左同鴻 張賀翠 劉倩瑩 廉小平 謝琴琴 胡燈科 張以忠 王玉奎 白曉璟 朱利泉,*
甘藍(lán)自交不親和性相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析
左同鴻1,**張賀翠1,**劉倩瑩1廉小平2謝琴琴1胡燈科1張以忠1王玉奎1白曉璟1朱利泉1,*
1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400716;2西南大學(xué)園藝園林學(xué)院, 重慶 400716
谷胱甘肽--轉(zhuǎn)移酶(glutathione-transferases, GSTs)對(duì)植物抵御逆境脅迫、解除細(xì)胞毒素和植物生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用。本研究通過(guò)甘藍(lán)自花授粉0~60 min的柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 篩選到1個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的谷胱甘肽--轉(zhuǎn)移酶基因?;蜷_(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為900 bp, 編碼299個(gè)氨基酸, 理論等電點(diǎn)為8.49, 不包含信號(hào)肽和跨膜區(qū), 含有GST-N和GST-C結(jié)構(gòu)域?;騿?dòng)子中含有光響應(yīng)、生長(zhǎng)素應(yīng)答、脫落酸反應(yīng)、低溫和干旱響應(yīng)等多種順式作用元件?;蛟诟仕{(lán)不同組織中均有表達(dá), 柱頭中的表達(dá)量隨發(fā)育時(shí)間而變化, 在成熟的柱頭中高表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果證實(shí),基因在0~60 min的表達(dá)量變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。通過(guò)酵母雙雜交發(fā)現(xiàn), BoGSTL21蛋白與花粉發(fā)育相關(guān)蛋白BoFAB1C、生長(zhǎng)素相關(guān)的蛋白BoPATL2、醛縮酶型TIM桶家族蛋白BoF9N12_9存在相互作用?;蛟诖竽c桿菌中被成功誘導(dǎo)表達(dá), 純化蛋白大小為34 kD, 與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。表明BoGSTL21可能是參與SI反應(yīng)過(guò)程的新蛋白, 這為甘藍(lán)自交不親和的進(jìn)一步研究和利用提供了新內(nèi)容。
甘藍(lán); 基因克隆; 自交不親和; 表達(dá)分析; 酵母雙雜交
自交不親和性(self-incompatibility, SI)是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為限制自交衰退、促進(jìn)雜交優(yōu)勢(shì)形成的一種復(fù)雜而完善的重要遺傳機(jī)制。蕓薹屬甘藍(lán)屬于典型的孢子體自交不親和(sporophytic self-incompatibility, SSI)植物, 其分子機(jī)制主要集中在SI信號(hào)傳導(dǎo)元件協(xié)同作用抑制自花花粉萌發(fā)或花粉管生長(zhǎng)?;ǚ酆椭^相互識(shí)別的過(guò)程包括花粉黏附、花粉外被釋放、水合、花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)穿入柱頭等[1]。目前研究認(rèn)為SI信號(hào)傳導(dǎo)途徑是由SRK-ARC1-Exo70A1等介導(dǎo)的蛋白質(zhì)泛素化降解途徑。Gu等[2]以-位點(diǎn)受體激酶(-locus receptor kinase, SRK)的胞內(nèi)激酶域?yàn)檎T餌, 通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)從甘藍(lán)型油菜柱頭cDNA文庫(kù)中鑒定出與SRK結(jié)合的靶蛋白——臂重復(fù)蛋白 1 (Arm repeat containing 1, ARC1), 其在自交不親和信號(hào)傳遞過(guò)程中起正調(diào)控作用。Vanoosthuyse等[3]和Stone等[4]利用RNAi干擾(RNA interference, RNAi)和反義抑制技術(shù)分別抑制琴葉擬南芥()和甘藍(lán)型油菜()中的表達(dá), 以及在甘藍(lán)型油菜中過(guò)表達(dá)均只能部分打破自交不親和性。擬南芥基因以假性遺傳因子的形式存在, 向自交親和擬南芥中僅轉(zhuǎn)入琴葉擬南芥的-位點(diǎn)半胱氨酸富集蛋白(-locus cysteine-rich protein, SCR)和SRK也能表現(xiàn)出強(qiáng)自交不親和性[5-7]。表明ARC1可能并非SRK唯一下游信號(hào)元件。因此, 尋找其他參與調(diào)控自交不親和反應(yīng)的蛋白質(zhì)元件的編碼基因, 對(duì)甘藍(lán)SI自交不親和分子機(jī)制的深入研究具有重要意義。
在植物中, 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione- transferases, GSTs; EC 2.5.1.18)是一個(gè)多基因家族, 首先在玉米中被發(fā)現(xiàn)[8], 此后不斷有GST的報(bào)道, 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)擬南芥有48個(gè)GST基因, 大豆有25個(gè)GST基因, 玉米有42個(gè)GST基因, 水稻有59個(gè)GST基因[9-11]。根據(jù)蛋白同源性和基因組織結(jié)構(gòu), 可將植物的GST分為φ、τ、ζ、θ、Lambda和脫氫抗壞血酸還原酶(DHARs) 6類[12-13]。后來(lái)又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些小類如Iota、Hemerythrin和微粒體GST等。生物化學(xué)和免疫學(xué)研究表明, GST家族基因主要在胞質(zhì)中表達(dá)[14-15]; 植物的φ、τ、ζ和θGST是蛋白二聚體, 是由約26 kD亞基組成的同源二聚體或異源二聚體, 形成疏水的50 kD的蛋白[16-18]; 但Lambda GST和DHAR與φ、τ、ζ和θ GST的結(jié)構(gòu)不同, 它們是由一條多肽鏈組成的單體[12,18]。在植物中, 一些GST基因的表達(dá)具有組織特異性, 如在玉米()的花粉中包含單一GST, 而角質(zhì)絨片中有相應(yīng)的5個(gè)同功酶[19]。