季蘭閣，王思瑜，郭登洲

（河北中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎病二科，河北石家莊 056001）

IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是在亞洲人群中表現(xiàn)較為普遍的腎小球腎炎疾病，常見臨床癥狀為血尿和蛋白尿.確診病例中，20%～40%的患者在20年內(nèi)腎功能逐漸惡化，直至發(fā)展為終末期腎?。?］.IgAN目前仍需以腎穿刺活檢術為主要確診手段，活檢病理評估可見IgA或以IgA為主的免疫復合物（通常與補體C3共沉積物存在）彌漫性沉積在腎小球系膜區(qū).研究表明，白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）、miRNA-148b可通過下調(diào)β1，3半乳糖轉移酶（core1β3 galactosyltransferase，C1GalT1）的水平和活性，影響糖基化進程，此機制或與導致IgA1鉸鏈區(qū)O-糖基化的缺損，加重IgA1的半乳糖缺乏有關，異常的IgA1糖基化增加，形成的免疫復合物在腎小球系膜區(qū)沉積，導致系膜增生、活化，系膜細胞釋放大量細胞因子及趨化因子，進一步加重腎臟損傷［2-4］.目前尚無針對異常糖基化IgA1的有效治療手段.通利三焦、清熱利濕方為郭登洲教授的經(jīng)驗方，在臨床上治療IgA腎病，可提高患者生活質(zhì)量，延緩終末期腎病的療效確切［5］，本研究通過建立IgAN大鼠模型，觀察通利三焦、清熱利濕方基于IL-4、miRNA-148b調(diào)控異常糖基化對IgAN的影響，進一步探討治療IgAN的機制并為此方的臨床應用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 動物實驗與試劑

1.1.1 實驗動物

雄性清潔級SD大鼠48只，體質(zhì)量（150±30）g，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證編號：1805044，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003.飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學院研究所動物實驗室.

1.1.2 實驗藥物

通利三焦、清熱利濕方免煎顆粒：僵蠶10 g、蟬蛻10 g、桔梗10 g、茯苓10 g、土茯苓15 g、川芎8 g，由河北省中醫(yī)院院制劑室提供.西藥：鹽酸貝那普利片（10 mg*14北京諾華制藥有限公司）.

1.1.3 試劑與儀器

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4），蓖麻油、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（北京索萊寶科技有限公司）；RT-qPCR 試劑（Promega，批號：4＋1）；miRNA-148b試劑盒（美國sigma公司）；rat IL-4抗體（上海森雄科技事業(yè)有限公司，批號：SXR030），兔抗大鼠IgA熒光標記抗體（美國abcam公司，批號：ab96967）.

離心機（上海安亭，型號：TDL-5-A）；超低溫保存箱（日本三洋，型號：MDF-382E）；實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司，型號：7500fast）；全自動生化分析儀（Japan Sysmex，型號：HEMIX-180）；數(shù)碼顯微鏡（Olympus，型號：DP73）.

1.2 實驗方法

1.2.1 分組方法

普通級飼料適應性喂養(yǎng)1周后，尿檢蛋白陰性大鼠進入實驗，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、貝那普利組、中藥組共4組，每組12只.

1.2.2 造模方法

采用BSA＋LPS＋CCl4＋蓖麻油免疫誘導的方法制備IgAN大鼠模型［6］，模型組、貝那普利組、中藥組3組按600 mg/kg計算大鼠用藥量，予BSA與蒸餾水配成的質(zhì)量濃度為100 g/L的溶液，隔日灌胃，持續(xù)8周，同時予蓖麻油0.3 mL＋CCl40.1 mL每周1次皮下注射，持續(xù)8周，并于第5周、第9周末以LPS用氯化鈉溶液配成質(zhì)量濃度為0.25 g/L的溶液，尾靜脈注射0.2 mL；正常組予等體積的蒸餾水與生理鹽水代替.

