朱品歡 燕蘭云 徐 歡 萬 琪

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南京210029）

偏頭痛是一種常見的、多因素的、致殘的、復(fù)發(fā)的、具有遺傳特點(diǎn)的慢性神經(jīng)血管性頭痛，其病情特征為反復(fù)發(fā)作、一側(cè)或雙側(cè)搏動(dòng)性的劇烈頭痛且多發(fā)生于偏側(cè)頭部[1]。我國偏頭痛病人女性居多，與男性之比約為3:1。根據(jù)最新的全球疾病負(fù)擔(dān)顯示，在 50 歲以下的人群中偏頭痛已躍居致失能性疾病排行榜第一位[2]。其持續(xù)存在嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，因此深入探究偏頭痛的發(fā)病機(jī)制對其預(yù)防及治療有重要的臨床意義。

近年來，小膠質(zhì)細(xì)胞與偏頭痛之間的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，細(xì)菌感染、周圍神經(jīng)創(chuàng)傷、癌癥、脊髓創(chuàng)傷等因素均可使其激活[3]。一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后發(fā)揮呈遞抗原、吞噬病原體、分泌多種細(xì)胞因子和神經(jīng)修復(fù)作用；另一方面，也能分泌一些炎癥因子、谷氨酸、NO等加重炎癥反應(yīng)，引起繼發(fā)損傷[4]。研究已證實(shí)在反復(fù)硬腦膜炎性湯(inflammatory soup, IS)刺激誘導(dǎo)的慢性偏頭痛模型中，三叉神經(jīng)脊束尾核 (trigeminal nucleus caudalis, TNC) 小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化且對大鼠痛覺超敏的調(diào)控有重要作用[5]。在周圍神經(jīng)損傷后，P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13 和P2Y14mRNAs 在同側(cè)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的含量均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)[6～8]，這表明P2Y 家族的受體可能在激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致神經(jīng)疼痛的過程中起到一定作用。P2Y14 作為一種抑制環(huán)磷酸腺苷合成的Gi (inhibitory adenylate cyclaes g protein, Gi) 蛋白偶聯(lián)受體，能夠被4,7-二取代的二萘酸衍生物 (4,7-disubstituted 2naphthoic acid derivative, PPTN)，一種P2Y14 受體的高親和力競爭性拮抗劑所抑制[9,10]。

本研究參考了文獻(xiàn)[11～13]，在大鼠橫竇區(qū)硬腦膜上連續(xù)給予IS，建立偏頭痛大鼠模型。觀察IS 與PPTN 對實(shí)驗(yàn)大鼠眶周痛覺閾值及頸髓C1-C2后角P2Y14 受體、小膠質(zhì)細(xì)胞與偏頭痛中樞敏化之間的關(guān)系，以此來更好地了解偏頭痛的產(chǎn)生和發(fā)展過程。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級6 周齡成年雄性SD 大鼠42 只，體重180～220 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號SYXK(Su)2015-0015。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在21～22℃，保持12 h/12 h 明暗間隔的人工晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行的所有研究行為均嚴(yán)格遵照國際疼痛學(xué)會(huì)(International Association for the Study of Pain, IASP) 的相關(guān)動(dòng)物保護(hù)及使用規(guī)定，并獲得南醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為：(A)生理鹽水(NS) 組、(B)“炎性湯”4 天(IS4d)組、(C)“炎性湯”7 天(IS7d)組、(D) PPTN 治療組、(E) PPTN 治療對照組、(F) PPTN 預(yù)防組、(G) PPTN 預(yù)防對照組，每組6 只。其中A、B、C 組為干預(yù)前組，這三組相互比較以明確炎性湯I(xiàn)S 對大鼠偏頭痛中樞敏化的影響。D、E、F、G 組為干預(yù)后組，D、E兩組相互比較以明確PPTN 治療對大鼠偏頭痛中樞敏化的影響，F(xiàn)、G 兩組相互比較以明確PPTN 預(yù)防對大鼠偏頭痛中樞敏化的影響。

