謝曉芳 讓 凌 薛 銳 鄭 飛 唐俊明 冉 然

（ 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院1 麻醉科；2 臨床醫(yī)學(xué)研究所，十堰 442000；3 湖北醫(yī)藥學(xué)院麻醉學(xué)研究所，十堰 442000）

神經(jīng)病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是由軀體感覺系統(tǒng)病變或疾病引起的一種臨床常見的難治性疾病[1]，深入研究NP 的發(fā)病機(jī)制，為其臨床治療提供高效可行的方案，將具有重要的臨床意義。

神經(jīng)元敏化是NP 的主要發(fā)病機(jī)制之一[1]。神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)興奮性信號(hào)和抑制性信號(hào)的穩(wěn)態(tài)失衡是導(dǎo)致神經(jīng)元敏化的重要因素[2]。GABA 是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1 (GABA transporter 1, GAT-1)介導(dǎo)的GABA 重?cái)z取在GABA能信號(hào)調(diào)節(jié)中起重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，GAT-1 基因過表達(dá)的動(dòng)物出現(xiàn)明顯痛覺過敏的癥狀[4]；有文獻(xiàn)報(bào)道在坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction injury, CCI)模型誘導(dǎo)的NP 模型中，在脊髓中GAT-1 的表達(dá)量明顯增加[5]，因此認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)GAT-1 的改變與NP 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglion, DRG) 是傷害性信號(hào)從外周進(jìn)入中樞的重要樞紐[6]，研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠DRG 上也存在有GAT-1 的表達(dá)[6]，但神經(jīng)損傷后DRG 上是否也發(fā)生GAT-1 表達(dá)的改變，這些改變?cè)谏窠?jīng)痛發(fā)病機(jī)制中的作用很少有研究涉及。因此，本研究通過構(gòu)建大鼠CCI 模型，探討DRG 中GAT-1 的改變，并且觀察這些改變對(duì)疼痛癥狀的影響，旨在為NP 尋找以DRG 上GAT-1 為靶點(diǎn)的新治療方法提供依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雌性SD 大鼠60 只，體重180～220 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。60 只SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為 ：對(duì)照組 (Sham)、CCI 組、CCI + NS 組、CCI + NO-711 組，每組15 只。NO-711購自美國(guó)Sigma Aldrich 公司，溶于0.9%生理鹽水。

2.坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型

CCI 模型的制備方法參考Bennett[7]等文獻(xiàn)。大鼠腹腔注射1% 戊巴比妥鈉 (30 mg/kg) 麻醉。右股骨外側(cè)切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)干。在CCI 組大鼠中，在坐骨神經(jīng)三支分叉上方用嗜鉻羊腸線松結(jié)扎4 道，每道間隔約1 mm，結(jié)扎力度以見到肢體輕微抽動(dòng)為宜。逐層縫合肌肉皮膚。Sham 組大鼠僅分離不結(jié)扎坐骨神經(jīng)，其余步驟與CCI 模型一致。

3. DRG 局部給藥

大鼠麻醉后，取俯臥位。在L5棘突旁0.5 cm 處，開2 cm 長(zhǎng)的豎直切口，鈍性分離棘突右側(cè)緣肌肉層，充分暴露L5椎板。① DRG 局部單次注射：微量注射器插入L5右側(cè)神經(jīng)孔2 mm 左右，大腿肌肉抽動(dòng)說明針尖接近DRG，固定針尖緩慢注射藥物，逐層縫合切口；②DRG 局部置管給藥[6]：在L5椎板上鉆一個(gè)0.8 mm 的孔，將連接PE10 管的套管插入孔內(nèi)2 mm，出現(xiàn)大鼠右后腿抽動(dòng)動(dòng)作說明置管成功。骨水泥固定套管，逐層縫合切口。

