林曄

非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的主要進(jìn)展形式，具有較高的肝纖維化和肝癌風(fēng)險(xiǎn)，主要病理特征包括脂肪變性、氣球樣變、肝細(xì)胞損傷、混合性炎細(xì)胞浸潤和不同程度的纖維化[1-2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常參與NASH 的起病與進(jìn)展，炎癥小體在炎癥以及纖維化進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用[3-6]。本研究旨在明確NLRP3 介導(dǎo)線粒體損傷在NASH 中的作用機(jī)制，以及具有線粒體保護(hù)作用的線粒體靶向抗氧化肽SS-31 對NLRP3 信號通路的作用以及對NASH 的影響，以尋求干預(yù)NASH的有效藥，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選擇健康8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠共30 只，體重150～180 g，平均（171.33±10.12）g，購自中國科學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心。SS-31（廣州天源生物科技有限公司）、HE 染液（上海莼試生物技術(shù)有限公司）、Caspase-1 一抗、IL-1β 一抗、IL-18一抗、Caspase-1 二抗、IL-1β 二抗、IL-18 二抗（均購自美國Abcam 公司）、DAB 顯色液（廣州鼎國生物技術(shù)有限公司）、蘇木素（成都格利普生物科技有限公司）、Trizol 試劑（深圳時(shí)代生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建NASH 模型 采用膽堿-蛋氨酸缺乏（MCD）飼料喂養(yǎng)法，連續(xù)喂養(yǎng)8 周，脫頸法處死獲得肝臟組織，HE 染色病理觀察肝臟出現(xiàn)脂肪變、炎癥浸潤和纖維化，符合NASH 病理改變?yōu)樵炷３晒Α?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和觀察指標(biāo) 30 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和干預(yù)組，每組10 只。對照組正常飲食喂養(yǎng)，模型組和干預(yù)組采用MCD 飼料喂養(yǎng)。干預(yù)組腹腔注射SS-31 3 mg/kg，1 次/周；對照組注射等量0.9%氯化鈉溶液，共持續(xù)喂養(yǎng)8 周。觀察各組小鼠體重，使用生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量；HE 染色觀察肝臟組織病理變化；實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）法檢測肝臟線粒體損傷指標(biāo)，包括ATPase-6 和細(xì)胞色素C 基因表達(dá)量；改良氧電極法測定線粒體呼吸控制率（RCR）與線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）活性；免疫組化染色檢測肝臟NLRP3 表達(dá)量；Western blot 法檢測肝臟Caspase-1、白介素（IL-1β）和IL-18 表達(dá)水平。

1.2.3 免疫組化染色 肝臟組織石蠟切片厚度4 μm，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后滴加兔抗鼠NLRP3 抗體（工作濃度1︰2 000）置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，以正常小鼠IgG 作為陰性對照；PBS 洗滌后滴加羊抗兔抗體（工作濃度1︰500）置于濕盒中27 ℃孵育20 min；PBS 洗滌后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液置于濕盒中27 ℃孵育20 min；PBS 洗滌、DAB 顯色、蘇木素復(fù)染等操作，于光學(xué)顯微鏡下觀察，采用半定量法，計(jì)算黃染陽性細(xì)胞百分比。

1.2.4 RT-PCR 法 Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，測定濃度后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒提示合成cDNA，設(shè)計(jì)引物序列，ATPase-6：上游5’-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3’，下 游5’-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3’；細(xì)胞色素C：上游5’-ACTACTTCTCCCGCCGCTAC-3’，下游5’-GAAATCAAACAGAGGCCGCATG-3’；內(nèi)參U6：上游5’-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3’，下游：5’-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3’。根據(jù)反應(yīng)試劑盒提示配置反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)參數(shù)，ATPase-6 和細(xì)胞色素C 基因表達(dá)量結(jié)果以2-⊿⊿Ct法表示。

1.2.5 Western blot 法 組織勻漿后加RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度后使用β-actin 抗體進(jìn)行劑量標(biāo)準(zhǔn)化；取30 μg 樣品蛋白和內(nèi)參蛋白，經(jīng)8% SDS-PAGE 電泳分離，將分離區(qū)帶電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，滴加羊抗鼠Caspase-1、IL-1β 和IL-18抗體（1︰2 000）靜置過夜，PBS 洗滌后滴加兔抗羊?qū)?yīng)抗體（1︰500）室溫孵育4 h，PBS 洗滌，ECL顯色。結(jié)果行半定量分析，以樣品蛋白與內(nèi)參蛋白的電泳條帶灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（）表示，三組間比較采用單因素ANOVA 分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)2、4、8 周時(shí)體重和血清AST 和ALT 含量比較 三組小鼠均成功喂養(yǎng)8 周，無死亡。喂養(yǎng)前，三組體重、血清AST 及ALT 的含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。喂養(yǎng)2～8 周，對照組體重、血清AST 和ALT 含量的波動(dòng)幅度不顯著，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；喂養(yǎng)2～8 周，模型組小鼠體重逐漸減小，血清AST 和ALT 含量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。喂養(yǎng)2、4、8 周，干預(yù)組均體重高于模型組，而血清AST 和ALT 含量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1 和圖1。

表1 三組喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)2、4、8周時(shí)體重和血清AST和ALT含量比較（）

表1 三組喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)2、4、8周時(shí)體重和血清AST和ALT含量比較（）