2.方法

（1）手術(shù)準(zhǔn)備及硬腦膜給藥：實(shí)驗(yàn)大鼠在動(dòng)物房飼養(yǎng)3 天后開始進(jìn)行造模。以10%水合氯醛0.4 ml/100 g 腹腔注射大鼠，待其麻醉后，將大鼠固定于立體定位儀上，依次剪開皮膚及軟組織暴露顱骨。騎跨人字縫用牙科鉆鉆開顱骨(3 mm×3 mm)，暴露橫竇。置入PE10 軟管（寧波安來公司），軟管末端開口于橫竇區(qū)硬腦膜，用鉆開的顱骨重新覆蓋暴露的橫竇，并將PE10 管固定于顱骨上，打火機(jī)封閉PE10 管另一端。術(shù)后將被手術(shù)大鼠單籠飼養(yǎng)并監(jiān)測其狀態(tài)及眶周痛閾值，經(jīng)觀察得知術(shù)后第4 天大鼠眶周痛覺閾值基本恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。于術(shù)后第4 天開始經(jīng)PE10 軟管給藥。將大鼠放入有給藥窗的固定器中，暴露PE10 管，剪去被打火機(jī)封閉的一端，待其安靜后，給予無菌IS10 μl（IS包含2 mmol/L組胺、5-羥色胺、緩激肽及0.2 mmol/L 前列腺素E2，稀釋于無菌的PBS 中）或無菌NS 10 μl 或無菌P2Y14 抑制劑PPTN10 μl，5 min 勻速給完（IS 藥物及PPTN均購自Sigma 公司）。IS4d 組和IS7d 組從術(shù)后第5天起于每日固定時(shí)間經(jīng)PE10 管給予IS 一次，分別給予4 天和7 天。NS 組則在每日相應(yīng)時(shí)間經(jīng)PE10管給予與IS 相同體積的無菌NS。PPTN 預(yù)防組在術(shù)后第4 天固定時(shí)間經(jīng)PE10 管給予PPTN 一次，術(shù)后第5～11 天于固定時(shí)間依次給予PPTN 及IS 各1 次，連續(xù)7 天。預(yù)防對照組則在相應(yīng)時(shí)間經(jīng)PE10管給予與PPTN 相同體積的無菌NS。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)可知，大鼠硬腦膜給予IS 后第3 天出現(xiàn)痛覺超敏，故PPTN 治療組在術(shù)后第5～7 天于每天固定時(shí)間經(jīng)PE10 管給予IS 一次，連續(xù)3 天，術(shù)后第8～11天于每天固定時(shí)間經(jīng)PE10 管依次給予IS 及PPTN各1 次，連續(xù)4 天。治療對照組則在相應(yīng)時(shí)間經(jīng)PE10 管給予與PPTN 相同體積的無菌NS。

（2）眶周痛覺閾值測定：按參考文獻(xiàn)[14]方法，每天相同時(shí)間點(diǎn)將大鼠置于透明固定器中，安靜30 min 后，用vonFrey 纖維絲懸于大鼠一側(cè)眶周皮膚上，相互垂直，從最小克數(shù) 0.008 g （Iog值1.65）開始刺激眶周皮膚，逐步增加至最大克數(shù) 300 g。以纖維絲彎曲 90°為標(biāo)準(zhǔn)，并在刺激部位停留 2 s，刺激 5 次為一循環(huán)，每次刺激之前間隔 3 s。若在 5 次刺激中有 3 次及以上出現(xiàn)大鼠用前爪撥開纖維絲、發(fā)動(dòng)攻擊或縮頭縮爪等行為表現(xiàn)，則判定該大鼠出現(xiàn)痛覺超敏，并記錄此時(shí)刺激克數(shù)為疼痛閾值。若刺激克數(shù)達(dá)到 300 g，但仍未出現(xiàn)上述痛覺超敏表現(xiàn)，則將 300 g 記為其痛閾值。實(shí)驗(yàn)表明，出現(xiàn)痛覺超敏的大鼠，其疼痛閾值多在 15 g 以下。