GST在植物的初級(jí)代謝和二級(jí)代謝、脅迫耐受、細(xì)胞信號(hào)等方面行使功能[18]。由于授粉過(guò)程中的自花花粉刺激柱頭產(chǎn)生SI信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程, 類似于逆境刺激植物細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)程, 那么GST是否有可能通過(guò)某種分子過(guò)程與自交不親和相聯(lián)系呢?本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了甘藍(lán)自花和異花授粉后基因表達(dá)情況, 首次篩選到1個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因, 進(jìn)而通過(guò)基因克隆、生物信息學(xué)分析、組織特異性分析、啟動(dòng)子活性分析、原核表達(dá)以及酵母雙雜交等深入探索, 以期證明該蛋白參與甘藍(lán)自交不親和反應(yīng)。
甘藍(lán)高代自交不親和系‘A4’和‘F1’植株由西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所選育, 于2018年3月底至4月初, 選取開(kāi)花前1~2 d長(zhǎng)勢(shì)一致的‘A4’花蕾, 于開(kāi)花當(dāng)天人工去雄, 用成熟的‘A4’和‘F1’花粉對(duì)‘A4’進(jìn)行自花和異花授粉。分別取未授粉柱頭, 以及自花、異花授粉15、30和60 min的柱頭, 立刻放入液氮速凍保存。同時(shí)取葉片、莖、花蕾、萼片、花瓣、花藥和柱頭于-80℃保存?zhèn)溆?。本試?yàn)所用的擬南芥為哥倫比亞野生型擬南芥, 用于基因啟動(dòng)子的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。
大腸桿菌DH5α和原核表達(dá)菌株BL21 (DE3)均購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司, 農(nóng)桿菌GV3101購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
提取未授粉柱頭、自花授粉(15、30、60 min)以及異花授粉(15、30、60 min)柱頭的RNA, 送北京百邁克公司用Illumina HiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序, 測(cè)序類型為PE150, 構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序, 獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。采用FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)。在差異表達(dá)基因檢測(cè)過(guò)程中, 將差異倍數(shù)Fold Change≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate) FDR<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)基因在不同授粉處理后的相對(duì)表達(dá)量, 篩選在自花授粉后表達(dá)差異明顯、異花授粉后變化趨勢(shì)不明顯的基因。
根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的cDNA序列, 結(jié)合蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)、同源重組酶原理以及原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的序列特征, 用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物GST-F/R (表1), 分別以結(jié)球甘藍(lán)‘A4’花蕾gDNA和cDNA為模板, 在50 μL PCR反應(yīng)體系中依次加入20 μL ddH2O、25 μL 2×PCR Mixster Mix混合酶、上/下游引物各2 μL和cDNA模板1 μL; 反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 3 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 55 s, 40個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1×104mg L-1瓊脂糖凝膠電泳, 回收目的片段, 利用clonExpress快速克隆技術(shù)將目的片段連接到pGEX-4T-1載體上, 后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 經(jīng)菌液PCR將篩選出的陽(yáng)性克隆送上海生物工程股份有限公司測(cè)序。
表1 基因克隆及其熒光定量PCR分析所用引物
利用Bio-soft (http://www.bio-soft.net/sms/index. html)和DNAMAN 8.0軟件推導(dǎo)基因編碼的氨基酸序列; 利用在線工具ExPASy-ProtParam tool (http://www.expasy.org/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì); 利用Signalp (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0/)在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu); 利用Netphos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線軟件預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn); 利用NetNGlyc (http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)在線軟件預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn); 利用ProtScale (https://web.expasy. org/protscale/)在線分析軟件預(yù)測(cè)疏水性/親水性; 利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和PROSITE (http://prosite.expasy.org/)網(wǎng)站分析蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn); 通過(guò)PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugentbe/webtools/plantcare/)分析啟動(dòng)子的順式作用元件; 用MEGA7軟件結(jié)合NCBI網(wǎng)站上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
