIP性質(zhì)與功能預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性、脂溶性、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、N-糖基化位點(diǎn)以及大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的溶解性等性質(zhì)與功能分別通過(guò)網(wǎng)站(https://www.expasy.org/proteomics)、(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、(https:// embnet.vital-it.ch/cgi-bin/TMPRED_form_parser)和(http://www.biotech.ou.edu/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。OsPGIP與RsPG的蛋白對(duì)接則由網(wǎng)站(https://cluspro.bu.edu/ login.php?redir=/home.php)進(jìn)行模擬, 選擇結(jié)合自由能最低的對(duì)接模型進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.6 水稻苗處理與組織取樣

不同生育期取樣: 選擇正常育苗的抗、感紋枯病水稻品種YSBR1、徐稻3號(hào)和Lemont不同生育期 (四至五葉期、成株期和穗期)的植株, 取中部葉鞘組織。

遮光處理: 取各品種水稻種子經(jīng)浸種、催芽后, 選取芽長(zhǎng)較一致的種子置于平鋪在培養(yǎng)皿(150 mm)底部的濕紗布上, 26℃光照培養(yǎng)箱中光暗交替(14 h/10 h)培養(yǎng)14 d后, 遮光黑暗條件下培養(yǎng)至水稻五到六葉期, 取植株中部葉鞘組織, 以正常生長(zhǎng)條件下的苗為對(duì)照。

低溫處理: 將上述培養(yǎng)14 d的水稻苗4℃低溫條件下培養(yǎng)4 d, 取植株中部葉鞘組織, 以正常光暗條件下生長(zhǎng)苗為對(duì)照。

病原菌接種處理: 用滅菌牙簽接種的方法[40], 接種紋枯病菌至水稻葉鞘中, 以不接菌作對(duì)照, 48 h后取植株中部葉鞘組織。

以上組織取樣后立即置于液氮中, –80℃保存, 用于植物總RNA提取。

1.7 qRT-PCR分析

提取各水稻組織樣品總RNA, 反轉(zhuǎn)錄成cDNA后, 采用CFX96 Real-time檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行檢測(cè)。20 μL反應(yīng)體系: AceQqPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 0.4 μL、ROX Reference Dye 1 0.4 μL、模板cDNA 2 μL、ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)過(guò)程如下: 95℃ 5 min; 95℃15 s, 60℃ 20 s, 40個(gè)循環(huán); 95℃ 15 s。以(NCBI序列號(hào)為X16280)為內(nèi)參基因, 擴(kuò)增引物為- F/-R (5′-CAGCATGAAGATCAAGGTGG-3′ / 5′-TTCCTGTGCACAATGGATGG-3′), 擴(kuò)增各基因的引物序列參見(jiàn)文獻(xiàn)[19]。每個(gè)樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù), 每實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 12.05軟件進(jìn)行方差分析, 以Tukey測(cè)驗(yàn)進(jìn)行多重比較, 當(dāng)<0.05時(shí), 則表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPGIP系統(tǒng)進(jìn)化分析

從水稻cDNA中擴(kuò)增出7個(gè)基因序列并送上海生工生物工程有限公司測(cè)序, 經(jīng)NCBI比對(duì)確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物序列正確。以“Polygalacturonase inhibiting protein”為關(guān)鍵詞從NCBI網(wǎng)站中共搜索到蛋白序列333條, 其中明確注明物種來(lái)源并釋意為PGIP的共258條。將這些蛋白序列與各OsPGIP一起經(jīng)多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 大多數(shù)相同或相近物種的PGIP相似性較高, 聚集在1到2個(gè)分支(群)內(nèi), 如十字花科、豆科、禾本科等植物的PGIP (圖1-A);但在這些聚集群中也有例外, 如歸為其他類的螺旋貍藻PGIP (NCBI序列號(hào)為EPS70789)與水稻的幾個(gè)PGIP序列高度相似, 而辣椒的PGIP (NCBI序列號(hào)為AEX34755)與豆科PGIP歸在一起; 同樣, 來(lái)源于水稻的7個(gè)OsPGIP除OsPGIP2、OsPGIP4、OsPGIP6和OsPGIP7序列相似性較高, 被聚在同一分枝, 其他幾個(gè)OsPGIP分別位于進(jìn)化樹(shù)不同的分枝(圖1-B)。這些分析結(jié)果表明, 盡管同一物種中的PGIP可能是源自1個(gè)或少數(shù)幾個(gè)經(jīng)編碼子重排、點(diǎn)突變、小片段插入或缺失的基因編碼的產(chǎn)物, 但不同物種中的PGIP也有可能源自同一祖先。

