羅翰，舒?zhèn)チ?，蔡川，陳艷，褚曉凡*

（1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東深圳 518110；2.中國科學院深圳先進技術研究院微納系統(tǒng)與仿生醫(yī)學研究中心，廣東深圳 518055；3.香港大學深圳醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東深圳 518053）

神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）這一概念首先由Lo等［1］提出，神經(jīng)血管單元其基本組成單位由神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細胞-周細胞-血管構成，包括神經(jīng)元（neurons）、腦微血管內(nèi)皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）、星形膠質(zhì)細胞（astrocytes）、周細胞（pericytes）、小膠質(zhì)細胞等功能細胞類型和細胞外基質(zhì).神經(jīng)血管單元各組分間的細胞-細胞間信號傳導、神經(jīng)血管偶聯(lián)、血流動力學作用、血腦屏障調(diào)節(jié)等機制是保證神經(jīng)元功能和正常腦血流的結構基礎.此概念旨在將神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和腦微血管內(nèi)皮細胞等功能細胞和其他輔助成分作為一個整體單元，模擬在體生理狀態(tài)下的微環(huán)境，研究各功能細胞之間的相互作用，探索幾種要素細胞和信號分子間的相互聯(lián)系及相互影響，整體研究神經(jīng)細胞的損傷及保護機制［2］.

目前國內(nèi)外神經(jīng)血管單元共培養(yǎng)模型多由利用Transwell培養(yǎng)小室為媒介建立體外“血腦屏障”的模型演變而來［3］，但其缺少部分要素細胞直接接觸，因此很難真實模擬神經(jīng)血管單元生理結構和功能，具有一定局限性［4］.本研究旨在設計一種能夠在同一平面內(nèi)實現(xiàn)神經(jīng)血管單元中以星形膠質(zhì)細胞作為中間橋梁，連接神經(jīng)元和腦微血管內(nèi)皮細胞的新型細胞共培養(yǎng)微流控芯片，更科學地在體外展現(xiàn)腦內(nèi)神經(jīng)血管網(wǎng)絡，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎和臨床研究提供一個更好的技術平臺.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗設備

深紫外光刻機URE-2000/35、恒溫加熱臺CMAG HP7、超純水系統(tǒng)MILLI-Q Reference、超純水系統(tǒng)MILLI-Q BIOCEL、正置顯微鏡Ci-S、CKX41倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡IX71、表面輪廓儀Alpha-step D100、等離子清洗機PDC-M、倒置顯微鏡IX71、DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱、生物凈化工作臺BCM-1000型、YXQ-LS-SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器、注射泵、電熱恒溫水浴鍋等均由中國科學院深圳先進技術研究院醫(yī)工所實驗室共享.

1.1.2 實驗試劑

SU 8 3010、SU 8 3035、SU 8 Developer顯影液購自 Microchem 公司，三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS）、SYLGARD 184聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）購自Dow coring公司，RTV 615購自美國邁圖公司，分析純濃硫酸、質(zhì)量分數(shù)30%過氧化氫、丙酮、無水乙醇均購自上海凌峰化學試劑有限公司，高糖DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27因子、L-谷氨酰胺、胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、Hank's平衡鹽溶（Hank's balanced salt solution，HBSS）、不含EDTA的0.25%胰酶、0.25%胰酶-EDTA、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）均購自Gibco公司，多聚-D-賴氨酸購自Sigma公司，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）購自Hyclone公司，青霉素/鏈霉素（penicillinstreptomycin，PS）購自Life公司.

1.1.3 實驗耗材

微量加樣器（10μL、100μL、200μL、1 000 μL）、細胞培養(yǎng)瓶（25 cm2、75 cm2）、細胞培養(yǎng)皿（60 mm×15 mm、100 mm×20 mm）、離心管（15 mL、50 mL）均購自康寧公司，0.22μm濾芯購自Biocomma公司，注射器（1 mL、5 mL）購自青島康杰偉業(yè)醫(yī)療器械有限公司，顏料（紅色、藍色）購自深圳化試科技有限公司.

1.1.4 實驗細胞

原代大腦皮層神經(jīng)元、傳代培養(yǎng)大腦皮層星形膠質(zhì)細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞（bEnd.3細胞系）均購自ATCC細胞庫.