按照RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit說(shuō)明書(shū)(天根)提取甘藍(lán)柱頭、葉片、花藥等組織的RNA和不同授粉處理的柱頭RNA, 參照北京全式金生物技術(shù)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 于-20℃保存?zhèn)溆谩R匀~片、花蕾、萼片、花瓣、花粉和柱頭組織的cDNA為模板, 參照SYBRPremix EX說(shuō)明書(shū), 以作為內(nèi)參(表1), 根據(jù)獲得的基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物qRP-F、qRP-R (表1), 用7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增。
同時(shí)以未授粉柱頭、自花授粉(15、30和60 min)和異花授粉(15、30和60 min)的柱頭cDNA為模板,為內(nèi)參, 對(duì)目的基因進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL, 含2×SYBR Premix Ex10 μL、引物各1 μL、cDNA模板1 μL、超純水7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 1 min; 95℃ 15 s, 58℃ 15 s, 72℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù), 采用2?ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。
在NCBI選取基因起始密碼子上游1500 bp左右的核苷酸序列, 載體為pCAMBIA 1391, 酶切位點(diǎn)為I和R I, 引物為GUS-F/R (表1)。按照同源重組的方法構(gòu)建BoGSTL21-GUS融合表達(dá)載體。將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞, 用通用引物1391-F/R (表1)進(jìn)行PCR檢測(cè), 并將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單克隆按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng), 并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得陽(yáng)性擬南芥植株。通過(guò)篩選將得到的純合轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種, 分別取幼苗、莖、葉和花, 置GUS染色液中, 37℃培養(yǎng)箱中溫育過(guò)夜。將侵染過(guò)的樣品轉(zhuǎn)入70%酒精中脫色2~3次, 然后于體視顯微鏡下觀察照相。
選擇測(cè)序正確的重組原核表達(dá)載體的菌液擴(kuò)大培養(yǎng), 抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3), PCR檢測(cè)的引物為GST-F/GST-R, 將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單克隆按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng), 取100 μL菌液接種于100 mL含100 μg mL-1氨芐抗性LB培養(yǎng)基中, 置于搖床37℃, 225轉(zhuǎn)min-1振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6~0.8, 加入IPTG至終濃度為1 mmol L-1, 16℃過(guò)夜誘導(dǎo), 誘導(dǎo)結(jié)束后, 收集其菌體, 再進(jìn)行超聲破碎, 然后離心收集上清液, 經(jīng)海貍GST融合蛋白純化磁珠純化目的蛋白, 用SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白的表達(dá), 同時(shí)在試驗(yàn)中設(shè)置pGEX-4T-1空載作為對(duì)照。
1.8.1 構(gòu)建誘餌載體及自激活驗(yàn)證 根據(jù)目的基因編碼區(qū)序列以及誘餌載體pGBKT7的限制性酶切位點(diǎn)(RI和I)設(shè)計(jì)重組引物。利用同源重組的方法連接目的片段后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。按照LiAc法[20]制備酵母Y2Hgold感受態(tài)細(xì)胞。利用聚乙二醇/醋酸鋰法(PEG/LiAc)將重組質(zhì)粒pGBDT7-BoGSTL21與pGADT7空載共轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞, 轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在SD-Trp、DDO (SD/-Leu/-Trp)、QDO (SD/-Leu/-Trp/- His/-Ade/)平板上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 以共轉(zhuǎn)陰性對(duì)照pGBDT7-Lam×pGADT7-T平板作為對(duì)照, 驗(yàn)證pGBKT7-BoGSTL21重組質(zhì)粒是否存在自激活。