2.2 OsPGIP空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

一級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明, 7個(gè)基因可分別編碼含有309~380個(gè)氨基酸的OsPGIP蛋白, 每個(gè)蛋白均含有一個(gè)信號(hào)肽, 長(zhǎng)度在17~31個(gè)氨基酸; 除信號(hào)肽外, 各OsPGP還具有N-端、9~11個(gè)LRR (Leucine-rich repeat)片段和C-端等典型的PGIP結(jié)構(gòu)域; 在這些LRR片段中, 均存在保守的xxLxLxx序列, L為亮氨酸或脂肪族氨基酸殘基, x為任意氨基酸(圖2)。OsPGIP的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和隨機(jī)卷曲組成, 且多以隨機(jī)卷曲為主; OsPGIP的N-端和C-端分別有8~13個(gè)半胱氨酸, 可形成3~5個(gè)二硫鍵, 這些二硫鍵對(duì)穩(wěn)定OsPGIP的特定空間結(jié)構(gòu)起重要作用(表2)。

圖1 OsPGIP和其他物種來(lái)源的PGIP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖中除OsPGIP為名稱縮寫外, 其他均為對(duì)應(yīng)PGIP的NCBI序列號(hào)。A: 總進(jìn)化樹(shù); B: 子樹(shù)。

OsPGIPs is the abbreviations of polygalacturonase-inhibiting protein from, the others are the NCBI accession numbers of the corresponding sequences. A: phylogenetic tree; B: subtree.

圖2 7個(gè)OsPGIP一級(jí)結(jié)構(gòu)

表2 OsPGIP二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

利用同源建模的方法預(yù)測(cè)OsPGIP的三級(jí)結(jié)構(gòu), 結(jié)果表明, 利用SWISS-MODEL和CPHmodels預(yù)測(cè)的所有OsPGIP的三維空間結(jié)構(gòu)均比較相似, 它們由多個(gè)隨機(jī)卷曲–a-螺旋–隨機(jī)卷曲–β-折疊區(qū)組成的線圈狀結(jié)構(gòu)按右手螺旋規(guī)則形成一個(gè)特定的凹面(圖3-A)。但不同預(yù)測(cè)軟件得到的同一OsPGIP三維空間結(jié)構(gòu)并不完全相同, 有的甚至差異較大, 特別是SCRATCH的模擬結(jié)果與其他兩種方法所得結(jié)果幾乎完全不同。分別以SWISS-MODEL和CPHmodels模擬OsPGIP6的空間結(jié)構(gòu), 結(jié)果顯示, 盡管它們參與預(yù)測(cè)的氨基酸數(shù)(34~369、39~354)、氨基酸覆蓋率(88.4%、83.2%)及與模板的相似性(30.1%、33.6%)差異均不大, 但其預(yù)測(cè)結(jié)果仍有差異, 以兩種方法預(yù)測(cè)的OsPGIP6空間結(jié)構(gòu)中, 其LRR區(qū)分別存在13個(gè)和10個(gè)β-折疊, 而以SCRATCH模擬的則無(wú)典型的PGIP空間結(jié)構(gòu)特征, LRR區(qū)亦不存在β-折疊; 同樣的方法應(yīng)用于預(yù)測(cè)OsPGIP7的空間結(jié)構(gòu)得到的結(jié)果相似(圖3-B)。以上述3種方式模擬的OsPGIP7結(jié)構(gòu)與水稻紋枯病菌的RsPG2進(jìn)行蛋白質(zhì)對(duì)接發(fā)現(xiàn), 盡管獲得的對(duì)接示意圖并不完全一致, 但均顯示為OsPGIP7的凹面與RsPG2的裂隙區(qū)部位進(jìn)行緊密結(jié)合, 說(shuō)明該部位是兩者的互作區(qū)域, 這與我們前期研究OsPGIP1、OsPGIP2與RsPG1對(duì)接的結(jié)果不一致[12], 說(shuō)明不同PGIP與不同PG的互作方式是多種多樣的(圖3-C)。