1.2 方法

1.2.1 光刻制備芯片模板

芯片模板的實驗參數(shù)以及具體操作過程如下：

（1）硅片預處理 分別取分析用純濃硫酸140 mL和質(zhì)量分數(shù)為30%過氧化氫60 mL配成混合溶液.將硅片置于其中，120℃加熱2 h.用超純水將硅片洗凈，放入含有丙酮的平皿中，超聲處理10 min.最后洗凈丙酮，吹干硅片備用.

（2）旋涂 雙層結構的模板需要甩兩層光刻膠.第1層結構高度為10μm，將SU8 3010倒在硅片上，500～700 r/min處理15 s，再以3 500 r/min處理30 s.

（3）前烘 先將硅片以65℃加熱1～2 min，再以95℃加熱3～5 min.

（4）曝光 將打印有微柱結構的菲林掩膜板置于硅片上，通過氮氣和真空泵固定光刻平臺和掩膜板，并采用UV光源，曝光10 s.

（5）后烘 曝光后，光刻膠以95℃加熱30 min后烘，使加速曝光區(qū)域的光刻膠互相交聯(lián)固化，避免被顯影液洗脫.

（6）再旋涂 甩第2層光刻膠，因芯片總高度為45μm，則第2層結構高度為35～40μm.將SU8 3035倒在硅片上，以500～700 r/min處理15 s，再以3 000 r/min處理30 s.

（7）再前烘 將旋涂光刻膠的硅片以65℃加熱1～2 min，再以95℃加熱3～5 min，進行前烘處理.

（8）對齊 將打印有3通道的菲林掩膜板置于硅片上，通過氮氣和真空泵固定光刻平臺，在顯微鏡下將微柱結構與通道進行對齊，保證微柱能夠正好貫通3條流道而不出現(xiàn)側移、傾斜或者錯位，UV光源曝光10 s.

（9）再后烘 曝光后，將光刻膠以95℃加熱30 min.

（10）顯影 將芯片模板放入干凈的平皿中，倒入適量的SU 8 Developer顯影液.使整個芯片模板充分均勻的顯影.用鑷子將芯片模板撈出，用干凈的顯影液沖去殘余的光刻膠.用無水乙醇將顯影液沖洗干凈.超純氮氣吹干模板，顯微鏡下觀察光刻效果.

（11）堅膜 光刻成功的芯片模板，150℃烘烤30～120 min進行堅膜處理.

（12）測量高度 使用表面輪廓儀測量模板的高度，每個芯片選擇5個位置測量，計算平均高度作為芯片模板的高度.選擇總高度約為45μm的芯片模板進行后續(xù)試驗.

（13）防粘處理 將制備好的芯片模板放在一個干凈的平皿中，滴入3滴TMCS，室溫下熏蒸5 min.

1.2.2 神經(jīng)血管單元共培養(yǎng)芯片的實驗參數(shù)與操作過程

（1）取分析純濃硫酸140 mL和質(zhì)量分數(shù)為30%過氧化氫60 mL配成混合溶液.將載玻片置于其中，120℃加熱30 min.取出處理好的載玻片，用超純水將載玻片洗凈，吹干載玻片備用.

（2）取攪拌杯，稱量SYLGARD 184 PDMS B 5 g，SYLGARD 184 PDMSA 50 g，最終配比為mA膠∶mB膠＝10∶1.

（3）將含有A、B膠的攪拌杯子，放入勻膠機中配平.先以低轉速運行2 min，將A、B膠混勻，再以高轉速運行2 min，排除PDMS中的氣泡.

（4）將芯片模板放入到大小適宜的培養(yǎng)皿中，倒入配好的PDMS.

（5）將含有PDMS的培養(yǎng)皿放入一個密閉裝置中，用真空泵抽取真空，使PDMS中的氣泡排出到PDMS表面，整個過程需要10～20 min.

（6）用洗耳球吹去表面的氣泡，放入80℃烤箱中，烘烤30 min.

（7）從烤箱中取出已經(jīng)完全固化的PDMS，用手術刀切出相應的形狀和大小.

（8）選擇直徑0.75 mm的打孔器打孔，用不粘膠粘去除打孔位置附近和孔中因打孔而產(chǎn)生的PDMS碎屑.

（9）將打好孔的芯片與已經(jīng)清洗好的載玻片一起放入等離子清洗機中處理20 s～1 min.