1.8.2 BoGSTL21互作蛋白篩選 根據(jù)制造商酵母方案手冊(cè)(Invitrogen), 使用Clontech雙雜交系統(tǒng)篩選酵母雙雜交, 將共轉(zhuǎn)化后的酵母感受態(tài)細(xì)胞涂布于營(yíng)養(yǎng)缺陷型TDO (SD/-Leu/-Trp/-His)固體培養(yǎng)基上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 觀察菌落在營(yíng)養(yǎng)缺陷型TDO固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況, 參照酵母質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒pGADT7載體, 然后以提取的酵母質(zhì)粒為模板, 以T7 5'-TAATACGACTCAC TATAGGG-3'和AD 5'-AGATGGTGCACGATGC ACAG-3'為引物進(jìn)行RCR擴(kuò)增, 將膠回收產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì), 找到同源序列, 統(tǒng)計(jì)序列長(zhǎng)度、基因登錄號(hào)、基因注釋等信息。
1.8.3 點(diǎn)對(duì)點(diǎn)回轉(zhuǎn)陽(yáng)性驗(yàn)證 將測(cè)序所得序列BLAST比對(duì)得到BoGSTL21互作候選蛋白, 構(gòu)建pGADT7載體重組質(zhì)粒, 利用PEG/LiAc法共轉(zhuǎn)化Y2Hgold酵母感受態(tài), 30℃恒溫震蕩90 min, 涂布于SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基上, 平板倒置培養(yǎng)3~5 d, 觀察是否有菌落生成, 后將菌斑稀釋100倍點(diǎn)涂在營(yíng)養(yǎng)缺陷型QDO固體培養(yǎng)基上, 觀察菌落在QDO固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。
根據(jù)甘藍(lán)自花和異花授粉0~60 min的柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 成功篩選到1個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因, 將該基因的cDNA序列在蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析發(fā)現(xiàn), 它與甘藍(lán)中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因()同源, 故將該基因命名為?;蛟谥^上的相對(duì)表達(dá)量隨授粉時(shí)間變化, 從自花授粉(self-pollination, SP) 0 min開(kāi)始持續(xù)上調(diào)表達(dá), 授粉30 min時(shí)其在柱頭上的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大, 為3.77, 而后急劇下調(diào); 而在異花授粉(cross-pollination, CP)過(guò)程中表達(dá)量變化不明顯, 略微下調(diào)(圖1)。經(jīng)過(guò)反復(fù)核定, 在授粉30 min時(shí), 兩者的表達(dá)量水平差異達(dá)到4倍, 此時(shí)正是SI相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)鍵時(shí)期。表明基因的表達(dá)可能受自花授粉誘導(dǎo)。
圖1 用柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析BoGSTL21自花授粉和異花授粉后的表達(dá)模式
SP: 自花授粉; CP: 異花授粉。
SP: self-pollination; CP: cross-pollination.
基因gDNA PCR產(chǎn)物大小約1800 bp, cDNA PCR產(chǎn)物約1000 bp (圖2)。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn),基因gDNA序列長(zhǎng)度為1823 bp, cDNA序列長(zhǎng)度為900 bp。由于使用同一對(duì)引物同源克隆得到cDNA和gDNA序列相差923 bp, 結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)一步對(duì)兩者進(jìn)行Clustal軟件比對(duì)分析發(fā)現(xiàn), 該基因的cDNA全長(zhǎng)1119 bp, 開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為900 bp, 由9個(gè)外顯子(分別為257、60、61、87、99、103、92、108和252 bp)和8個(gè)內(nèi)含子(分別為103、82、81、85、72、98、89和94 bp)組成。
圖2 甘藍(lán)BoGSTL21的cDNA和gDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
基因編碼含299個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì), 相對(duì)分子質(zhì)量為33.96 kD, 理論等電點(diǎn)(pI)為8.49。在氨基酸組成中, 絲氨酸(Ser)出現(xiàn)頻率最高, 占氨基酸總數(shù)的10.4%。帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為37個(gè), 帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為40個(gè)。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為55.77, 大于40, 因此為不穩(wěn)定蛋白??偲骄杷灾笖?shù)(grand average of hyropathicity, GRAVY)為-0.383, 推測(cè)為親水性蛋白。BoGSTL21蛋白具有典型的植物GST基因的蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 其中85~162位氨基酸為GST-N端結(jié)構(gòu)域(圖3, 實(shí)線框表示), 169~290位氨基酸為GST-C端結(jié)構(gòu)域(圖3, 下畫(huà)虛線所示), 中間為連接區(qū), 屬于Lambda家族成員。
圖3 甘藍(lán)BoGSTL21 cDNA結(jié)構(gòu)圖及其推導(dǎo)的氨基酸序列
虛線框?yàn)镹-糖基化位點(diǎn), 實(shí)線框?yàn)镚ST-N結(jié)構(gòu)域, 下畫(huà)虛線為GST-C結(jié)構(gòu)域。
The dotted box denotes the N-glycosylation site, the solid line frame denotes the GST-N domain, and the underlined line denotes the GST-C domain.