4. 行為學(xué)測(cè)試

行為學(xué)測(cè)試環(huán)境溫度維持在22～24℃，濕度指數(shù)50%～60%，測(cè)量時(shí)間為上午9:00～11:00。熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)測(cè)定：將大鼠放置在3 mm 厚的玻璃板上，罩上玻璃觀察框，待大鼠適應(yīng)30 min 安靜后，用熱痛刺激儀照射大鼠后足掌心，記錄從照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿舔足等回避動(dòng)作的時(shí)間；為避免組織損傷，自動(dòng)切斷時(shí)間設(shè)為 25 s；共測(cè) 5 次，間隔 5 min，平均值即為TWL。機(jī)械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)：將大鼠放置離桌面高50 cm 的鐵絲網(wǎng)上，罩上玻璃觀察框。用電子vonFrey 觸痛儀的探針緩慢向上壓迫大鼠后爪，記錄電子vonFrey 觸痛儀顯示引起撤足反應(yīng)的力；共測(cè) 5次，間隔 5 min，平均值即為MWT。

5. 蛋白免疫印記分析

大鼠腹腔注射1% 戊巴比妥鈉 (40 mg/kg) 深麻醉后，取其右側(cè)L4、L5脊髓節(jié)段及對(duì)應(yīng)的DRG。RIPA 裂解組織后，離心取上清液，BCA 法測(cè)蛋白濃度。采用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離出30 μg蛋白樣品, 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。PVDF 膜放入5%的脫脂奶粉中封閉60 min。分別加入α-Tubulin（鼠源，1:1000, Sigma）、GAT-1 一抗（兔源，1:500，Abcam），p-ERK（兔源，1:500，CST），c-Fos（兔源，1:1000，GeneTex），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3次，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1.5 h，繼續(xù)TBST 洗膜3 次。ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，Image J軟件測(cè)灰度值進(jìn)行半定量分析。

6. 免疫熒光

大鼠深麻醉下，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定，取L5水平脊髓及DRG。標(biāo)本用多聚甲醛固定6 h，再浸入10%、20%、30%蔗糖梯度脫水，經(jīng)OCT包埋后被切成20 μm 厚度的冰凍切片。切片用含有0.3% Triton X-100 的5%馬血清封閉破膜30 min。DRG 切片加入GAT-1 一抗（兔源，1:300， Abcam），脊髓切片加入c-Fos 一抗（兔源，1:250，GeneTex），4℃孵育過夜。熒光二抗避光孵育1 h。脊髓切片用DAPI 染核10 min。 抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，用Image J 計(jì)算平均光密度值，取各組的均數(shù)進(jìn)行比較。

7. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±SD)表示。采用重復(fù)測(cè)量方差分析測(cè)量各組疼痛閾值；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法。P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. CCI 模型的建立

相比Sham 組，CCI 組的TWL 和MWT 均從術(shù)后1 天開始降低，第7 天降至最低值，至第14 天雖有緩解趨勢(shì)，但仍處于較低水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖1），上述結(jié)果表明CCI 模型制作成功。

2. CCI 術(shù)后DRG 神經(jīng)元中GAT-1 的表達(dá)

檢測(cè)DRG 中的GAT-1 在神經(jīng)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平，以探討DRG 中的GAT-1 在NP 中的潛在作用。免疫熒光圖像和Western blot 圖像顯示：在CCI 術(shù)后第7 天及第14 天，即疼痛最為明顯的時(shí)期，DRG 中GAT-1 表達(dá)量升高（P＜ 0.05，見圖2）。

圖1 CCI 術(shù)后大鼠后足痛閾的改變 (n = 6, ±SD) (A) CCI 術(shù)后大鼠TWL的變化；(B) CCI 術(shù)后大鼠MWT 的變化Fig. 1 The change of pain threshold of the rats after CCI injury (n = 6, ±SD) (A) Thermal withdrawal latency (TWL) after CCI; (B) Mechanical withdrawal threshold (MWT) after CCI

圖2 CCI 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)DRG 中GAT-1 的表達(dá) (±SD) (A, B) GAT-1 的熒光強(qiáng)度；(C, D) GAT-1 的蛋白表達(dá)量(n = 3)Fig. 2 GAT-1 expression in DRG at different time points after CCI (±SD) (A, B) GAT-1 immunofluorescence; (C, D) The expression of GAT-1 protein (n = 3)