（10）將芯片與載玻片封接在一起，放入80℃鼓風干燥箱中，烘烤2 h或者過夜.

圖1 神經(jīng)血管單元共培養(yǎng)芯片制作工藝Fig.1 The manufacturing process of NVU chip

1.2.3 進樣流速的表征

取制作好的芯片，排除氣泡后，連接注射器與注射泵，便于控制進樣液體流速.兩側的流道分別為A、C，以相同的流速通入含紅色顏料的液體；中間的流道B，以一定的流速通入含藍色顏料的液體（圖2）.當含兩種不同顏料的液體分別在各自的流道中流動而對相鄰的流道顏料無明顯干擾時，記錄流速比值.

圖2 進樣流速的表征裝置Fig.2 Characterization device of injecting velocity

1.2.4 芯片內(nèi)培養(yǎng)神經(jīng)血管單元3種要素細胞

本研究所建立的模型，以星形膠質(zhì)細胞為橋梁，使神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和腦微血管內(nèi)皮細胞在同一平面內(nèi)實現(xiàn)肩并肩接觸生長.如圖3所示：中間的主流道接種星型膠質(zhì)細胞，左側的主流道接種神經(jīng)元，右側的主流道接種腦微血管內(nèi)皮細胞，中間的主流道與兩側主流道之間通過10μm的孔徑連通，實現(xiàn)3種要素細胞間的直接聯(lián)系.該芯片通過注射泵控制3條主流道中液體流速，使3種要素細胞分別接受各自所需的培養(yǎng)基.

圖3 神經(jīng)血管單元3種要素細胞培養(yǎng)模式圖Fig.3 Tri-culture model diagram of three component cells of the neurovascular unit

培養(yǎng)方法：

（1）如前所述，制備神經(jīng)血管單元三細胞共培養(yǎng)芯片，并對芯片進行預處理，排除芯片內(nèi)的氣泡，并提前半小時使用多聚賴氨酸對芯片進行包被.

（2）在A通道接種已經(jīng)過鑒定的神經(jīng)元細胞，細胞密度為（5～10）×106/mL，使用Neuronbasal＋B27＋1%PS＋L-glutamine培養(yǎng)基.

（3）在B通道接種已經(jīng)過鑒定的星形膠質(zhì)細胞，細胞密度為（3～8）×105/mL，使用DMEM＋10%FBS＋1%PS培養(yǎng)基.

（4）在C通道接種已經(jīng)過鑒定的腦微血管內(nèi)皮細胞，細胞密度為（1～5）×105/mL，使用DMEM ＋10%FBS＋1%PS培養(yǎng)基.

（5）當細胞貼壁后，用微量注射泵進行換液，神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細胞-腦微血管內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)4 d后進行觀察.

2 結果

2.1 芯片結構圖的設計參數(shù)

芯片主體結構是雙層結構，本研究設計3個主流道分別接種神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞，每個主流道設計2個進樣孔，并使6個進樣孔內(nèi)切于圓（圖3）.芯片內(nèi)3個主流道的長度均為1 cm，高度均為45μm，中間接種星形膠質(zhì)細胞的主流道的寬度為570μm，兩側接種神經(jīng)元或腦微血管內(nèi)皮細胞的主流道的寬度均為500μm，流道間微柱的長度均為30μm，寬度均為10μm，微柱的高度均為10μm，微柱之間的間距均為15μm，便于3種要素細胞在培養(yǎng)過程中可以進行肩并肩直接接觸生長和信號交流.AutoCAD 2010制作芯片結構圖（圖4、5）.

圖4 神經(jīng)血管單元共培養(yǎng)芯片俯視圖Fig.4 Top view of NVU chip

圖5 神經(jīng)血管單元共培養(yǎng)芯片側視圖Fig.5 Side view of NVU chip

2.2 微流控芯片渲染圖和實物圖

芯片的3個培養(yǎng)室，分別培養(yǎng)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞，培養(yǎng)室之間通過10μm的孔徑連通，便于3種要素細胞在培養(yǎng)過程中直接接觸生長和細胞間信號交流（圖6、7）.

