劉莎莎， 劉 歡， 趙 楊， 申興斌

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科， 河北 承德 067000)

胃癌(gastric carcinoma)是一種起源于人體胃粘膜上皮的惡性腫瘤。目前我國(guó)男性罹患惡性腫瘤中，胃癌一直是導(dǎo)致死亡的主要原因之一[1]。與日本、韓國(guó)病例相比較：我國(guó)臨床上胃癌以中晚期多見(jiàn)(80% 以上)，5年生存率低(占35.1%)，與之早期胃癌診斷差距較大[2]，因此目前迫切需要提高胃癌早期診斷的手段。6個(gè)相同或相似的連接蛋白(Connexin CX)是細(xì)胞間隙連接(gap junction,GJ)的基本單位，組成傳遞細(xì)胞間的信號(hào)通道，傳遞細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及維持細(xì)胞正常穩(wěn)態(tài)的信號(hào)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CX共21種，在身體組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其中在胃粘膜細(xì)胞廣泛表達(dá)的有CX6、CX32、Cx43。其中Cx43與腫瘤關(guān)系最為密切。p70S6激酶(p70S6 kinase，p70S6K)是絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，是AGC家族的重要成員之一，是mTOR下游的重要靶點(diǎn)之一，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄與翻譯、細(xì)胞生長(zhǎng)周期、增殖與凋亡等[3]。在人體內(nèi)p70S6K的異常表達(dá)，可導(dǎo)致腫瘤。目前針對(duì)有關(guān)Cx43與p70S6K在胃癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究利用Western Bloting和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)Cx43及p70S6K在胃癌中的表達(dá)情況，并分析其與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料:2019年2月至9月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收集60例新鮮胃癌標(biāo)本，患者術(shù)前均未行放射治療及化學(xué)治療，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為胃腺癌。留取癌灶及正常胃黏膜組織(距癌灶至少5cm以上)放置無(wú)酶凍存管內(nèi)，迅速放置-80度冰箱保存用于WB及QRT-PCR實(shí)驗(yàn)，(本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審議通過(guò))。

1.2主要試劑:①Western Bloting試劑：兔抗人Cx43多克隆購(gòu)自杭州華安生物公司；兔抗人p70S6K 多克隆及β-antin兔單克隆抗體均購(gòu)自武漢ABcolnal公司；羊抗兔二抗購(gòu)自Redpartytech美國(guó)公司；快速SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自莊盟公司等；BCA試劑盒及ECL發(fā)光液均購(gòu)自聯(lián)科公司；RIPA購(gòu)自索萊寶公司等。電泳液、轉(zhuǎn)膜液及TBST試劑均由承德醫(yī)學(xué)院提供。②PCR試劑：提取RNA試劑盒購(gòu)自Foregene公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自武漢ABcolnal公司。引物由GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)。

1.3Western Blot 方法及結(jié)果判讀

1.3.1方法:取100mg新鮮胃癌及正常胃粘膜標(biāo)本，經(jīng)過(guò)RIPA裂解、震蕩、離心等步驟提取組織中的蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，以20ug計(jì)算出蛋白上樣量，制10%分離膠+5%濃縮膠，蛋白上樣，以80v電泳，待樣品溴酚藍(lán)至分離膠后改為120v電泳，直至所需條帶跑出。0.45μmPVDF膜甲醛激活后200mA低溫轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜好的PVDF膜放入5%脫脂奶粉孵育盒中搖勻封閉2h，加入一抗(β-actin 1∶100000、Cx43 1∶6000、p70S6K 1∶10000)搖勻2h后4℃過(guò)夜。次日，滴加二抗(1∶10000)搖勻約1h，TBST清洗，10min/次，共3～6次。將配制好的ECL發(fā)光液滴在輕度干燥的PVDF膜上，在暗室內(nèi)進(jìn)行顯影，保存所需條帶顯影。

1.3.2結(jié)果判讀:運(yùn)用ImageJ軟件測(cè)量條帶的灰度值,目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4qRT-PCR 方法及結(jié)果判讀：RNA提取純化、逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行無(wú)酶操作。結(jié)果：目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)屬于非正態(tài)分布，故應(yīng)用M(P25，P75)描述，組間比較采用獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)。非正態(tài)分布應(yīng)用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Cx43及p70S6K在不同胃組織中蛋白表達(dá)比較

2.1.1蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示：在蛋白水平，胃癌組織中Cx43及p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為M(0.39，0.98)，M(0.94，1.55)，正常胃黏膜組織中蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為M(1.62，3.80)，M(0.54，1.02)由此說(shuō)明在胃癌組織中Cx43的蛋白相對(duì)表達(dá)量低于正常胃黏膜組織，p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量則高于正常胃黏膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01，圖1)。