BoGSTL21蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)是由α-螺旋(alpha helix) 39.13%、β折疊(beta turn) 3.01%、無(wú)規(guī)則卷曲(random coil) 41.81%和延伸鏈(extended strand) 16.05%組成。BoGSTL21蛋白不含信號(hào)肽, 不存在跨膜結(jié)構(gòu)域, 含有1個(gè)N–糖基化位點(diǎn)(圖3, 虛線框所示), 36個(gè)磷酸化位點(diǎn), 主要集中在5~40、45~90、145~180、205~220位氨基酸處。氨基酸序列第228位亮氨酸(Leu)親水性最強(qiáng), 系數(shù)為-2.778; 第280位谷氨酰胺(Gln)疏水性最強(qiáng), 系數(shù)為2.856。疏水性分析顯示, 該蛋白平均負(fù)峰值個(gè)數(shù)顯著多于正峰個(gè)數(shù), 說(shuō)明它們親水性較好, 屬于可溶性蛋白。
對(duì)BoGSTL21與其他物種GSTL2同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn), BoGSTL21與甘藍(lán)型油菜BnGSTL2親緣關(guān)系最近, 其相似度達(dá)97.02%; 與薺菜CrGSTL2親緣關(guān)系最遠(yuǎn), 為70.23% (圖4)。結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)將BoGSTL21進(jìn)化關(guān)系最近的甘藍(lán)BoGSTL2、白菜BrGSTL2、甘藍(lán)型油菜BnGSTL2和蘿卜RsGSTL2進(jìn)行多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn), 它們的序列在GST-N和GST-C區(qū)域高度保守(圖5)。表明GSTL2蛋白均具有功能一致的細(xì)胞響應(yīng)保守蛋白元件(包括花粉刺激等外界非生物脅迫)。
圖4 BoGSTL21與其他物種GSTL2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
圖5 甘藍(lán)BoGSTL21與其他物種的同源蛋白氨基酸序列比對(duì)
黑色: 氨基酸一致性為100%; 深灰色: 氨基酸一致性為75%; 白色: 氨基酸一致性為50%。三角形標(biāo)記BoGSTL21和BoGSTL2的不同之處; 下畫(huà)直線為GST-N端結(jié)構(gòu)域, 下畫(huà)虛線為GST-C端結(jié)構(gòu)域, 同時(shí)也代表該蛋白在這一區(qū)段保守性高。
Black: amino acid identity 100%; Dark gray: amino acid identity 75%; White: amino acid identity 50%. The triangle marks the difference between BoGSTL21 and BoGSTL2; the underlined line denotes the GST-N terminal domain, and the underlined line denotes the GST-C terminal domain, which also indicates that the protein is highly conserved in this segment.
對(duì)基因啟動(dòng)子(起始密碼子上游2000 bp的核苷酸序列)分析發(fā)現(xiàn), 其包含了光響應(yīng)、茉莉酸響應(yīng)、水楊酸反應(yīng)、生長(zhǎng)素應(yīng)答、赤霉素反應(yīng)、脫落酸反應(yīng)、低溫和干旱誘導(dǎo)的反應(yīng)等多種順式作用元件(表2), 表明該基因除了響應(yīng)授粉刺激, 還可能響應(yīng)多種信號(hào)。
表2 BoGSTL21基因上游調(diào)控區(qū)順式作用元件
基因在甘藍(lán)的不同組織中均有表達(dá), 且表達(dá)量有差異(圖6)。在萼片中的表達(dá)量最高, 柱頭、葉片表達(dá)量次之, 且它們之間表達(dá)量相差不大, 而在花瓣、花藥、莖和花蕾中表達(dá)相對(duì)較低。
本研究從甘藍(lán)基因組gDNA中擴(kuò)增起始密碼子上游1.5 kb的啟動(dòng)子區(qū)域, 將其與β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)報(bào)告基因融合后轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植株, 篩選獲得了轉(zhuǎn)基因T2代陽(yáng)性植株。將陽(yáng)性植株的擬南芥種子、幼苗、蓮座期葉片、花期花蕾和果莢等浸沒(méi)到GUS染液中進(jìn)行GUS染色分析發(fā)現(xiàn), 在種子的發(fā)育階段,基因在剛剛萌發(fā)的種子中有表達(dá), 但表達(dá)量不高(圖7-a, c); 在幼苗的發(fā)育階段,基因主要在子葉中表達(dá)(圖7-d); 在葉片中,基因主要在成熟葉的葉脈中表達(dá)(圖7-e, f); 在整個(gè)花的發(fā)育過(guò)程中,基因在柱頭和萼片中均有表達(dá), 柱頭中的表達(dá)量隨著發(fā)育時(shí)間而變化, 并且主要在成熟的柱頭中高表達(dá)(圖7-g~i);基因在花粉中有低表達(dá)(圖7-g~i)。在果莢發(fā)育階段,基因在未成熟的果莢中高表達(dá), 隨著果莢發(fā)育表達(dá)量降低, 在果莢后期集中在頂部和基部表達(dá)(圖7-i, j)。
圖6 BoGSTL21基因在不同組織中的表達(dá)分析
對(duì)不同授粉處理后柱頭中基因的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),基因在自花授粉后表達(dá)趨勢(shì)為先上調(diào)后下調(diào), 異花授粉后變化不大。由圖8可知, 自花授粉30 min后相對(duì)表達(dá)量約為6.2, 而異花授粉30 min后相對(duì)表達(dá)量約為0.73, 前者明顯高于后者且相差8.5倍。此時(shí)正是SI反應(yīng)的關(guān)鍵時(shí)期, 在自花授粉30 min時(shí)能顯著誘導(dǎo)柱頭表達(dá), 該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致, 表明基因響應(yīng)甘藍(lán)自花授粉后的反應(yīng)。
圖7 GUS染色分析
a~c: 種子不同發(fā)育時(shí)期; d, e: 幼苗不同發(fā)育時(shí)期; f: 葉的不同發(fā)育時(shí)期; g~i: 花的不同發(fā)育時(shí)期; j, k: 果莢的不同發(fā)育時(shí)期。
a–c: different stages of seed development; d, e: different stages of seedling development; f: different stages of leaf development; g–i: different stages of flower development; j, k: different stages of fruit pod development.