3. DRG 注射GAT-1 抑制劑對(duì)CCI 大鼠TWL和MWT 的影響

CCI + NS 組和CCI + NO-711 組每組各6 只大鼠，于CCI 手術(shù)當(dāng)天分別DRG 局部單次注射NO-711 (10 μg/μl, 10 μl)和10 μl 生理鹽水后，觀察兩組大鼠術(shù)后2 周內(nèi)痛閾值的變化。相比CCI + NS 組，CCI + NO-711 組術(shù)后第3、5、7 天熱痛覺過敏反應(yīng)明顯降低（P＜ 0.05，見圖3A），同時(shí)術(shù)后第3、5天的MWT 也得到了緩解（P＜ 0.05，見圖3B）。CCI + NS 組和CCI + NO-711 組每組各9 只大鼠，于CCI 術(shù)后第7 天通過預(yù)留的DRG 套管分別將NO-711 (10 μg/μl, 10 μl ) 和生理鹽水 (10 μl) 注射至大鼠的DRG 附近，其中每組3 只大鼠于給藥后6 h取材，觀察CCI + NS 組和CCI + NO-711 組剩余6只大鼠注射后術(shù)后第1 周的TWL 和MWT 的變化。相比CCI + NS 組，CCI + NO-711 組大鼠的TWL 和MWT 在給藥后0.5 h 立即升高，2 h 時(shí)最明顯，鎮(zhèn)痛作用持續(xù)48 h（P＜ 0.05，見圖3C、D ）。

4. DRG 局部注射 NO-711 對(duì)CCI 術(shù)后DRG 中p-ERK 表達(dá)的影響

根據(jù)Western blot 結(jié)果：CCI + NS 組大鼠 p-ERK表達(dá)水平較 Sham 組升高（P＜ 0.05，見圖4）； DRG局部注射NO-711 后，CCI + NO-711 組大鼠p-ERK 蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜ 0.05，見圖4）。說明抑制DRG 神經(jīng)元GAT-1 的作用可降低DRG 神經(jīng)元中p-ERK 的表達(dá) 。

5. DRG 局部注射NO-711 對(duì)CCI 大鼠脊髓中c-Fos 表達(dá)的影響

圖3 CCI 手術(shù)當(dāng)天和術(shù)后第7 天DRG 局部注射NO-711 對(duì)大鼠痛閾的影響 (n = 6, ±SD)Fig. 3 Effects of local DRG injection of NO-711 on pain threshold of rats on the day of CCI operation and the 7th after operation (n = 6, ±SD)

脊髓背角是DRG 突觸后神經(jīng)元的聚集部位，其激活狀態(tài)對(duì)于傷害性信號(hào)的傳遞有著十分重要的作用。c-Fos 作為神經(jīng)元激活標(biāo)記物[6]，可用來定量經(jīng)DRG 套管注射NO-711 對(duì)大鼠脊髓突觸后神經(jīng)元激活的影響。Sham 組c-Fos 染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞極少，神經(jīng)損傷后c-Fos 陽性神經(jīng)元表達(dá)增加，而DRG 局部注射NO-711 顯著減少了CCI 術(shù)后脊髓c-Fos 陽性細(xì)胞的數(shù)量（見圖5A）。Western blot 結(jié)果也表明相比CCI+NS 組，CCI + NO-711 組的c-Fos蛋白的表達(dá)明顯減少（P＜ 0.05，見圖5B、C）。這些數(shù)據(jù)說明抑制DRG 神經(jīng)元GAT-1 的作用減少外周傷害性信號(hào)向脊髓的興奮性輸入。

討 論

去抑制學(xué)說是近些年來關(guān)于NP 發(fā)生機(jī)制提出的新觀點(diǎn)，認(rèn)為NP 的發(fā)生和抑制系統(tǒng)的功能減弱有關(guān)[8]。GAT-1 介導(dǎo)了GABA 的重?cái)z取，與GABA作用的終止密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下，DRG 中的GAT-1 表達(dá)水平不高，而神經(jīng)損傷后第7、14 天DRG 內(nèi)GAT-1 表達(dá)上調(diào)，且在MWT 及TWL最明顯的CCI 術(shù)后第7 天，GAT-1 的表達(dá)量最高。神經(jīng)損傷后DRG 的GAT-1 的表達(dá)上調(diào)很可能加速細(xì)胞外的GABA 清除，降低了細(xì)胞外的GABA 濃度，進(jìn)一步減弱GABA 能抑制信號(hào)，從而使神經(jīng)元敏感性增高，引起NP 的癥狀。