圖6 神經(jīng)血管單元共培養(yǎng)芯片3D渲染圖Fig.6 3D illustration of NVU chip

圖7 神經(jīng)血管單元共培養(yǎng)芯片實物圖Fig.7 The fabricated microfluidic chip for NVU

2.3 不同培養(yǎng)基的進樣流速

當含兩種不同顏料的液體分別在各自的流道中流動而對相鄰的流道顏料無明顯干擾時，記錄流速比值VA∶VB∶VC＝5∶6∶5.之后的實驗過程中，在不同的流道中加入培養(yǎng)基或者試劑時，均以上述的流速比進行進樣（圖8）.

圖8 顯微鏡下觀察進樣流速情況Fig.8 Observing the injecting velocity under the microscope

2.4 芯片內(nèi)神經(jīng)血管單元三細胞共培養(yǎng)生長狀態(tài)

顯微鏡下觀察神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細胞-腦微血管內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)4 d后的生長狀態(tài)，神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞背靠背緊貼生長，星型膠質(zhì)細胞和腦微血管內(nèi)皮細胞密切接觸（圖9）.

圖9 光鏡明場下觀察神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細胞-腦微血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)4 d后的生長狀態(tài)Fig.9 The growth status of neurons，astrocytes，and bEnd.3 tri-cultured for 4 days under the microscope

3 討論

3.1 制備神經(jīng)血管單元三細胞共培養(yǎng)微流控芯片的必要性

自從神經(jīng)血管單元的概念提出后，科研工作者便熱衷于研究神經(jīng)血管單元中神經(jīng)細胞、支持細胞和細胞外基質(zhì)等共同參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的損傷和修復過程［5］.此外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的另一個重要特點是形成血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），因此神經(jīng)血管單元模型理論上還包括血腦屏障的體外構建.目前多數(shù)學者認為經(jīng)典的血腦屏障由腦微血管內(nèi)皮細胞及其細胞間的緊密連接、細胞外基質(zhì)和星形膠質(zhì)細胞終足構成［6］，也有部分學者認為周細胞等支持細胞參與其中［7］，因此，有學者對利用芯片構建仿人體的神經(jīng)血管網(wǎng)絡來模擬人體的生理狀態(tài)、疾病的發(fā)病機制提出了一些設想［4］.本研究設計的神經(jīng)血管單元共培養(yǎng)微流控芯片，對構建新型的神經(jīng)血管單元共培養(yǎng)模型，研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理機制、新型神經(jīng)保護藥物的研發(fā)以及藥物血腦屏障通透性篩選等均有重大意義.

3.2 神經(jīng)血管單元三細胞共培養(yǎng)微流控芯片的優(yōu)勢

3.2.1 微流控芯片較傳統(tǒng)培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或共培養(yǎng)小室的優(yōu)勢

眾所周知，目前國內(nèi)外所構建的神經(jīng)血管單元體外共培養(yǎng)模型，多數(shù)借鑒Transwell細胞小室的血腦屏障體外模型，從構建方式、研究方法到評估體系，均難以擺脫血腦屏障體外模型的束縛，無法重現(xiàn)神經(jīng)血管網(wǎng)絡的重要性，目前研究尚不成熟（圖10）［8］.早在30年前，星形膠質(zhì)細胞已用作與腦微血管內(nèi)皮細胞進行共培養(yǎng)模擬血腦屏障［9］.不久之后，神經(jīng)元作為第2種功能細胞引入共培養(yǎng)體系，在Transwell板底進行生長，與星形膠質(zhì)細胞共用培養(yǎng)基，而腦微血管內(nèi)皮細胞通過半透膜與星形膠質(zhì)細胞背靠背生長［10］.近年來，許多研究小組將周細胞作為另一種功能細胞引入共培養(yǎng)體系，用于血腦屏障的藥物通透性或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理機制的研究［11］.本研究利用微流控芯片技術構建腦微血管內(nèi)皮細胞-星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元體外三細胞共培養(yǎng)的模型目前暫未納入周細胞，因其為血腦屏障支持細胞，與神經(jīng)元之間的直接聯(lián)系作用相對較小.眾多研究表明，多細胞共培養(yǎng)模型較單種腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)模型或雙細胞共培養(yǎng)血腦屏障體外模型擁有更強的屏障功能，且能增加緊密連接的表達［12］.腦微血管內(nèi)皮細胞可以通過調(diào)控腦微循環(huán)，運送營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，并通過血腦屏障作用，使神經(jīng)血管單元各組分免受炎癥因子、代謝產(chǎn)物以及藥物的影響［13］.星形膠質(zhì)細胞則在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、神經(jīng)遞質(zhì)的信號傳導以及腦血流和代謝的調(diào)控等方面具有重要作用，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和微血管之間的細胞信號傳導有助于神經(jīng)血管單元的修復［14］.雖然，三細胞共培養(yǎng)或四細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)條件苛刻，體外模型構建亦困難，但是只有這樣才能無限接近體內(nèi)神經(jīng)血管網(wǎng)絡的真實特征.