（3）Western Blot：將頸髓C1-C2組織剪切成小塊，加入適量的冰冷PBS 洗滌2 次后稱重。每20 mg 組織加入100 μl 裂解液和相應(yīng)的磷酸酶抑制劑，每個(gè)試管加入2 個(gè)直徑2 mm 的磁珠，將其放入組織勻漿機(jī)中，60 Hz，300 s。充分裂解后，將試管放入離心機(jī)中，12 000 r 離心15 min。取上清。將上清液煮沸5 min，然后將收集到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 處理。在室溫下用5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫孵育PVDF 膜，置于搖床溫柔搖晃1 h；在4℃條件下，分別用一抗Iba-1(1:2000)、P2Y14 (1:2000)和內(nèi)參β-actin (1:2000)置于搖床孵育過夜；TBST 清洗3 次，每次5 min；二抗孵育：按說明書稀釋相應(yīng)二抗，室溫孵育置于搖床溫柔搖晃2 h；TBST 清洗8 次，每次8 min；將ECL、發(fā)光液A液和B 液混合(1:1)，均勻覆于膜后，置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像；Western blot 條帶經(jīng)Image J 軟件進(jìn)行灰度掃描分析。

（4）免疫熒光：以10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，以0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液沖洗血液后，取脊髓頸段(C1、C2)置于4%多聚甲醛中固定2 h，隨后依次置于20%、30%蔗糖溶液脫水直至頸髓組織沉底。包埋組織并連續(xù)冠狀切片，片厚15 μm。加入0.3% Triton-X100 及10% BSA 中室溫封閉60 min。加入相應(yīng)的一抗山羊抗大鼠Iba-1 (1:100, Abcam)，4℃過夜。后加入熒光二抗FITC 熒光素標(biāo)記的驢抗山羊IgG (1:600, Abcam)，貼片、滴加抗淬滅劑、封固，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果（×20倍和×40倍）。

圖1 術(shù)后不同時(shí)間大鼠眶周痛閾值Fig. 1 Periorbital pain threshold of rats at different time after operation

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示計(jì)量資料，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組比較用單因素或兩因素方差分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.反復(fù)硬腦膜炎癥能誘導(dǎo)大鼠眶周痛覺超敏

術(shù)前各組大鼠眶周痛閾值均維持在同一基礎(chǔ)水平，顱骨手術(shù)后各組大鼠眶周痛閾值會(huì)出現(xiàn)短暫性下降，但均于術(shù)后第4 天恢復(fù)至基礎(chǔ)值（見圖1）。NS 組與空白組之間眶周痛閾值之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2）。自給藥第3 天開始，與NS 組和空白組相比，IS4d 和IS7d 組大鼠眶周痛閾值明顯降低至痛覺超敏水平以下（P＜ 0.001，見圖2）。

2.小膠質(zhì)細(xì)胞在偏頭痛形成早期起促進(jìn)作用

已有研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞參與偏頭痛的早期發(fā)展[5]。因此，根據(jù)文獻(xiàn)[11～13]建立了SD 大鼠偏頭痛模型，以推進(jìn)本研究。由圖2 可知，與NS 組相比，IS4d 組和IS7d 組的大鼠眶周痛閾值顯著降低,特別從第3 天起（P＜ 0.001，見圖2），且IS4d 組和IS7d 組的下降趨勢基本一致，這表明偏頭痛大鼠模型造模是成功的。之后用Western Blot 方法檢測了頸髓C1-C2節(jié)段中小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白Iba-1 的表達(dá)情況，并將各組中Iba-1/β-actin 的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)Iba-1 的表達(dá)量在IS4d 組和IS7d 組顯著上升，而在NS 組中則沒有這種現(xiàn)象（P＜ 0.001，見圖3），其中IS4d 組Iba-1 蛋白的含量較IS7d 組更高（P＜ 0.001，見圖3）。免疫熒光結(jié)果也證實(shí)了這一現(xiàn)象（P＜ 0.01，P＜ 0.05，見圖4）。這與之前的研究結(jié)果相符[5],即小膠質(zhì)細(xì)胞在偏頭痛早期階段起作用。

圖2 不同給藥時(shí)間大鼠眶周痛閾值Fig. 2 Periorbital pain threshold of rats with different administration time