圖8 BoGSTL21基因在不同授粉處理后柱頭組織中的表達(dá)分析
SP: 自花授粉; CP: 異花授粉。
SP: self-pollination; CP: cross-pollination.
將成功構(gòu)建pGBDT7-BoGSTL21重組質(zhì)粒與pGADT7空載體共轉(zhuǎn)化酵母Y2Hgold感受態(tài)細(xì)胞發(fā)現(xiàn), 融合蛋白pGBDT7-BoGSTL21在DDO (SD/-Leu/ -Trp)平板上有單菌落長(zhǎng)出, 在QDO (SD/-Leu/-Trp/ -His/-Ade/)平板上無(wú)菌落長(zhǎng)出, 與陰性對(duì)照結(jié)果一致。表明誘餌蛋白BoGSTL21沒(méi)有自激活活性。進(jìn)而以BoGSTL21為誘餌蛋白進(jìn)行酵母文庫(kù)篩選, 經(jīng)測(cè)序比對(duì)得到3個(gè)潛在的候選蛋白(表3)。
將得到的候選蛋白連接pGADT7構(gòu)建重組質(zhì)粒, 以陰陽(yáng)對(duì)照載體和重組載體組合pGADT7 (BoFAB1C、BoPATL2、BoF9N12_9)與目的質(zhì)粒pGBKT7- BoGSTL21共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞, 涂布于DDO固體平板上, 30℃倒置培養(yǎng)3~5 d, 觀察發(fā)現(xiàn)DDO平板上有菌落生成(圖9)。通過(guò)PCR檢測(cè), 均能擴(kuò)增出目的條帶, 說(shuō)明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。為進(jìn)一步檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用, 將DDO平板上的單菌落轉(zhuǎn)移至QDO平板上, 30℃倒置培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn), 陰性對(duì)照在QDO平板上不能生長(zhǎng), 顏色顯無(wú)色(圖9), BoFAB1C/BoGSTL21、BoPATL2/BoGSTL21、BoF9N12_ 9/BoGSTL21和陽(yáng)性對(duì)照均能在平板上生長(zhǎng), 并出現(xiàn)白色反應(yīng)(表4)。表明BoGSTL21與BoFAB1C、BoPATL2、BoF9N12_9之間存在相互作用。
表3 候選蛋白的功能注釋分析
圖9 酵母雙雜交驗(yàn)證BoFAB1C/BoGSTL21、BoPATL2/ BoGSTL21、BoF9N12_9/BoGSTL21之間的相互作用
第1~3排表示pGADT7-BoFAB1C/BoPATL2/BoF9N12_9× pGBDT7- BoGSTL21; 第4排表示陽(yáng)性對(duì)照(pGADT7-T× pGBDT7-p53); 第5排表示陰性對(duì)照(pGADT7-T×pGBDT7-Lam)。
The first to third row indicates pGADT7-BoFAB1C/BoPATL2/ BoF9N12_9×pGBDT7-BoGSTL21; the fourth row indicates positive control (pGADT7-T×pGBDT7-p53); the fifth row indicates negative control (pGADT7-T×pGBDT7-Lam). DDO: SD/-Leu/-Trp; QDO: SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/.
將BoGSTL21-pGEX-4T-1重組菌株擴(kuò)大培養(yǎng), 并在16℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá), 經(jīng)海貍GST融合蛋白純化磁珠純化目的蛋白, SDS-PAGE電泳, 所得結(jié)果如圖10所示; 與未誘導(dǎo)的BoGSTL21-pGEX-4T-1 (泳道1)、誘導(dǎo)的BoGSTL21-pGEX-4T-1 (泳道2)、純化的pGEX-4T-1空載(泳道3)相比, 泳道4在60 kD左右具有單一純化條帶, 其蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量與BoGSTL21-pGEX-4T-1估計(jì)值相符。其中pGEX-4T-1空載體表達(dá)約26 kD的蛋白, BoGSTL21蛋白預(yù)測(cè)的分子大小約為34 kD, 二者融合約為60 kD的蛋白, 表明BoGSTL21-pGEX-4T-1融合蛋白在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)成功。
本研究基于自交不親和甘藍(lán)柱頭不同授粉處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 成功篩選到1個(gè)受自花授粉誘導(dǎo)的上調(diào)表達(dá)基因。利用qRT-PCR驗(yàn)證了該基因在授粉后表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致;組織定量結(jié)果和GUS染色結(jié)果也基本一致, 表明基因響應(yīng)甘藍(lán)自花授粉后的反應(yīng)?;騿?dòng)子分析發(fā)現(xiàn), 其含有脅迫反應(yīng)、生長(zhǎng)素(IAA)、脫落酸(ABA)和代謝調(diào)節(jié)等多種順式作用元件, 表明基因可能參與調(diào)控復(fù)雜的生物反應(yīng)過(guò)程。
表4 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母的相互作用分析
圖10 BoGSTL21蛋白的原核表達(dá)
M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: BoGSTL21-pGEX-4T-1未誘導(dǎo)蛋白; 2: BoGSTL21-pGEX-4T-1誘導(dǎo)蛋白; 3: pGEX-4T-1蛋白; 4: BoGSTL21-pGEX-4T-1純化蛋白。
M: molecular weight standard of protein; 1: BoGSTL21-pGEX- 4T-1 is an uninduced control; 2: BoGSTL21-pGEX-4T-1 is the purified fusion protein; 3: pGEX-4T-1 protein; 4: BoGSTL21- pGEX-4T-1 purified protein.