1.2.3 干預方法

參考《藥理實驗方法學》［7］中“人和動物間按體表面積折算的等效劑量”計算實驗大鼠給藥量.于實驗第10周始，中藥組予通利三焦、清熱利濕方中藥灌胃，折算后每只大鼠每日用量為僵蠶0.18 g、蟬蛻0.18 g、桔梗0.18 g、茯苓0.18 g、土茯苓0.27 g、川芎0.144 g（人的體質(zhì)量為70 kg，大鼠體質(zhì)量為200 g）.貝那普利組予鹽酸貝那普利片與蒸餾水配成混懸液，折算后每只大鼠每日予質(zhì)量1.8 mg的貝那普利灌胃給藥.正常組與模型組均以等體積蒸餾水灌胃.以上干預治療共持續(xù)4周.

1.2.4 標本的留取及采集

分別于第9周末、第13周末收集24 h尿標本，檢測尿蛋白定量.于第13周末取材，腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為10%的水合氯醛方法麻醉大鼠，取腹主動脈血液，用全自動生化分析儀測定血肌酐、尿素氮；取血完成后快速分離腎臟，剝離被膜，切取腎皮質(zhì)部分置于液氮中，采集完成后統(tǒng)一轉移至-80℃冰箱，以備RT-PCR檢測；再切取部分組織用體積分數(shù)為4%多聚甲醛固定液固定，以備進行光鏡標本制備與免疫組化檢測；剩余腎臟組織，切取一部分快速制成冰凍切片，以備進行免疫熒光檢測；再切取部分固定于體積分數(shù)為4%戊二醛固定液中，進行電鏡下腎組織超微結構觀察.

1.2.5 腎臟病理學檢查

（1）腎組織光鏡

將部分腎臟組織用體積分數(shù)4%多聚甲醛固定，分別用體積分數(shù)75%、85%、95%、100%的乙醇進行梯度脫水30 min（100%乙醇脫水2次）后，依次進行二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度為2～3μm切片，切片制作完成后，65℃烤片3 h，脫蠟至水（二甲苯5 min×2；體積分數(shù)100%乙醇1 min；體積分數(shù)95%乙醇1 min），按照蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）、過碘酸六胺銀染色（periodic acid-silver metheramine，PASM）步驟進行染色后，光鏡下觀察并拍照.

（2）免疫熒光

將已冷凍腎臟組織進行冰凍切片，用二甲苯與梯度乙醇分別脫蠟和水化，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次，每次5 min，晾干30 min，滴加兔抗大鼠IgA 抗體（VIgA抗體∶V抗體稀釋液＝1∶400）.4℃過夜，PBS液沖洗3次，每次5 min，甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，結果以亮綠色為陽性，采用國際通用的5級半定量標準進行判讀.

（3）腎組織電鏡

于冰上切取少量組織塊，用體積分數(shù)為2.5%的戊二醛和體積分數(shù)1%鋨酸雙固定，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，切片后用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察并拍照.

1.2.6 ELISA法檢測血清中IL-4水平變化

取大鼠血液，自然凝固后離心，取上清液，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，用抗大鼠IL-4單抗包被于酶標板上，與樣品中大鼠IL-4相結合，加入生物素化的抗大鼠IL-4抗體，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化氫酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入酶底物TMB，出現(xiàn)藍色，加入終止液硫酸，顏色變黃，450 nm下測定各孔吸光度A（450nm），建立標準物的質(zhì)量濃度、A（450nm）坐標系，計算IL-4實際質(zhì)量濃度.

1.2.7 RT-PCR法檢測大鼠腎臟組織中IL-4、miRNA-148b的mRNA表達

采用TRIZOL提取樣本總RNA，然后進行兩步法逆轉錄和聚合酶鏈擴增反應.IL-4反應程序為：預變性95℃10 min，然后40個循環(huán)反應，95℃15 s，60℃60 s.miRNA-148b反應程序為：預變性95℃10 min，然后44個循環(huán)反應，95℃15 s，60℃60 s.引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，IL-4以GAPDH為引物，miRNA-148b以5s為引物（表1）.擴增完畢后，得到IL-4、miRNA-148b的基因及內(nèi)參基因的Cq值，基因Cq值-內(nèi)參基因的Cq值＝ΔCq，按照公式Q＝2-ΔCq，得到每個目的基因的Q值及Q均值，再以每個目的基因的Q值/Q均值，即各目的基因表達的相對定量值（RQ值），將RQ值用于統(tǒng)計分析.

