陳敬師，黃玉洋，向杰，郭清華，李世貴，顧金剛

（中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所農業(yè)農村部農業(yè)微生物資源收集保藏重點實驗室，北京100081）

0 引言

【研究意義】木霉具有生長快、適應性強和抑菌譜廣等特點，對辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、鐮孢菌（Fusariumspp.）、疫霉（Phytophthoraspp.）和葡萄鉤絲殼菌（Uncinula necator）等病菌引起的病害均具有很好的防治效果[1-4]。木霉的生防機制包括營養(yǎng)和生態(tài)位競爭、重寄生、拮抗、促生、誘導植物產生系統(tǒng)抗性和產生抑菌性次級代謝產物等。木霉產生的抑菌性次級代謝產物主要分為 3類：一是揮發(fā)性有機物（volatile organic compounds，VOCs），二是水溶性化合物（water-soluble compounds），三是哌珀霉素類（peptaibols）。揮發(fā)性有機化合物在水、空氣和土壤中傳播，并且傳播距離較遠，因此較其他次級代謝產物在防治土傳病害方面有更大的優(yōu)勢[5-7]。碳源和氮源是微生物生長的必需物質，不同碳源和氮源對其生長、產孢和抑菌性次級代謝物質的產生影響較大[8-9]，YONG等[10]研究了碳源對綠色木霉（Trichodermaviride）產抑菌性氣體 6-戊基-吡喃-2酮的影響，發(fā)現(xiàn)甘油和葡萄糖均能促進綠色木霉產生 6-戊基-吡喃-2酮，而山梨醇和酸類物質不利于綠色木霉產生 6-戊基-吡喃-2酮。因此，研究木霉對碳源的代謝機制，對提高木霉生物防治的應用潛力具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已被鑒定的具有生物活性的揮發(fā)性有機化合物有1 006種[11]，其中約390種由木霉產生[12]；具有廣譜抑菌性的哌珀霉素類物質有220種[13-15]，至少12種來自木霉，這些物質在誘導植物抗性和抑制土壤和根際微生物生長方面具有重要作用[16-18]。不同木霉菌株產生的揮發(fā)性有機物組分存在明顯差異，如木霉T36和T50菌株產生的揮發(fā)性有機物均可抑制禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和終極腐霉（Pythium ultimum）的生長，但T36菌株對3種病原菌的抑制率均高于 T50[19]。BELéN 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Thmbf 1與哈茨木霉（Trichoderma harzianum）抑菌揮發(fā)性有機物的產生密切相關，過表達Thmbf 1會降低哈茨木霉揮發(fā)性有機物對尖鐮孢和灰霉菌的抑制率；PACHAURI等[21]研究發(fā)現(xiàn)，木霉揮發(fā)性有機物中包含大量的萜類物質，其形成與 3-磷酸甘油醛脫氫酶息息相關?！颈狙芯壳腥朦c】針對非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）ACCC 33109及其突變株產生的揮發(fā)性有機物對多種病原菌具有抑制作用，且不同碳源條件下菌株抑菌率存在差異的現(xiàn)象，采用Omnilog表型芯片技術分析菌株高產抑菌揮發(fā)性有機物與碳源代謝種類之間的關系?！緮M解決的關鍵問題】通過原生質體紫外誘變獲得高產抑菌揮發(fā)性有機物的突變株，明確與抑菌揮發(fā)性有機物產生相關碳源種類，為促進木霉菌株高產揮發(fā)性代謝物并高效應用于生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018年9月至2019年12月在中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 菌種 非洲哈茨木霉 ACCC 33109和尖鐮孢（黃瓜枯萎病菌，F(xiàn)usarium oxysporumsp.cucumebrium）ACCC 37438，均保藏于中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA、CMA和SNA培養(yǎng)基配方詳見文獻[22]。原生質體再生培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，酵母膏 1 g，(NH4)2SO41.4 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，MnSO40.01 g，ZnSO4·7H2O 0.01 g，以 0.6 mol·L-1的 NaCl滲透壓穩(wěn)定劑定容至1 L。合成培養(yǎng)基：果糖20 g，瓊脂20 g，酵母膏 3 g，蘇氨酸 3 g，K2HPO41 g，MgSO4·4H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO40.01 g，以蒸餾水定容至1 L。

1.1.3 主要試劑與儀器 蝸牛酶、纖維素酶、培養(yǎng)基（CMA、PDA、PDB和 SNA）均購自北京百樂欣生物科技有限公司。紫外光催化/反應箱（CBIO21）購自北京賽百奧科技有限公司。Omnilog微生物表型分析系統(tǒng)（71000）購自美國Biolog有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原生質體制備 ACCC 33109的新鮮菌絲轉接入含50 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃、200 r/min條件下培養(yǎng)36 h。菌絲經8層無菌紗布過濾，以0.6 mol·L-1NaCl沖洗至顯微鏡下觀察無孢子。稱取0.5 g菌絲放入已滅菌的50 mL離心管中，加入10 mL酶解液（蝸牛酶﹕纖維素酶=1﹕1）37℃酶解2 h。以布氏漏斗和6層擦鏡紙過濾，并以0.6 mol·L-1NaCl沖洗，離心（4℃、5 000 r/min、10 min）去除酶解液，0.6 mol·L-1NaCl洗滌2次后懸浮原生質體于5 mL的0.6 mol·L-1NaCl中。在顯微鏡下以血球計數(shù)板計數(shù)，調整原生質體濃度至 1.0×106個/mL，4℃冰箱保存待用[23]。