植物的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一個(gè)基因超家族, 分為φ、τ、ζ、θ、Lambda和脫氫抗壞血酸還原酶(DHARs) 6類[12-13]?;蚓幋a蛋白質(zhì)具有典型的植物GST基因的蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 其中85~162位氨基酸為GST-N端結(jié)構(gòu)域, 169~290位氨基酸為GST-C端結(jié)構(gòu)域, 屬于Lambda類GST。Zeng 等[21]通過(guò)對(duì)甘藍(lán)自花和異花授粉不同時(shí)間處理后的花柱提取總蛋白, 再通過(guò)蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn), GST家族基因在自花授粉后差異表達(dá), 被認(rèn)為是一種SI相關(guān)基因。本研究中通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的也是一種GST基因, 說(shuō)明GST作為SI相關(guān)基因很可能參與自交不親和反應(yīng)。GST在植物的初級(jí)代謝、二級(jí)代謝、脅迫耐受和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中行使功能, 從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[18]。許多研究表明, GST也可以解除外界毒素以及內(nèi)源有毒代謝物的侵害[9-10,12]。此外, GST家族蛋白還參與了植物中類黃酮物質(zhì)的積累和轉(zhuǎn)運(yùn)[22]。例如玉米是最早發(fā)現(xiàn)與花青素苷這一類黃酮物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的GST家族成員, 其編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTIII[23], 能與花青素形成復(fù)合物并參與其轉(zhuǎn)運(yùn)。牽?;ㄖ谢蚓幋a谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTI, 也可以結(jié)合花青素苷并參與其轉(zhuǎn)運(yùn)[24-25]。類黃酮物質(zhì)除了具有保護(hù)植物免受紫外線傷害、抵抗病原菌的侵害等功能外, 對(duì)植物生殖發(fā)育也具有重要的影響[26], 如參與花粉-柱頭的相互作用的過(guò)程[27], 促進(jìn)花粉萌發(fā)及影響花粉管的極性生長(zhǎng)中起作用[28-29]。而本研究中自交不親和反應(yīng)的本質(zhì)是花粉與柱頭識(shí)別及信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程, 表明基因也可能是通過(guò)參與類黃酮物質(zhì)的積累和轉(zhuǎn)運(yùn), 影響類黃酮物質(zhì)參與花粉-柱頭的相互作用的過(guò)程, 從而參與自交不親和反應(yīng)。
本研究以BoGSTL21為誘餌蛋白, 利用甘藍(lán)酵母文庫(kù)篩選到3個(gè)互作蛋白, 分別為BoFAB1C、BoF9N12_9、BoPATL2。編碼1-磷脂酰肌醇- 3-磷酸5-激酶, 具有1-磷脂酰肌醇-3-磷酸5-激酶活性, FAB1在擬南芥花粉管生長(zhǎng)和受精中發(fā)揮作用[30], FAB1A/B的功能喪失和功能獲得突變會(huì)損害內(nèi)膜穩(wěn)態(tài), 從而使擬南芥的多效性發(fā)育異常[31], 擬南芥FAB1/PIKfyve蛋白對(duì)于存活花粉的發(fā)育至關(guān)重要[32]。F9N12_9屬于醛縮酶型TIM桶家族蛋白, 參與碳水化合物代謝過(guò)程、磷酸戊糖途徑、氨基酸的生物合成。表明參與多種復(fù)雜的生物反應(yīng)過(guò)程。PATL2屬于具有高爾基動(dòng)力學(xué)(GOLD)結(jié)構(gòu)域和Sec14p-like結(jié)構(gòu)域串聯(lián)的蛋白質(zhì)家族。四重突變體()在根內(nèi)胚層細(xì)胞中顯示PIN1側(cè)向改變, PATELLINS是擬南芥中生長(zhǎng)素介導(dǎo)PIN1重定位和植物發(fā)育的調(diào)節(jié)劑[33]。BoPINs蛋白定位的改變可能會(huì)使植物體內(nèi)生長(zhǎng)素濃度梯度分布紊亂, 自交不親和性與生長(zhǎng)素含量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[34]。通過(guò)改變可可樹(shù)中生長(zhǎng)素濃度梯度可能會(huì)影響或控制自交不親和性[35]。表明BoGSTL21蛋白可能通過(guò)與PATL2蛋白發(fā)生相互作用, 進(jìn)而調(diào)控BoPINs家族蛋白使柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)素濃度分布紊亂, 導(dǎo)致花器異常甚至胚胎發(fā)育異常, 不能正常授粉受精, 最終導(dǎo)致不親和反應(yīng)[36-37]。植物中GSTs可作為IAA的載體, 與之形成植物激素結(jié)合蛋白[38-40]。表明也可能是BoGSTL21蛋白作為IAA的載體, 形成植物激素結(jié)合蛋白, 引起生長(zhǎng)素濃度變化, 從而參與自交不親和反應(yīng)。
基因在自花授粉過(guò)程中0~60 min上調(diào)表達(dá), 在異花授粉過(guò)程中變化不大。而甘藍(lán)自交不親和反應(yīng)主要在開(kāi)花后30~60 min之內(nèi)完成[41], 表明該基因可能參與自花授粉后花粉與柱頭相互作用的復(fù)雜反應(yīng)過(guò)程。本試驗(yàn)成功克隆了甘藍(lán)的基因, 通過(guò)分析其氨基酸序列的生物信息學(xué)、表達(dá)特性及酵母互作, 為了解基因與自交不親和性的聯(lián)系奠定了基礎(chǔ), 為SI的深入研究提供了新內(nèi)容。