表1 RT-PCR引物序列Table1 Primer sequence of RT-PCR

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析，錄入計量數(shù)據(jù)后，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差不齊，則應用秩和檢驗，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1 造模結果

造模完成后，正常組大鼠精神良好，體質(zhì)量穩(wěn)定增加，毛色光亮；造模組（模型組、中藥組、貝那普利組）大鼠精神萎靡、納食減少、毛色黯淡粗糙、體質(zhì)量減輕.造模完成后，造模組各組HE、PASM染色可見系膜細胞增生，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤明顯，毛細血管袢變窄，說明實驗模型制備成功.

2.2 各組大鼠腎組織光鏡觀察結果

正常組腎小球結構完整，系膜區(qū)及基質(zhì)未見異常改變.模型組腎臟組織可見明顯的系膜增生、基質(zhì)增多，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤異常.中藥組與貝那普利組腎組織異常程度較模型組降低，其中中藥組較貝那普利組改善明顯（圖1、2）.

2.3 各組大鼠腎組織電鏡觀察結果

腎組織HE染色、PASM染色結果顯示，正常組系膜及基質(zhì)未見增生，上皮細胞、內(nèi)皮細胞及基底膜結構未見異常.模型組出現(xiàn)顯著的系膜增生，基質(zhì)增多，有大量的免疫復合物沉積，足突中度融合.中藥組和貝那普利組出現(xiàn)輕度的系膜增生及基質(zhì)增多，免疫復合物沉積程度較模型組較輕，足突輕度融合（圖3）.

2.4 免疫熒光檢測結果

正常組腎臟組織腎小球系膜區(qū)IgA沉積極少，模型組呈團塊狀熒光沉積，中藥組與貝那普利組熒光強度較模型組降低，且中藥組較貝那普利組程度更少（圖4）.

圖1 光鏡下各組大鼠腎臟結構觀測結果（HE×200）Fig.1 Observation results of renal structure of rats in each group by optical microscope（HE×200）

圖2 光鏡下各組大鼠腎臟結構觀測結果（PASM×400）Fig.2 Observation results of renal structure of rats in each group by optical microscope（PASM×400）

圖3 電鏡下各組大鼠腎組織觀測結果（EM×8 000）Fig.3 Observation results of renal structure of rats in each group by electron microscope（EM×8 000）

圖4 免疫熒光下各組大鼠腎組織觀測結果Fig.4 Observation results of renal tissue of rats in each group under immunofluorescence

2.5 腎功能檢測結果

各組大鼠的BUN、Scr結果無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），即腎臟損害程度未引起腎臟濾過功能變化.

表2 各組大鼠間Scr和BUN的比較Table 2 Comparison of Scr and BUN in rats of each group

2.6 各組大鼠24 h-UTP結果

治療前，與正常組比較，造模組各組24 h-UTP顯著增高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.治療后（第13周末），模型組大鼠24-UTP較正常組顯著升高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；中藥組、貝那普利組24 h-UTP顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.同時，中藥組與貝那普利組相比，24 h-UTP減少程度更明顯，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.

表3 各組大鼠間24h-UTP的變化Table 3 The changes of 24 hours urinary total protein in rats of each group）/mg

表3 各組大鼠間24h-UTP的變化Table 3 The changes of 24 hours urinary total protein in rats of each group）/mg

1）與正常組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.01；3）與貝那普利組比較，P＜0.05.1）Compared with normal group，P＜0.01；2）Compared with model group，P＜0.01；3）Compared with benazepril group，P＜0.05.

2.7 RT-PCR法觀察在腎組織中IL-4、miRNA-148b的mRNA表達檢測結果

治療前，造模組較正常組IL-4、miRNA-148b的mRNA表達顯著增多，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.治療后，中藥組、貝那普利組與模型組相比，IL-4、miRNA-148b的mRNA表達明顯減少，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.中藥組與貝那普利組相比，中藥組IL-4、miRNA-148b的mRNA表達低于貝那普利組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.

表4 RT-PCR檢測大鼠腎組織中miRNA-148b和IL-4的mRNA表達Table 4 The mRNA Expression of miRNA-148b and IL-4 in each group by RT-PCR（）

表4 RT-PCR檢測大鼠腎組織中miRNA-148b和IL-4的mRNA表達Table 4 The mRNA Expression of miRNA-148b and IL-4 in each group by RT-PCR（）

1）與正常組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.01；3）與貝那普利組比較，P＜0.05.1）Compared with normal group，P＜0.01；2）Compared with model group，P＜0.01；3）Compared with benazepril group，P＜0.05.