3. P2Y14 受體與小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)量變化趨勢一致

在檢測小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白Iba-1的含量后，隨即檢測了頸髓C1-C2組織中P2Y14 受體的含量。其中P2Y14 蛋白存在兩條條帶，對其進(jìn)行了統(tǒng)一分析。本研究發(fā)現(xiàn)IS4 組P2Y14 受體水平最高，IS7組次之，NS 組最低（P＜ 0.001，見圖5），這與我們之前發(fā)現(xiàn)的Iba-1 蛋白的變化趨勢相同。這說明，P2Y14 蛋白可能與小膠質(zhì)細(xì)胞之間存在一定的相關(guān)性。

4. PPTN 可減少P2Y14 受體和小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)量并減輕痛覺超敏的程度

圖3 NS 組、IS4d 組和IS7d 組頸髓C1-C2 節(jié)段Iba-1 蛋白表達(dá)情況Fig. 3 Iba-1 protein expression in C1-C2 segment of cervical spinal cord in NS group,IS4d group and IS7d group

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PPTN 經(jīng)注射后將在30 min 以后發(fā)揮作用[10]，因此本研究在硬腦膜給予IS 的前1 天在預(yù)防組中加入了PPTN 作為PPTN 預(yù)防組，或加入NS 作為預(yù)防對照組。從結(jié)果可以看出，與預(yù)防對照組相比，PPTN 預(yù)防組大鼠眶周痛閾值下降幅度明顯減緩，甚至在給予PPTN 后第4 天開始，預(yù)防組的眶周痛閾值緩慢上升（P＜ 0.05，見圖6A）。同樣,在硬腦膜給予IS 后第4 天加入PPTN，能有效地減緩偏頭痛模型大鼠眶周痛閾值的下降，與NS 治療組相比，PPTN 治療組眶周痛閾值的減緩效果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖6B）。用Western Blot 檢測了各組中Iba-1/β-actin和P2Y14/β-actin 的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PPTN 預(yù)防組和PPTN 治療組中含量均明顯低于各自相應(yīng)對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001，見圖6C、D）。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果顯示，在使用了PPTN 預(yù)防或治療后，大鼠頸髓組織中Iba-1 的形態(tài)和數(shù)量與各自對照組相比均有明顯的減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見圖7）。

圖5 NS 組、IS4d 組和IS7d 組頸髓C1-C2 節(jié)段P2Y14受體表達(dá)情況Fig. 5 P2Y14 receptor expression in C1-C2 segment of cervical spinal cord in NS group, IS4d group, and IS7d group

圖6 PPTN 預(yù)防組和PPTN 治療組對大鼠眶周痛閾值以及頸髓C1-C2 節(jié)段Iba-1 和P2Y14 受體表達(dá)的影響Fig. 6 Periorbital pain threshold of rats with different administration time and expression of IBA-1 and P2Y14 receptors in C1-C2 segments of cervical spinal cord in PPTN prevention group, PPTN treatment group, and their respective control groups

圖7 PPTN 預(yù)防組和PPTN 治療組和各自對照組中頸髓C1-C2 節(jié)段Iba-1 免疫熒光檢測（圖中前三行標(biāo)尺為20 μm，最后一行標(biāo)尺為40 μm）Fig. 7 The immunofluorescence of IBA-1 in C1-C2 segment of cervical spinal cord in PPTN prevention group, PPTN treatment group and their respective control groups (the bar scales in the first three lines are 20 μm, and in the last line are 40 μm)

討 論

偏頭痛的治療一直是世界性的難題，會(huì)對病人的生活產(chǎn)生負(fù)面影響，并導(dǎo)致許多伴隨癥狀，如頭暈、惡心、嘔吐等自主神經(jīng)功能障礙。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活，對外界刺激如遷移、增殖、形態(tài)改變、免疫因子和炎癥介質(zhì)的釋放等做出反應(yīng)，參與細(xì)胞碎片的吞噬?，F(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元向周圍的膠質(zhì)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞）發(fā)出信號，這些神經(jīng)細(xì)胞被激活后，在病理狀態(tài)下會(huì)引起偏頭痛和持續(xù)的神經(jīng)炎癥[3,15]。