圖4 CCI 術(shù)后DRG 局部NO-711 注射對(duì)DRG 內(nèi)p-ERK 蛋白表達(dá)量的影響 (±SD)Fig. 4 Changes of p-ERK protein expression in the DRG after NO-711 topically injection in CCI rats (±SD)

圖5 CCI 術(shù)后DRG 局部注射NO-711 對(duì)大鼠L5 脊髓背角c-Fos 蛋白表達(dá)的影響 (±SD)Fig. 5 Changes of c-Fos protein in the L5 spinal dorsal horn in the L5 DRG topically injection of NO-711 (±SD)

為了探討DRG 局部GAT-1 的表達(dá)升高對(duì)NP發(fā)生和發(fā)展影響，本研究采用DRG 局部注射技術(shù)將NO-711 局部注射到DRG 上，避免鞘內(nèi)注射和全身給藥帶來的全身性作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；通過觀察發(fā)現(xiàn)CCI 手術(shù)當(dāng)天DRG 局部注射GAT-1 抑制劑后，痛覺過敏出現(xiàn)的時(shí)間延遲到術(shù)后第5 天才出現(xiàn)，而且術(shù)后第7 天在NP 癥狀穩(wěn)定之后，在DRG局部單次給予NO-711，也發(fā)現(xiàn)CCI 大鼠MWT 和TWL明顯升高，雖然鎮(zhèn)痛作用只可持續(xù)48 h，以上結(jié)果說明逆轉(zhuǎn)DRG 中GAT-1 的上調(diào)可以影響NP 癥狀的發(fā)生，靶向DRG 的GAT-1 有一定的治療NP 作用。以往研究報(bào)道鞘內(nèi)注射GAT-1 抑制劑可改善NP模型的痛覺過敏[3,9]，當(dāng)然這樣的結(jié)果也不能排除鞘內(nèi)注射后藥物浸潤(rùn)到DRG 從而發(fā)揮的鎮(zhèn)痛作用。

神經(jīng)元興奮性的改變?cè)贜P 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (ERK) 介導(dǎo)的ERK通路在傷害性感覺的傳遞和神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[10,11]，有報(bào)道稱CCI 大鼠DRG 中ERK 磷酸化可抑制 A 型快速失活鉀通道引起DRG神經(jīng)元敏感性增高[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)CCI 術(shù)后p-ERK升高，而DRG 局部注射NO-711 可以抑制p-ERK的表達(dá)，間接說明GAT-1 上調(diào)可能會(huì)使DRG 神經(jīng)元致敏，而抑制GAT-1 的作用可以降低DRG 神經(jīng)元興奮性，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

痛覺信號(hào)的產(chǎn)生是通過外周傷害性信號(hào)傳遞到DRG，繼而傳遞到脊髓背角等高級(jí)感覺中樞，c-Fos是脊髓背角感覺神經(jīng)元激活的標(biāo)志性蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)CCI 術(shù)后脊髓背角內(nèi)c-Fos 明顯升高， DRG注射GAT-1 抑制劑NO-711 抑制了脊髓背角內(nèi)c-Fos的表達(dá)，預(yù)示抑制GAT-1 的作用可以降低外周傷害性信號(hào)向中樞端的傳遞，從而抑制中樞敏化。因此，神經(jīng)損傷后DRG 中GAT-1 的表達(dá)上調(diào)引起神經(jīng)元敏化，易化了傷害性信號(hào)從外周向中樞的傳遞，可能是NP 的發(fā)生機(jī)制。靶向DRG 中的GAT-1 可能是有效緩解NP 的新方法。

本研究仍存在一定的局限性，本研究采用c-Fos和p-ERK 來表達(dá)來間接反應(yīng)脊髓背角和DRG 局部的神經(jīng)元的激活狀態(tài)，如果直接用膜片鉗對(duì)DRG及脊髓背角神經(jīng)元興奮性加以驗(yàn)證，將為實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供更加有力的證據(jù)。