從高代自交不親和甘藍(lán)‘A4’材料自花和異花授粉處理的柱頭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到1個(gè)差異表達(dá)的基因, 該基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為900 bp, 編碼299個(gè)氨基酸, 含有GST-N和GST-C結(jié)構(gòu)域, 其編碼蛋白大小為34 kD?;蛟诓煌M織中均有表達(dá), 在花的發(fā)育階段, 柱頭中的表達(dá)量隨發(fā)育時(shí)間而變化, 且在成熟的柱頭中高表達(dá)。該基因0~60 min上調(diào)表達(dá), 在異花授粉過(guò)程中表達(dá)量變化并不明顯。BoGSTL21蛋白與BoFAB1C、BoF9N12_9、BoPATL2相互作用, 參與多種復(fù)雜的生物過(guò)程, 包含SI反應(yīng)過(guò)程。BoGSTL21可能通過(guò)多種途徑如參與黃酮類物質(zhì)的積累和運(yùn)轉(zhuǎn)或作為IAA的載體或與生長(zhǎng)素相關(guān)蛋白PATL2互作, 參與柱頭響應(yīng)自花花粉刺激的分子過(guò)程, 推測(cè)可能是實(shí)現(xiàn)參與SI相關(guān)過(guò)程的新蛋白。
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Molecular cloning and expression analysis ofin self-incompatibility
ZUO Tong-Hong1,**,ZHANG He-Cui1,**,LIU Qian-Ying1,LIAN Xiao-Ping2,XIE Qin-Qin1,HU Deng-Ke1,ZHANG Yi-Zhong1,WANG Yu-Kui1,BAI Xiao-Jing1, and ZHU Li-Quan1,*
1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China;2College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716, China
Glutathione--transferase(GSTs) plays an important role in plant resistance to stress,cytotoxic release and plant growth and development.In this study,we identified an up-regulated gene namedbased on the stigma transcriptome data in 0–60 min self-pollination.had an open readingframe(ORF)with the length of 900 bp,encoded a protein of 299 amino acid residues,which contained GST-N and GST-C domains without signal peptide and transmembrane domain,the theory isoelectric point ofwas 8.49.The promoter ofgene contained many cis-acting elements such as light response,auxin response,abscisic acid response,low temperature and drought response.expresses in different tissues of.The expression level in stigma varies with developmental time,and was mainly overexpressed in mature stigma.The results of qRT-PCR revealed thatmRNA expression level after self-and cross-pollinations for 0 min to 60 min was consistent with that of RNA-seqdata. It was found through yeast two-hybrid that BoGSTL21 protein interacted with pollen development-related protein BoFAB1C, auxin-related protein BoPATL2, and aldolase-type TIM barrel family protein BoF9N12_9.gene was successfully induced and expressed inBL21 (DE3)with a purified protein size of 34 kD,which was consistent with the predicted results.According to the above results, BoGSTL21 may be a novel protein involved in the SI response process, which provides a new content for further research and utilization of self-incompatibility in.
;gene cloning;self-incompatibility;expression analysis;yeast two-hybrid
本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572127), 重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CYS18085)和中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(XDJK2017C032)資助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31572127), the Chongqing Graduate Research and Innovation Project (CYS18085), and the Basic Scientific Research Business Expenses Project of the Central University (XDJK2017C032).
朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn, Tel: 023-68250794
**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)
左同鴻, E-mail: zuotongh@163.com
2020-01-08;
2020-07-02;
2020-08-18.
URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200818.1618.006.html
10.3724/SP.J.1006.2020.04004