在本研究中，小膠質(zhì)細(xì)胞確實(shí)在偏頭痛發(fā)展的早期就被激活，Western Blot 結(jié)果顯示，IS4 組的小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性蛋白Iba-1 的含量明顯高于IS7組。同樣的現(xiàn)象也可以在免疫熒光結(jié)果中看到。IS4組激活的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯高于IS7 組，雖然部分激活的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不如IS7 組飽滿，突觸未完全展開，但均有明顯的激活。因此，這是一個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)，證明小膠質(zhì)細(xì)胞只在偏頭痛的早期階段起作用，其水平在偏頭痛的中后期緩慢下降。

研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞中P2Y 家族的8 個(gè)受體，除P2Y14 受體主要與血管性疾病和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等相關(guān)外[16,17]，其余受體均被證實(shí)與小膠質(zhì)細(xì)胞和炎性痛覺過敏有關(guān)。為了探討P2Y14 受體、小膠質(zhì)細(xì)胞與偏頭痛這三者之間的關(guān)系，本研究檢測了實(shí)驗(yàn)大鼠IS4、IS7、NS 組的頸髓C1-C2組織中P2Y14 受體的含量。發(fā)現(xiàn)SD 大鼠偏頭痛模型中P2Y14 受體的變化與Iba-1 的變化趨勢一致，即含量由高到低依次為IS4 組、IS7 組和NS 組。也就是說，P2Y14受體在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，或者兩者之間存在對應(yīng)關(guān)系。因此，我們懷疑P2Y14 受體可能通過小膠質(zhì)細(xì)胞參與偏頭痛超敏反應(yīng)的形成。為了檢測P2Y14受體是否在偏頭痛模型中起作用，本研究加入其抑制劑PPTN 對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行了一系列的預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)。通過結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在偏頭痛模型造模前1 天加入PPTN 不僅明顯減少了P2Y14 受體和小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，還可以有效預(yù)防眶周痛閾值的下降，治療組亦是如此。

Curet 等[17]發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤GL261 細(xì)胞，其小膠質(zhì)細(xì)胞中的P2Y14 受體含量是上調(diào)的，并且在使用了選擇性P2Y14 受體激動(dòng)劑UDP glucose 后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了一系列與P2Y14 受體增高相關(guān)的變化，而由于GL261 細(xì)胞不能單獨(dú)表達(dá)P2Y14 受體，因此他們認(rèn)為UDPG 所產(chǎn)生的作用可能是由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的。這與本研究存在一定的類似性。在偏頭痛痛覺超敏模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)P2Y14 受體含量上調(diào)，而使用PPTN 抑制了P2Y14 受體的表達(dá)后，小膠質(zhì)細(xì)胞激活量下降，痛覺超敏程度降低。這些現(xiàn)象均表明，P2Y14 受體確實(shí)參與了小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的偏頭痛的產(chǎn)生，抑制P2Y14 受體的表達(dá)可能通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞的活化進(jìn)而減輕偏頭痛痛覺超敏的形成及其疼痛的程度。

綜上所述，P2Y14 受體與小膠質(zhì)細(xì)胞之間存在一定的對應(yīng)關(guān)系。在經(jīng)IS 誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠模型中，頸髓C1-C2后角小膠質(zhì)細(xì)胞明顯被激活，且早期被激活的情況更為明顯，后期數(shù)量逐漸減少。預(yù)先給予P2Y14 受體抑制劑PPTN 處理能明顯抑制痛覺超敏現(xiàn)象及小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白Iba-1 的表達(dá)。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)SD 大鼠已經(jīng)出現(xiàn)痛覺超敏現(xiàn)象后再給予PPTN 亦能減輕痛覺超敏的程度及Iba-1 的表達(dá)。這表明P2Y14 受體確實(shí)通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而參與了偏頭痛痛覺超敏的形成，抑制P2Y14 受體可以有效預(yù)防偏頭痛病人痛覺超敏現(xiàn)象的發(fā)生和發(fā)展，從而改善病人生活質(zhì)量。但有關(guān)P2Y14 受體究竟是通過何種途徑激活小膠質(zhì)細(xì)胞從而參與中樞敏化，還有待進(jìn)一步研究。