2.1.2qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示：在基因水平，胃癌中Cx43及p70S6K mRNA相對(duì)于正常胃粘膜組織中mRNA表達(dá)量分別為M(0.33，0.66)，M(2.14，4.14)，(均P<0.01)。由此說(shuō)明，在胃癌組織中Cx43的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常胃黏膜組織，p70S6K的mRNA相對(duì)表達(dá)量則高于正常胃黏膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01，圖2)。

2.2在胃癌中，Cx43及p70S6K蛋白和mRNA 表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系:隨著胃癌惡性程度的增加、TNM分期加重、浸潤(rùn)深度的加深及有淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，Cx43蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量呈逐漸下調(diào)趨勢(shì)，而p70S6K蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量則呈逐漸升高趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，詳見(jiàn)表1，表2)。

2.3胃癌組織中Cx43及p70S6K蛋白和mRNA表達(dá)的相關(guān)性:在蛋白水平，胃癌組織中Cx43與p70S6K蛋白的表達(dá)成負(fù)相關(guān)(r=-0.746，P<0.01)；在基因水平，Cx43與p70S6K mRNA的表達(dá)成負(fù)相關(guān)(r=-0.759，P<0.01)。

2.4胃癌組織中Cx43與p70S6K蛋白及mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，見(jiàn)表1、表2。

表1 Cx43及p70S6K蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(平均秩)

圖1 在胃癌組織和正常胃黏膜組織中Cx43 及p70S6K的蛋白表達(dá)情況

圖2 在胃癌組織和正常黏膜組織中Cx43及p70S6K mRNA的表達(dá)情況

表2 Cx43及p70S6K mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(平均值)

3 討 論

在腫瘤中Cx43是GJ的重要連接蛋白之一，其表達(dá)的下調(diào)，可導(dǎo)致GJ功能缺失或下降，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在許多腫瘤中通過(guò)上調(diào)Cx43的表達(dá)，可使GJ的功能的恢復(fù)，從而抑制腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展[4]。張立偉[5]等研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中抑制磷酸化的細(xì)胞骨架蛋白(P-Ezrin)能夠減少Cx43的磷酸化，恢復(fù)GJIC功能。本研究顯示：在胃腺癌中，分化程度越差、TNM分期越高、浸潤(rùn)胃壁越深,Cx43蛋白及mRNA的表達(dá)量均越低,這與張立偉[5]等的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明在胃癌中Cx43在基因水平及蛋白水平調(diào)控出現(xiàn)異常，并參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

P70S6K是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的主要下游作用靶物之一。在腫瘤中，p70S6K經(jīng)過(guò)磷酸化才能活化，從而發(fā)揮功能作用，促進(jìn)p70S6KmRNA翻譯活性增強(qiáng)，協(xié)同刺激癌細(xì)胞蛋白質(zhì)及核糖體合成,從而控制細(xì)胞從G1期到S期，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖。許多研究表明[6,7]，在其他腫瘤中p70S6K呈過(guò)度表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：p70S6K蛋白及mRNA 在胃癌中的表達(dá)量比正常胃粘膜組織中高，提示 p70S6K 在胃癌中高度激活。在低分化、TNM分期為III和IV期、浸潤(rùn)胃壁達(dá)深肌層伴淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，p70S6K蛋白及mRNA 表達(dá)更高，這與陳瑞紅[8]等研究一致，進(jìn)一步證實(shí)了p70S6K參與了胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，無(wú)論在蛋白水平還是基因水平，Cx43及p70S6K均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這可能是在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，Cx43在基因水平出現(xiàn)表達(dá)下降，導(dǎo)致Cx43蛋白表達(dá)下降，從而使GJ功能下降或缺如，使細(xì)胞間傳遞細(xì)胞增殖、分化的信息出現(xiàn)失控，最終導(dǎo)致 p70S6K過(guò)度激活，刺激細(xì)胞過(guò)度增殖分化，導(dǎo)致胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。由此得出結(jié)論，Cx43及p70S6K在胃癌中的異常表達(dá)，參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。推測(cè)是否可通過(guò)上調(diào)Cx43,使GJ功能恢復(fù)或增強(qiáng)，直接或間接使p70S6K在胃癌中表達(dá)下降，從而抑制胃癌的發(fā)生及發(fā)展。因此Cx43與p70S6K的聯(lián)合檢測(cè)，有望成為胃癌診斷治療的新靶點(diǎn)。