劉蘭瑞,張永強,張 原,馬 倩,趙鳳芹

(1.保定市第五醫(yī)院,河北 保定071000;2.保定市疾病預防控制中心)

目前，結(jié)核病疫情仍然居高不下，耐藥結(jié)核病的流行肆虐全球，其根源乃傳染源作祟，消除傳染源是控制結(jié)核病的關(guān)鍵[1]。而過去很長時間僅僅依靠痰涂片檢測，陽性發(fā)現(xiàn)率低。近年來，以LAMP等為代表的新診斷技術(shù)的不斷涌現(xiàn)為結(jié)核病的診斷提供了新的手段。本研究對活動性肺結(jié)核的患者痰標本分別采用Xpert MTB /RIF、LAMP、CPA技術(shù)和羅氏固體培養(yǎng)法4種在本地區(qū)常用的檢測方法進行檢測，評價4種技術(shù)在結(jié)核菌陽性檢測率方面的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2019年1-6月保定市級結(jié)核病定點醫(yī)院收治的488例活動性肺結(jié)核患者(男336 例，女152例，平均年齡42.6 歲)，每人送檢1份合格痰標本，共488份，其中涂陽標本176例，涂陰標本312例。

1.2 儀器與試劑Xpert MTB/RIF檢測儀(美國Cepheid公司)，恒溫熒光檢測儀(廣州華峰生物科技有限公司)；XpertMtb/RIF試劑盒(批號：1000147334)；、TB-LAMP 擴增試劑盒(日本榮研株式會社,批號：8Z002)；CPA檢測試劑盒(杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司，批號：20181103)；酸性羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索有限公司，批號：20181220)。

1.3 方法

1.3.1固體培養(yǎng)[2]痰標本采用NALC-NaOH前處理法，視標本性狀，加1-2倍體積的處理液于無菌痰杯中，使痰液充分液化，在20 min內(nèi)接種2支酸羅氏培養(yǎng)基。

1.3.2LAMP檢測 經(jīng)4%NaOH液痰標本預處理后12 000 r/min離心取沉淀，加DNA提取液，制備DNA模板，加入陰性對照、待檢模板和陽性對照65 ℃恒溫擴增60 min,加顯色液判讀結(jié)果，綠色為陽性，橙色為陰性。

1.3.3Xpert MTB/RIF檢測：視痰標本性狀，加入1-2 ml的Xpert MTB/RIF處理液，振蕩30 s，靜置15 min，吸取2 ml處理后的樣本加入Xpert MTB/RIF反應(yīng)試劑盒中，上機檢測自動判讀。

1.3.4CPA檢測 待檢痰標本中加4%NaOH處理后靜置20 min。取1 ml液化后痰液離心棄上清。加DNA提取液，沸水浴10 min，冷卻后取上清液備用。取試劑管，加復溶液和石蠟油，室溫靜置后加入DNA模板,瞬時離心后置恒溫設(shè)備63℃擴增60 min，置核酸檢則裝置內(nèi)檢測。判讀結(jié)果：檢測線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)，為陽性；僅出現(xiàn)質(zhì)控線，為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理使用SPSS17.0建立數(shù)據(jù)庫進行統(tǒng)計學分析,率或構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,3種分子檢測的一致性評價采用Kappa檢驗。

2 結(jié)果

XpertMTB/RIF、LAMP、CPA、固體培養(yǎng)4種檢測方法的總陽性率依次為59.84%，58.20%，56.56%，44.06%；在涂陽患者中XpertMTB/RIF、LAMP、CPA 3種分子陽性率依次為98.86%，98.30%，97.16%，高于固體培養(yǎng)法94.32%；在涂陰患者中陽性率依次為37.82%，35.58%，33.65%，高于固體培養(yǎng)法15.71%；以上差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=30.58,7.82,45.19；P<0.05)。LAMP與XpertMTB/RIF檢測的一致率為98.36%(480/488)，Kappa值=0.966；CPA與XpertMTB/RIF檢測的一致率為95.90%(468/488)，Kappa值=0.916。見表1。

表1 不同方法檢測結(jié)核分枝桿菌陽性率比較

3 討論

痰涂片染色鏡檢法及傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法是臨床結(jié)核病檢驗中應(yīng)用最普遍的方法。目前，盡管涂片和痰培養(yǎng)檢測MTB具有許多缺點，但涂片價格低廉且操作方便，固體培養(yǎng)可提供后續(xù)的藥敏試驗菌株并進行分子流行病學分析，故仍作為常規(guī)方法使用[3]。分子新診斷技術(shù)快速發(fā)展為結(jié)核菌檢驗提供了新的途徑，不僅縮短了檢測時間，而且提高了檢測效能。

病原學陽性檢出結(jié)果受多種因素影響[4]，諸如標本質(zhì)量、含菌量、檢測方法靈敏性、操作熟練程度等。本研究加強了實驗前后質(zhì)量控制，采取合格標本，保證標本質(zhì)量，嚴格操作程序。研究顯示，痰涂片檢查陽性率僅為36.07%，固體培養(yǎng)法陽性率44.06%，Xpert MTB /RIF、LAMP、CPA 3種分子診斷技術(shù)表現(xiàn)了良好的檢測效能，陽性檢出率分別達到了59.84%，58.20%，56.56%，大大提高了陽性檢出水平。以上表明，痰涂片鏡檢法及固體培養(yǎng)法的靈敏度仍不及分子診斷技術(shù)。一般涂片檢查菌數(shù)需5000個/ml-10000個/ml，培養(yǎng)需100個/ml，標本中菌數(shù)少于此數(shù)時不易獲得陽性結(jié)果[5]。而3種分子技術(shù)只需要標本中有極微量的結(jié)核桿菌就能檢測出來。有研究CPA診斷肺結(jié)核的敏感度和特異度分別為83.33%和95.12%[6]，邱勇[7]研究CPA的敏感度與特異度分別為89.7%(95%CI:78.8%-96.1%)與92.9%(95%CI:87.7%-96.4%)。張青[8]等綜合25 篇文獻進行分析，LAMP、Xpert診斷肺結(jié)核的合并敏感度分別為93%(95% CI：92%-95% )和96%(95%CI：94%-98% ),特異度分別 88%(95%CI：85%-9O%)和98%(95%CI：98%-99%)。

Xpert MTB /RIF總陽性率高于LAMP及CPA，與Xpert MTB /RIF比較，LAMP及CPA分子檢測和Xpert MTB /RIF檢測的一致性較好，Kappa值分別為0.966和0.916。3種分子技術(shù)與培養(yǎng)法比較，本研究中也出現(xiàn)了培養(yǎng)陽性而分子診斷陰性的情況，LAMP檢測2例、Xpert MTB/RIF檢測2例、CPA檢測3例，可能原因有試驗所取標本中沒有結(jié)核分枝桿菌，也可能是標本中含有TaqDNA聚合酶的抑制物等[9,10]。

分子檢測技術(shù)在結(jié)核病病原學診斷中成為傳統(tǒng)技術(shù)的有力補充，檢出時限上，LAMP、Xpert MTB /RIF、CPA分別用時約1 h、2 h、2 h，遠小于固體培養(yǎng)法的30 d，3種分子技術(shù)適用于結(jié)核病的早期診斷。姜世聞[11]建議通過使用分子生物學檢測技術(shù)優(yōu)化肺結(jié)核患者的篩查和診斷流程，規(guī)范實驗室操作規(guī)程，有望提高我國肺結(jié)核患者的病原學陽性檢出率。