圖10 利用Transwell小室構建神經(jīng)血管單元體外模型的演變過程Fig.10 From mono to multi cultures approaches on Transwell platforms

綜上所述，無論在模擬腦內(nèi)神經(jīng)血管網(wǎng)絡、模擬血腦屏障功能，還是研究神經(jīng)血管單元細胞間的信號傳導與調(diào)控，三細胞共培養(yǎng)較單種細胞培養(yǎng)均具有較大的優(yōu)勢.然而在Transwell共培養(yǎng)小室中，星型膠質(zhì)細胞接種于半透膜的背面，既無法與板底的神經(jīng)元（或者周細胞）實現(xiàn)直接聯(lián)系，又難以避免與神經(jīng)元（或者周細胞）共用培養(yǎng)基.星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元雖然均由神經(jīng)干細胞分化而來，但它們在體內(nèi)的生理功能并不一樣，所處的內(nèi)環(huán)境也并不完全相同.在細胞培養(yǎng)的過程中，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)基有所區(qū)別，培養(yǎng)基的組分和添加因子也存在較大差異.因而Transwell培養(yǎng)小室可能存在這方面的局限性，使實驗結果出現(xiàn)較大偏倚，難以與臨床結論相互轉化.因此，本研究嘗試設計新型微流控芯片，在芯片內(nèi)實現(xiàn)神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細胞-腦微血管內(nèi)皮細胞3種要素細胞以星形膠質(zhì)細胞為橋梁直接接觸共培養(yǎng)，既能使神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞接受各自的培養(yǎng)基，在各自的細胞小室中生長，又能通過10μm的微孔實現(xiàn)細胞間的直接聯(lián)系，而且可以在各自的培養(yǎng)過程中加以細胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)、藥物及其代謝產(chǎn)物等可控的干預因素，通過設置不同的對照組，觀察其對神經(jīng)血管單元中單種細胞的影響以及神經(jīng)血管單元各要素細胞間和重要成分間的相互作用.

3.2.2 微流控芯片較靜態(tài)細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢

卒中、高血壓、動脈粥樣硬化、血管夾層等疾病均可因血流動力學改變引起缺血再灌注損傷或血腦屏障的破壞，因此，模擬體內(nèi)微環(huán)境還需加以一定的生理剪切應力.生理剪切應力不僅調(diào)節(jié)腦微血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)，也參與體內(nèi)的信號傳導和病理生理反應［15］.腦微血管內(nèi)皮細胞表面存在離子通道、整合素、G蛋白等生物感受器，可將流體產(chǎn)生的生理剪切應力轉化為生物信號，從而激活細胞外信號調(diào)節(jié)因子，調(diào)控腦微血管內(nèi)皮細胞的生理功能［16］.

與傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶或者六孔板靜態(tài)單種培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞的模型以及Transwell小室靜態(tài)培養(yǎng)神經(jīng)血管單元3種要素細胞的模型相比，模擬神經(jīng)血管單元的所處生理微環(huán)境下相應的剪切應力是微流控技術的一項巨大優(yōu)勢.本研究的模型可以利用注射泵在各流道附加可以調(diào)控的流速，形成腦微血管內(nèi)皮細胞生理環(huán)境所需的剪切應力，而且可以研究卒中或高血壓等疾病的發(fā)病過程中血管狹窄或血流改變對神經(jīng)元損傷以及機體的代償方式，分析該種情況下細胞間的信號傳導和調(diào)控方式.同時，泵控培養(yǎng)基可以帶走活力低下或凋亡的細胞，確保貼壁生長的細胞均具有良好的細胞活力.