2.8 ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-4的表達檢測結果

治療前，造模組較正常組血清中IL-4含量明顯增高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.治療后（第13周末），中藥組、貝那普利組血清中IL-4含量較模型組明顯降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.中藥組與貝那普利組相比，血清IL-4含量更低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）.結果與RT-PCR檢測結果一致.

圖5 ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-4的表達Fig.5 Expression of IL-4 in each group by Elisa

3 討論

IgAN經(jīng)常在兒童、青少年和年輕人中出現(xiàn)，常表現(xiàn)為無痛肉眼血尿，無癥狀的蛋白尿，常與上呼吸道感染并發(fā)，或隨之加重.其被認為是一種自身免疫性疾病，循環(huán)中產(chǎn)生的一些免疫復合物未能被正常的清除，沉積在腎小球膜中，引起腎小球損傷，但誘使IgAN的發(fā)病原因尚不明確.在目前所研究的諸多機制中，產(chǎn)生IgA1的細胞分泌出一部分致半乳糖缺陷的Gd-IgA1（galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1），其在IgAN發(fā)病的過程中的重要作用被廣泛認可.

Gd-IgA1的產(chǎn)生在IgA1的鉸鏈區(qū)轉錄后逐步完成，N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）鏈接到絲氨酸或蘇氨酸的氧原子上后，形成O-鏈接，在C1GalT1及其分子伴侶Cosmc（core1 β3 galactosyltransferase，C1GalT1C1；由C1GALT1C1基因編碼）的催化作用下將半乳糖（galactose，Gal）鏈接到GalNAc上，最終通過唾液酸酶將GalNAc添加到每個聚糖中.IL-4是由活化的T細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞產(chǎn)生的多效細胞因子，由Th2細胞分泌，可促進、誘導Th2細胞和B細胞分化，并促使分泌IgA的細胞增殖、分化，從而產(chǎn)生更多的IgA1.Suzuki等［8-9］實驗證實IL-4的過度表達可以使C1GalT1和C1GalT1C1表達減低，從而增加Gd-IgA1的產(chǎn)生，加重IgAN病情；Serino等［10］研究證實miR-148b表達與C1GALT1表達呈負相關，并通過反向實驗證實miR-148b為IgAN的特異性指標，較高的miR-148b水平是IgAN的典型特征，且靶向抑制C1GALT1的表達，這是導致IgAN患者基因活性降低的原因，但不會影響其分子伴侶Cosmc的表達.C1GalT1被認為直接參與IgAN，是IgAN的主要遺傳決定因素［11］，miR-148b及IL-4的過度表達可能為C1GALT1功能下降的基礎，從而促使IgAN的發(fā)?。?2］.

IgAN的發(fā)展與尿蛋白的不斷流失有重要的關系，蛋白尿的定量是IgA腎病最重要的預后因子，有證據(jù)表明，近端小管是IgAN損傷的直接靶點，因此，IgAN患者出現(xiàn)蛋白尿可能同時反映了腎小球損傷和近端小管損傷，分別導致腎小球濾過增加和腎小管重吸收減少［13］.本研究RT-PCR及ELISA檢測結果顯示，與模型組相比較，中藥組及貝那普利組大鼠腎組織中miRNA-148b及血清中IL-4的表達活性降低，且中藥組療效更優(yōu)，中藥與貝那普利干預治療后趨向變化與尿蛋白的好轉程度相對一致，說明miRNA-148b和IL-4的降低減輕了腎臟的損害.Nielsen等［14］研究指出，腎臟miRNA-148b的表達與IgAN 中巨蛋白mRNA水平獨立相關，miRNA-148b水平高的患者近端小管巨蛋白的表達明顯低于低水平的患者，而巨蛋白及其共受體cubicin介導了幾乎所有濾過蛋白的近端小管攝取，在近端小管細胞的頂膜中高度表達，對腎小管濾過的蛋白質(zhì)、激素和維生素的回收具有重要的作用，巨蛋白功能受損由腎小管損傷導致，也與miRNA-148b的升高有關.本研究結果同樣證明了miRNA-148b與腎臟損害的正相關性.同時意味著通利三焦、清熱利濕方作用于IgAN大鼠有較為積極的治療作用.

