王相森

（山東省高密市經(jīng)濟開發(fā)區(qū)畜牧獸醫(yī)站山東濰坊 261500）

豬瘟病毒屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，病毒基因組為單股正鏈RNA，近年來隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，豬瘟的發(fā)病趨勢呈現(xiàn)出了明顯的變化，豬瘟發(fā)病后的臨床表現(xiàn)往往不典型，出現(xiàn)了所謂的非典型豬瘟、溫和型豬瘟等，僅通過臨床特征很難進行確切診斷。本文主要綜述了豬瘟病毒的幾種實驗室檢測方法，為提高我國豬瘟病毒的實驗室診斷提供參考。

1 RT-PCR 檢測方法

RT-PCR 檢測方法是豬瘟病毒的常用檢測方法，該方法特異性強，敏感性高，檢測結(jié)果快速準(zhǔn)確[1]。豬瘟病毒基因組全長12.5kb，含有一個大的開放閱讀框，5'端有一個非編碼區(qū)（5'UTR），3'端有一個非編碼區(qū)（3'UTR），通常根據(jù)豬瘟病毒5'端保守區(qū)序列設(shè)計通用型檢測引物，根據(jù)變異性較強的E2 基因序列設(shè)計毒株分型鑒別檢測方法。普通的RT-PCR 檢測方法根據(jù)實驗方法的不同又分為單重RT-PCR 方法和多重RT-PCR，單重RT-PCR 方法可以分為兩步RT-PCR 方法、一步法RT-PCR 方法和巢式RT-PCR 方法，兩步RT-PCR 方法的反轉(zhuǎn)錄和PCR 擴增分步進行，一步RT-PCR 方法是利用一步法酶在一個體系內(nèi)先進行反轉(zhuǎn)錄再進行PCR 擴增，大大簡化了試驗流程，縮短了試驗時間，巢式RT-PCR 方法通過兩輪PCR 擴增增加了試驗的靈敏性，多重RT-PCR 方法是同時進行多種病原的PCR 檢測，由于臨床病料的混合感染情況較嚴(yán)重，通過多重RT-PCR 同時實現(xiàn)多種病原的同時檢測，節(jié)約了試劑和試驗時間，在臨床病料檢測中可以根據(jù)需要選擇適合的檢測方法。

2 RT-LAMP 檢測方法

RT-LAMP 檢測方法是核酸的恒溫擴增檢測方法，該方法敏感、特異、方便、快捷，適用于基層實驗室豬瘟病毒的檢測。王韋華[2]等建立了豬瘟病毒RT-LAMP 檢測方法，根據(jù)GenBank 上不同豬瘟分離株的基因組序列設(shè)計豬瘟病毒擴增引物，通過優(yōu)化RT-LAMP檢測條件，建立了豬瘟病毒RT-LAMP 檢測方法，該檢測方法的最低檢測限量為1.0×10-7 ng/μ L，比普通RT-PCR 方法的敏感性高100 倍，為豬瘟病毒的現(xiàn)場快速診斷提供了方便。楊平東[3]等建立了豬瘟病毒NASBA-RT-LAMP 快速檢測方法，該方法是利用核酸序列依賴性擴增技術(shù)（NASBA）大量擴增病毒RNA，在進行反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（RT-LAMP），該方法是將NASBA 技術(shù)和RT-LAMP 技術(shù)相結(jié)合的兩步法檢測方法，大大提高了病毒RNA 檢測的靈敏度，最低可以檢測出46 pg/μL 的病毒RNA，為豬瘟病毒的臨床檢測提供了新思路。

3 IPMA 檢測方法

IPMA 檢測方法全稱為免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗，是在感染病毒的單層細(xì)胞上面加上一抗，再加上標(biāo)有辣根過氧化物酶的二抗，最后加上酶底物進行顯色反應(yīng)，通過抗原抗體的相互作用，產(chǎn)生特異性的顯色反應(yīng)，通過光學(xué)顯微鏡進行觀察并判斷結(jié)果。張振倉[4]等建立了豬瘟病毒的IPMA 檢測方法，最佳病毒接種量為0.5 個TCID50，一抗1:300 稀釋，二抗1:2000 稀釋，檢測方法有很好的特異性，與其他豬病毒沒有交叉反應(yīng)，在300 份臨床樣品的檢測中，通過與RT-PCR 方法和ELISA 方法的比較，符合率在92%以上，說明該就檢測方法有很好的特異性，敏感性，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為豬瘟病毒的臨床檢測奠定基礎(chǔ)。

4 實時熒光定量PCR 檢測方法

實時熒光定量PCR 檢測方法是近些年發(fā)展起來的病毒核酸低含量快速檢測技術(shù)，操作方便，檢測結(jié)果直觀，檢測時間短。張永英[5]等建立了豬瘟病毒強毒株SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法，該方法根據(jù)豬瘟病毒強毒株5'UTR 區(qū)域設(shè)計特異性檢測引物，可以快速檢測豬瘟病毒強毒株，最低檢出量為10 拷貝/μL，檢測結(jié)果快速準(zhǔn)確，與豬瘟弱毒、偽狂犬病毒、藍(lán)耳病病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒沒有交叉反應(yīng)，可以用于豬瘟病毒強毒感染的早期診斷和豬瘟的有效防控。

5 結(jié)語

豬瘟是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，危害巨大，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，豬瘟病毒時刻發(fā)生變異，各種新流行毒株不斷出現(xiàn)，臨床癥狀往往不典型，大大增加了疾病診斷難度，加強豬瘟病毒的實驗室檢測對防控豬瘟擴散傳播起到關(guān)鍵作用，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，各種新技術(shù)，新方法不斷應(yīng)用到豬瘟的臨床檢測中，大大提高了檢測的特異性和敏感性，為豬瘟病毒的綜合防控和早期診斷帶來方便和快捷，各種檢測方法也可以用于豬場豬瘟病毒的凈化，通過開展分子流行病學(xué)調(diào)查，及時淘汰帶毒豬和隱性感染豬，為規(guī)模豬場的健康發(fā)展保駕護航。