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

圖1 三組喂養(yǎng)2、4、8周時(shí)體重、血清AST和ALT含量的比較

2.2 HE 染色觀察喂養(yǎng)8 周三組肝臟組織變化對照組肝臟無脂肪變，模型組出現(xiàn)不同程度的脂肪變、炎癥浸潤和纖維化，符合NASH 病理改變，造模成功；干預(yù)組上述變化較模型組減少，見圖2。

2.3 三組ATPase-6 和細(xì)胞色素C 基因表達(dá)情況比較 模型組ATPase-6 和細(xì)胞色素C 基因表達(dá)量均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組ATPase-6 和細(xì)胞色素C 基因表達(dá)量均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2與圖3。

表2 三組ATPase-6 和細(xì)胞色素C基因表達(dá)（）

表2 三組ATPase-6 和細(xì)胞色素C基因表達(dá)（）

2.4 三組線粒體RCR 和SDH 活性比較 模型組線粒體RCR 高于對照組，而SDH 活性低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組線粒體RCR 低于模型組，而SDH 活性高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3 和圖4。

表3 隨著線粒體RCR和SDH活性比較（）

表3 隨著線粒體RCR和SDH活性比較（）

圖2 HE染色觀察喂養(yǎng)8周三組肝臟組織變化（100×）

圖3 RT-PCR法檢測三組ATPase-6 和細(xì)胞色素C基因表達(dá)量

圖4 三組肝臟線粒體RCR和SDH活性比值

2.5 三組NLRP3 表達(dá)量比較 模型組NLRP3 陽性表達(dá)量（35.61±9.40）%高于對照組（6.92±2.32）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組NLRP3 陽性表達(dá)量（16.72±5.51）%低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5、6。

圖5 免疫組化染色檢測三組NLRP3陽性表達(dá)（400×，箭頭指NLRP3）

圖6 三組NLRP3表達(dá)量比較

2.6 三組Caspase-1、IL-1β 和IL-18 表達(dá)比較 模型組Caspase-1、IL-1β 和IL-18 表達(dá)水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)組Caspase-1、IL-1β 和IL-18 表達(dá)水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4 和圖7。

表4 三組Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)水平比較（）

表4 三組Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)水平比較（）

圖7 Western blot法檢測三組肝臟組織Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)水平

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，非甘油脂肪酸代謝產(chǎn)物在脂毒性和NASH 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，代謝相關(guān)氧化應(yīng)激、自噬、炎癥被認(rèn)為是NASH 進(jìn)展的重要標(biāo)志[7-8]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長，模型組體重逐漸減小，血清AST 和ALT 含量升高，同時(shí)間點(diǎn)比較，干預(yù)組體重高于模型組，而血清AST 和ALT含量低于模型組，干預(yù)組ATPase-6、細(xì)胞色素C基因表達(dá)量、線粒體RCR 與NLRP3 陽性表達(dá)量均低于模型組，而SDH 活性高于模型組（P＜0.05）；干預(yù)組Caspase-1、IL-1β 和IL-18 表達(dá)水平均低于模型組（P＜0.05）。

NAFLD 時(shí)線粒體功能降低，ATP 合成減少，ROS 消耗量減少但含量仍在增加，可能引起肝臟脂質(zhì)沉積，從而加劇肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[9-10]。具體表現(xiàn)：線粒體脂肪酸氧化為機(jī)體提供能量，氧化異常導(dǎo)致游離脂肪酸進(jìn)入肝臟含量增加，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷線粒體功能，氧化應(yīng)激加劇肝細(xì)胞損傷和凋亡，氧化應(yīng)激作為重要病理因素，是啟動(dòng)和維持NAFLD 的關(guān)鍵[11-13]。

炎癥是NASH 發(fā)生以及纖維化進(jìn)展的重要致病因素，NASH 患者體內(nèi)存在促炎和抗炎細(xì)胞因子的失衡，其中NLRP3 炎性小體激活在NASH 進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。NLRP3 炎癥小體活化機(jī)制主要有胞內(nèi)離子濃度、線粒體功能異常和溶酶體損傷三種，NLRP3 炎癥小體活化后招募并激活Caspase-1，Caspase-1 是NLRP3 炎性小體的效應(yīng)蛋白，可將無活性的促炎細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 前體剪切為成熟的IL-1 和IL-18，從而引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)[14-16]。NLRP3 炎癥小體信號通路可促進(jìn)機(jī)體由炎癥狀態(tài)向纖維化進(jìn)展。炎癥刺激下肝星狀細(xì)胞及肝細(xì)胞NLRP3 炎癥小體表達(dá)明顯升高[17]。肝損傷后IL-1表達(dá)增多，IL-1 受體缺陷可以緩解肝損傷及肝纖維化。提示IL-1 可能參與了從肝損傷到肝纖維化發(fā)生的整個(gè)過程[18]。Casepase-1 表達(dá)缺失可以緩解酒精性肝纖維化和非酒精性肝纖維化，提示Casepase-1同樣參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。臨床研究表明，肝硬化患者血清IL-18 水平明顯高于對照組，血清IL-18 水平與肝硬化患者Child-Pugh 評分及組織學(xué)損傷呈現(xiàn)正相關(guān)[19]。SS-31 是一種能夠滲入細(xì)胞并且在線粒體內(nèi)膜靶向定位聚集的小分子肽，SS-31在多種疾病中具有良好的抗氧化及抗凋亡作用[20]。

綜上所述，NLRP3 炎性小體介導(dǎo)線粒體損傷參與了NASH 的發(fā)病過程，線粒體靶向抗氧化肽SS-31 可降低NASH 肝臟NLRP3 表達(dá)，改善線粒體損傷程度。