中醫(yī)學認為，IgAN其纏綿難愈的特點與人體多個臟腑功能失調(diào)密切相關，童少伯教授曾提出，腎臟相關疾病的發(fā)生多責之于肺脾腎三臟，同時，三焦作為水氣運行通道，與本病不無關聯(lián)［15］.本病為自身免疫缺陷性疾病，即中醫(yī)學所講之正氣不足，其始發(fā)多由脾腎兩臟氣血津液均虧，此為其本虛之病機，隨之三焦不通，濕濁、瘀血等病理產(chǎn)物滋生，久之濕與瘀內(nèi)結，化生內(nèi)熱，不通之象更甚，此為其標實之候，亦為本病進展的繼發(fā)性因素.外邪侵襲導致三焦樞機不利，水谷失于運化，精微不循常路，故血液及精微物質(zhì)隨尿排出，出現(xiàn)血尿、蛋白尿，為本病較為明顯臨床表現(xiàn)［16］.郭登洲教授基于三焦生理特性與本病的聯(lián)系，立足社會發(fā)展現(xiàn)代人體質(zhì)的改變，認為本病病機可歸于“邪阻三焦、濕熱內(nèi)蘊”，經(jīng)過大量臨床試驗及觀察，自擬通利三焦、清熱利濕方，由僵蠶、蟬蛻、茯苓、土茯苓、桔梗、川芎共6味中藥組成，是以僵蠶、蟬蛻、桔梗為宣通上焦之品，宣開上焦之氣，氣暢則濕祛；以茯苓健中焦，健脾滲濕；以土茯苓通利下焦?jié)駸?，解毒除濕；川芎行一身之血氣，溫通三焦，六藥合用升降相濟，共奏通利三焦，清熱利濕之?僵蠶、蟬蛻為臨床常見中藥對，基于現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，此兩味藥均有抑菌、抗凝血的作用［17-18］，兩藥合用能夠有效減少腎臟感染性疾病的發(fā)生，疏通腎絡，減輕腎脈瘀阻，其中，蟬蛻所含主要化學成分對乙酰多巴胺二聚體化合物可改善血液中脂質(zhì)的代謝，從而降低尿蛋白排泄［19］.桔梗載藥上行，與以上二藥同用可加強其宣暢上焦之功，并且其有效成分皂苷可增強其他藥物的氧化吸收［20］.茯苓與桔梗同有提高機體免疫力的作用，以茯苓為主要成分的水煎劑已被證實有較顯著的清熱利尿作用［21］，全方以升清降濁，散風清熱，通利三焦之意，對IgAN出現(xiàn)腎性水腫的患者有緩解作用，在臨床中可使患者尿蛋白減少，腎功能損傷延緩，生活質(zhì)量得到改善.邊東等［22］認為IgAN以“濕熱致病”為本，經(jīng)過臨床試驗觀察證明通利三焦、清熱利濕方加減對癥治療可明顯降低患者24 h尿蛋白定量與尿紅細胞計數(shù).楊楠等［23］的動物實驗研究結果表明，通利三焦、清熱利濕方加減可顯著降低IgAN大鼠腎組織IL-13、IL-4 mRNA的表達，減少血清CIC的分泌，從而延緩IgAN發(fā)展，有效保護腎功能.本研究以確切的臨床療效為基礎，通過IgAN大鼠模型進一步探討分析發(fā)現(xiàn)，疏利三焦、清熱祛濕方可抑制IL-4、miRNA-148b的表達，減少IgA1分泌細胞的生成，降低C1GalT1的表達抑制，削減Gd-IgA1的合成，繼而使腎小球系膜區(qū)以IgA為主的免疫復合物沉積減少，延緩腎功能惡化.低水平的miRNA-148b可使巨蛋白表達升高，恢復腎小管攝取蛋白的能力，減少尿液中白蛋白的流失.

綜上所述，通利三焦、清熱利濕方可減少尿蛋白，緩解腎臟損傷程度，其延緩本病進展的機制或與抑制miRNA-148b在腎組織中的表達，減少血清中IL-4的水平有關.中藥治病的特點為多途徑、多靶點，本方是否通過其他途徑治療IgAN，還需進一步的研究.