圖3 OsPGIP蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)模擬圖

卡通圖中紅色、黃色和綠色分別表示α-螺旋、β-折疊和隨機(jī)卷曲。A: 具有典型PGIP空間結(jié)構(gòu)的各OsPGIP3D模型; B: 分別采用SWISS-MODEL、CPHmodels和SCRATCH方法模擬的OsPGIP6和OsPGIP7空間結(jié)構(gòu)模型; C: OsPGIP7與RsPG2的蛋白分子對(duì)接, 網(wǎng)眼圖為OsPGIP7, 卡通圖為RsPG2。

Red, yellow, and green in the cartoon figures mean α-helix, β-sheet, and random coil, respectively. A: 3D structure of OsPGIPs with typical spatial structure of PGIP. B: 3D structures of OsPGIP6 and OsPGIP7 constructed with homologous modeling methods of SWISS-MODEL, CPH model and SCRATCH. C: Protein docking of OsPGIP7 and RsPG2. Mesh and cartoon figures mean OsPGIP7 and RsPG2, respectively.

2.3 OsPGIP性質(zhì)與功能預(yù)測(cè)

根據(jù)前人報(bào)道, 7個(gè)OsPGIP的編碼基因分別位于3條染色體上, 其中~位于水稻5號(hào)染色體,和位于8號(hào)染色體, OsPGIP7位于9號(hào)染色體[19-21]。經(jīng)預(yù)測(cè), 7個(gè)OsPGIP的分子量均在35 kD左右(32.75~38.79 kD), 等電點(diǎn)為4.73~8.37。其中, 已報(bào)道能抑制病菌PG活性或過(guò)表達(dá)能提高植物抗性的OsPGIP1、OsPGIP4和OsFOR1[20,23-24]其等電點(diǎn)均近中性或偏堿性。預(yù)測(cè)的表達(dá)產(chǎn)物除OsPGIP2不穩(wěn)定外, 其他均穩(wěn)定; 而且所有預(yù)測(cè)蛋白均為疏水蛋白、脂溶性好、具有跨膜結(jié)構(gòu)、定位于細(xì)胞外, 且均存在1到多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。另外, 這些蛋白在大腸桿菌中原核表達(dá)后均溶解度極低或完全不溶(表3)。

表3 在線軟件預(yù)測(cè)的OsPGIP蛋白性質(zhì)與功能

N-glycosylation sites: OsPGIP180NLTG,191NTTQ,206NLTG,271NVSY; OsPGIP289NLTG,100NLTH,149NLTS,176NLSA,181NLSR,216NLSG,295NLTN,303NVSY; OsPGIP385NITG,122NISG,209NLTG,291NMTD,299NVSY; OsPGIP450NASY,96NVTG,220NLSG,310NVSY; OsFOR1131NVSG; OsPGIP6293NLSR; OsPGIP73NATV,126NLSL,299NVSD.

2.4 OsPGIP基因的表達(dá)特征

分別取不同生育期抗、感和高感紋枯病水稻品種YSBR1、徐稻3號(hào)和Lemont的葉鞘組織, 提取總RNA, qRT-PCR檢測(cè)各基因的表達(dá)量。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明, 苗期各基因均以在抗性品種YSBR1中表達(dá)量最高, 而成株期和穗期則各基因表達(dá)規(guī)律不明顯。但相較于其他基因,和在成株期水稻葉鞘中表達(dá)量較高, 而、和則在穗期葉鞘中表達(dá)量較高; 以基因的總表達(dá)量來(lái)比較, 則以高感品種Lemont最高(圖4)。此結(jié)果與作者前期研究基因表達(dá)特征時(shí)的結(jié)果亦不一致[25]。