3.2.3 較現(xiàn)有神經(jīng)血管單元微流控芯片的優(yōu)勢

近年來，神經(jīng)血管單元體外模型都趨向于一個共同的目標，在簡便、小巧的基礎上，越來越接近神經(jīng)血管單元的生理微環(huán)境.許多模擬神經(jīng)血管單元的微流控芯片都是利用聚碳酸酯材料（polycarbonate，PC）、聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）和載玻片設計，通過多孔的聚碳酸酯半透膜將兩條流道連通，也有少數(shù)微流控芯片利用微柱結構連通，但多只能實現(xiàn)兩種細胞之間的相互聯(lián)系或使用不同種系的三細胞共培養(yǎng)，這里需要提及以下幾種芯片的設計：blood-brain barrier-on-a-chip （BBB-chip）［17］；microfluidic blood-brain barrier （μBBB）［18］；synthetic microvasculature blood-brain barrier（SyMBBB）［19］；neurovascular unit-on-a-Chip （NVUchip）［20］；3D neurovascular microfluidic model（3DNVC）［21］.BBB-chip、μBBB、SyM-BBB、NVU-chip等芯片均在一定程度上模擬了血腦屏障的特點，并對腦微血管內(nèi)皮細胞間的跨膜電阻（transendothelial electrical resistance，TEER）進行測定，具有一定神經(jīng)血管單元的屬性，可用于血腦屏障藥物篩選，但是這些芯片均沒有體現(xiàn)星型膠質(zhì)細胞的終足突與神經(jīng)元和腦微血管內(nèi)皮細胞之間的連接情況，側重于研究腦微血管內(nèi)皮細胞在血腦屏障中的作用，未能體現(xiàn)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞這兩種要素細胞在神經(jīng)血管單元中的重要作用［17-20］.3D-NVC模型通過芯片結構的三維設計完美模擬了腦微血管腔的組織學特點以及星型膠質(zhì)細胞為橋梁連接神經(jīng)元、腦微血管內(nèi)皮細胞的解剖學特點，但該研究采用大鼠的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和人類的腦微血管內(nèi)皮細胞系（HUVEC、hCMEC/D3），不同種系間細胞混合培養(yǎng)使其應用于生理功能、病理機制的研究可信度大大降低［21］.

本研究的芯片同樣采用雙層光刻的原理，3條主流道之間通過10μm的孔徑連通，既能實現(xiàn)3種要素細胞各自培養(yǎng)，又能實現(xiàn)以星形膠質(zhì)細胞為橋梁，通過微孔連接神經(jīng)元和腦微血管內(nèi)皮細胞，觀察3種要素細胞之間的直接聯(lián)系和信號表達，克服了BBB-chip、μBBB、SyM-BBB、NVUchip等4種模型無法觀察的以星形膠質(zhì)細胞為橋梁溝通腦微血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元的缺點，以及NVU-chip模型將神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)的缺點和3D-NVC不同種系間細胞混合培養(yǎng)的缺陷，拓展了芯片內(nèi)的細胞共培養(yǎng)技術，為這一領域的發(fā)展提供了新的見解.

3.3 神經(jīng)血管單元三細胞共培養(yǎng)微流控芯片的局限性

腦微血管的直徑僅有7～10μm，腦微血管間的間距僅有40μm［22-23］，腦微血管與神經(jīng)元的最近距離僅有10～20μm［24］.模板微柱結構的厚度要遠大于內(nèi)皮細胞間基膜的厚度，否則容易塌陷，因此芯片微孔孔徑大小仍難以滿足需要.只有同等規(guī)格神經(jīng)血管單元體外模型才能更接近體內(nèi)的結構特點，目前所公布的大部分微流控芯片均不能達到上述要求.本研究中的微流控芯片3條流道之間的距離為30μm，若用于模擬血腦屏障，可能存在一定的局限性，而且神經(jīng)元與腦微血管內(nèi)皮細胞之間的距離為630μm，遠遠大于生理結構的距離，這也是微流控研究領域的難點，對神經(jīng)血管單元體外模型的研發(fā)仍有巨大的潛力.同時，許多研究者也早已認識到無限傳代的細胞系或不同種系間細胞共培養(yǎng)的局限性［21，25］，盡管本研究采用的3種要素細胞均為同一種系，但本研究采用bEnd.3細胞系進行基礎研究，其生長特性、分化程度、培養(yǎng)所需的生理微環(huán)境，可能與原代腦微血管內(nèi)皮細胞存在差異.