分別以接種水稻紋枯病菌、低溫和遮光處理等造成生物逆境和非生物逆境, 檢測(cè)各基因在不同逆境條件下在不同水稻品種植株葉鞘中的表達(dá)水平。結(jié)果表明, 在低溫條件下, 高感品種Lemont中的、基因和抗性品種YSBR1中的基因的表達(dá)量均明顯下調(diào), 其他各品種中的所有基因均上調(diào)表達(dá), 以YSBR1中的和基因表達(dá)量最高(相對(duì)表達(dá)量分別為8.55和14.53), 且各基因的總體平均上調(diào)倍數(shù)以抗性品種YSBR1中的為最大; 遮光處理后, 除基因在Lemont和徐稻3號(hào)中表達(dá)量無(wú)明顯變化外(相對(duì)表達(dá)量分別為0.97和1.10), 其他各基因在各品種中均顯著上調(diào)表達(dá), 尤以抗性品種YSBR1中的表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)最大, 平均為9.09,的表達(dá)量是對(duì)照的18.11倍; 接種紋枯病菌后, 不同基因的表達(dá)水平亦有上調(diào)或下調(diào), 但總體相比對(duì)照來(lái)說(shuō), 有明顯上調(diào)趨勢(shì), 特別是基因和基因, 最高上調(diào)倍數(shù)為9.53和6.66。這些結(jié)果與作者前期研究基因表達(dá)特征的結(jié)果一致, 即在逆境條件下大多數(shù)基因可通過(guò)提高自身的表達(dá)水平來(lái)幫助植物增加抗逆性。

3 討論

PGIP作為植物細(xì)胞壁的重要組成部分, 其編碼基因并不存在大規(guī)模的擴(kuò)張, 只是少數(shù)幾個(gè)或十幾個(gè)基因以家族的形式存在, 一般為2~16個(gè)[26-28]。在這些基因中, 除擬南芥2個(gè)基因外, 其他均未見(jiàn)有內(nèi)含子的報(bào)道, 但他們可因轉(zhuǎn)座子的插入而導(dǎo)致基因失活[26,28]。水稻中目前共存在7個(gè)基因, 經(jīng)對(duì)DNA和cDNA測(cè)序后發(fā)現(xiàn), 7個(gè)基因均無(wú)內(nèi)含子, 也不存在轉(zhuǎn)座子插入現(xiàn)象。盡管在這7個(gè)OsPGIP中, 有些相似度較高或與其他禾本科植物PGIP在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析時(shí)歸于同一群組, 但有些OsPGIP的遺傳差異較大, 可能來(lái)自于不同的祖先基因。Liu等[10]曾對(duì)水稻PGIP與其他植物來(lái)源的PGIP做過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析, 認(rèn)為所有禾本科、豆科、十字花科和林木果樹(shù)可各自被單獨(dú)歸為一組, 水稻中的7個(gè)OsPGIP與小麥、玉米、高粱等的PGIP高度相似。但上述研究?jī)H選用了來(lái)自少數(shù)幾個(gè)物種來(lái)源的51個(gè)PGIP, 如十字花科僅選擇了油菜和擬南芥, 豆科也僅選擇了大豆和同屬不同種的兩種菜豆。當(dāng)將樣本量放大, 對(duì)NCBI中所有明確釋意為PGIP的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析時(shí), 我們發(fā)現(xiàn), 盡管相同或相近物種來(lái)源的PGIP有歸為一類的趨勢(shì), 但亦有少數(shù)PGIP與其他物種的PGIP反而有著更高的相似性。這些結(jié)果說(shuō)明, 即使是相同或相近物種的PGIP也有可能是來(lái)自不同的祖先, 而不同物種中的PGIP亦有來(lái)自共同祖先的可能性, 盡管這一比例相對(duì)較小。

圖4 不同生育期抗、感紋枯病水稻品種葉鞘中各OsPGIP基因的表達(dá)量

A: 苗期; B: 成株期; C: 穗期。A: seedling stage; B: adult-plant stage; C: spike stage.

植物細(xì)胞壁是高度動(dòng)態(tài)的胞外結(jié)構(gòu), 在植物生長(zhǎng)發(fā)育與受到逆境脅迫時(shí), 其可不斷被重構(gòu), 作為細(xì)胞壁的一部分, PGIP被向胞外分泌的能力與其N-端和LRR區(qū)有關(guān)[29]。而多個(gè)LRR片段構(gòu)成的凹面, 帶有大量的負(fù)電荷, 負(fù)責(zé)著與病菌PG的互作[30-32]。但不同物種PGIP、甚至同一物種的不同PGIP對(duì)不同病原菌或同一病原菌不同PG的抑制能力差異較大, 除因互作方式多樣(如競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和混合型等) 外, 蛋白質(zhì)本身氨基酸序列、折疊方式、表面電荷和空間結(jié)構(gòu)等都對(duì)互作亦有影響[11,33-35]。只是至目前為止, 由于對(duì)PGIP晶體結(jié)構(gòu)的研究還非常少, 關(guān)于PGIP-PG互作的晶體結(jié)構(gòu)模型更是還未見(jiàn)報(bào)道, 因此對(duì)于PGIP功能及其與PG互作的研究多還停留在借助生物信息學(xué)分析的結(jié)果上。目前進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的在線軟件很多, 如SWISS- MODEL、CHPmodels、SCRATCH、Modeller、3D-JIGSAW、EsyPred3D、RaptorX、Hhpred等。盡管不同方法預(yù)測(cè)的結(jié)果并不完全相同, 如利用酰胺交換質(zhì)譜法和小角度X衍射法預(yù)測(cè)PvPGIP2與FpPG的互作時(shí), 兩種方法得到的結(jié)果分別是PvPGIP2的凹面與FvPG的N-端外側(cè)的β-折疊區(qū)或C-端及活性裂隙區(qū)互作, 但這些結(jié)果可以通過(guò)單氨基酸的定點(diǎn)突變加以驗(yàn)證[31,36-37]。所以, 進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、功能、性質(zhì), 以及配體與配基間的對(duì)接預(yù)測(cè)分析等是研究蛋白功能及互作機(jī)制的基礎(chǔ), 只是在預(yù)測(cè)分析時(shí)要進(jìn)行多種方法的比較, 并對(duì)預(yù)測(cè)模型加以修飾和評(píng)價(jià)。如本研究中分別采用SWISS-MODEL、CHPmodels和SCRATCH在線軟件預(yù)測(cè)了OsPGIP的空間結(jié)構(gòu), SCRATCH預(yù)測(cè)的模型顯然不符合研究者對(duì)植物PGIP空間結(jié)構(gòu)的認(rèn)知, 因此也不宜用之來(lái)進(jìn)一步研究OsPGIP的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能及與PG的互作等。

圖5 不同逆境條件下抗、感紋枯病水稻品種葉鞘中各OsPGIP基因的表達(dá)量

A: 低溫; B: 遮光; C: 接種。A: low temperature; B: dark; C: inoculation.

基因除可以組成型表達(dá)以外, 還可以受到多種外源因素的誘導(dǎo)表達(dá), 如植物激素、機(jī)械損傷、生物和非生物逆境等。菜豆中的4個(gè)基因分布在其B2連鎖群一個(gè)50 kb的區(qū)間內(nèi), 這些基因在核苷酸水平上的相似性大于80%, 說(shuō)明其來(lái)源于共同的祖先基因, 但它們的表達(dá)卻差異極大, 如在幼葉、下胚軸、根和莢中基因均不表達(dá), 而卻在所有器官中表達(dá),和則只在根中微量表達(dá)[16,18]。受病原菌侵染后, 病菌與寄主的親和性互作和非親和性互作則會(huì)分別導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物提早或延遲在寄主特定部位局部積累[16,38-39]?；颐共【那秩究梢饠M南芥中兩個(gè)基因上調(diào)表達(dá), 但卻是通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[26]。這些結(jié)果均表明, 植物中基因的表達(dá)水平受其自身生育期、部位和諸多外源環(huán)境的影響。水稻中的7個(gè)基因在不同組織器官中的表達(dá)水平亦不同; 在赤霉素、激動(dòng)素和萘乙酸處理后, 秈稻品種明恢63中除基因在激動(dòng)素處理后表達(dá)量下調(diào)外, 其他基因的表達(dá)量均略有上調(diào); 而在粳稻品種中花11中, 使用脫落酸、蕓薹素內(nèi)酯、赤霉素、生長(zhǎng)素、激動(dòng)素、茉莉酸和水楊酸處理后, 隨著時(shí)間的推移, 絕大多數(shù)基因的表達(dá)量均有上調(diào)[19]。除不同類型水稻外, 本研究發(fā)現(xiàn), 對(duì)紋枯病具不同抗性的水稻品種在遇到生物與非生物逆境時(shí), 其體內(nèi)基因的表達(dá)亦是有顯著差異的。如果能研明這些基因的表達(dá)調(diào)控及與病原菌PG互作的機(jī)制, 將為其在水稻抗病育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

克隆了水稻基因家族除外的剩余6個(gè)基因, 對(duì)它們進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析, 預(yù)測(cè)了其編碼產(chǎn)物的一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能, 分析了各基因在水稻不同生育期和逆境下的表達(dá)特征, 為揭示基因家族不同成員在不同逆境條件下的潛在功能和在水稻抗病育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Analysis on the structures of polygalacturonase-inhibiting proteins and the expression profile of its encoding genes in rice

CHEN Xi-Jun1,2,*, TANG Tao1, LI Li-Li1, CHEN Chen1, CHEN Yu-Wen1, ZHANG Ya-Fang2, and ZUO Shi-Min2

1Horticultrue and Plant Protection College, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;2Key Laboratory of Crop Genetics and Physio-logy of Jiangsu Province / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education / College of Agriculture, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Polygalacturonase-inhibiting protein, the extracellular leucine-rich repeat protein, specially recognizing and inhibiting polygalacturonase (PG) from pathogenic organism, can improve the resistance of plant against the pathogen. In order to clarify the structures of OsPGIPs and the expression profile of its encoding genes in rice, seven(polygalacturonase-inhibiting protein) genes were amplified from rice cDNA by PCR. Bioinformatics analysis and structural prediction of OsPGIPs were performed and expression profile of its encoding genes under biotic and abiotic stresses was determined after these genes being cloned and sequenced. The results showed that PGIPs from the same or similar species had high similarity. Through multi-sequence alignment and phylogenetic analysis, it was found that most OsPGIPs had closer genetic relationship, but all of them could not be grouped in one group. All OsPGIPs had a signal peptide and 9 to11 LRR fragments included the typical PGIP’s motif of xxLxLxx. Secondary structure prediction indicated that all OsPGIPs consist of ɑ-helix (H), extended strand (ES) and random coil (RC), which construct repeated RC-H-RC-ES- and form a typical concave coinciding with the right-hand helix rule. The concave might be responsible for the interaction between OsPGIPs and PGs from different agents. Most of the seven OsPGIPs were stable, and they all were hydrophobic proteins, good lipid solubility, with transmembrane structure, extrcellular loca-lization, one or more N-glycosylation sites, and basically insoluble after expression in. After being treated with biotic and abiotic stress factors, the expression levels of differentgenes in rice were significantly up-regulated or down-regulated, but the total expression levels were significantly up-regulated, which indicated that rice could improve its own ability against stresses by regulating the expression levels ofgenes under stress conditions.

expression profile; protein structure; analysis; PGIP; rice

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0300800)和國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016ZX08001002)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0300800) and the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08001002).

陳夕軍, E-mail: xjchen@yzu.edu.cn

E-mail: xjchen@yzu.edu.cn

2020-02-16;

2020-07-02;

2020-07-17.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200717.1449.002.html

10.3724/SP.J.1006.2020.02011