1.2.2 原生質體紫外誘變 將濃度為1.0×106個/mL的原生質體在距離紫外燈20 cm處分別照射0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 和 3.5 min，分別取 50 μL 涂布于原生質體再生培養(yǎng)基，28℃避光培養(yǎng)至長出單菌落。計算誘變致死率，致死率= [1-（誘變后原生質體再生菌落數(shù)/未誘變原生質體再生菌落數(shù)）]×100%。選取合適的劑量進行誘變處理，并在紅光下涂布于原生質體再生培養(yǎng)基，28℃黑暗培養(yǎng)，挑取單菌落純化待用。

1.2.3 對扣試驗 將ACCC 33109、ACCC 37438和突變株分別在PDA上活化，7 d后以打孔器（Φ=6 mm）分別在菌落邊緣打取菌餅并接種到PDA中央，二者對扣，中間以無菌玻璃紙隔開，用兩層封口膜密封，28℃恒溫培養(yǎng)。對扣無ACCC 33109野生株和突變株菌餅的ACCC 37438為對照，每個處理設置3個重復，連續(xù)5 d測量菌落半徑，并計算抑菌率。抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.2.4 ACCC 33109和 MU153對黃瓜促生防病效果以打孔器（Φ=6 mm）獲得活化好的 ACCC 33109、MU153和ACCC 37438菌餅，接種到PDA培養(yǎng)基，7 d后分別用無菌水洗下孢子，用6層紗布和2層擦鏡紙過濾至顯微鏡下觀察無菌絲，調整孢子濃度為1.0×107conidia/mL備用。盆栽試驗共設置2個對照和4個處理（表1），每個處理10個重復。移栽黃瓜幼苗后觀察記錄黃瓜發(fā)病死亡情況，6周后統(tǒng)計黃瓜枯萎病發(fā)病級數(shù)，并計算病情指數(shù)、發(fā)病率和相對防治效果。黃瓜枯萎病發(fā)病級數(shù)：0級：黃瓜不發(fā)病；1級：葉片輕微黃化萎蔫；2級：葉片輕度黃化萎蔫，植株矮化；3級：葉片重度黃化萎蔫，植株明顯矮化；4級：植株死亡。病情指數(shù)=100×∑（病情級值×該級病情株數(shù)）/（病情最高級值×總株數(shù)）；發(fā)病率=發(fā)病植株數(shù)/調查總株數(shù)×100%；相對防治效果=（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)×100%[24]。

1.2.5 菌落形態(tài)和分生孢子梗結構比較 將 ACCC 33109和突變株MU153、MU792在PDA上活化7 d，以打孔器（Φ=6 mm）獲得菌餅，分別接種到CMA、PDA和SNA培養(yǎng)基中央，28℃黑暗培養(yǎng)，每天在體式顯微鏡下觀察記錄各菌株生長和形態(tài)變化。

采用插片法，將ACCC 33109和突變株MU153、MU792的菌餅分別接種到PDA培養(yǎng)基中央，同時將無菌蓋玻片斜插到PDA培養(yǎng)基中，28℃黑暗培養(yǎng)3 d，光學顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子和分生孢子梗的形態(tài)特征。

表1 盆栽試驗設計Table 1 Design of the pot experiment

1.2.6 營養(yǎng)利用比較 Omnilog表型分析：將ACCC 33109和突變株MU153、MU792在PDA上活化7 d，用無菌棉簽沾取孢子并轉入FF-IF接種液，調節(jié)菌懸液濁度至75% T，然后將100 μL接種液加入到FF板微孔中，在Omnilog培養(yǎng)箱26℃條件下培養(yǎng)7 d。利用Data File Converter、OL_FM_12和OL_PR_12軟件以Area為參數(shù)進行數(shù)據(jù)分析，Area值越大表明菌株對該底物利用率越高。

優(yōu)化培養(yǎng)基的抑菌效率：依據(jù)Omnilog表型分析結果，分別將合成培養(yǎng)基中的碳源果糖換為α-D-半乳糖、糊精、麥芽糖、α-D-葡萄糖和吐溫-80進行ACCC 33109和突變株MU153、MU792與ACCC 37438的對扣試驗。每個處理設置3個重復，連續(xù)5 d計算抑菌率。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS v. 24軟件進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析與圖表制作。

2 結果

2.1 紫外誘變時間及誘變菌株獲得

當紫外誘變微生物的致死率為75%—80%時，正突變率較高[25]。非洲哈茨木霉ACCC 33109的原生質體經紫外燈（25 W）照射1.0—1.5 min后致死率上升最快。紫外誘變2.0 min時的致死率為76.63%，是紫外誘變的最佳時間（圖 1）。經多批次原生質體紫外誘變，優(yōu)先挑取生長較快、菌落直徑較大且菌絲較密的菌落，涂布于原生質體再生培養(yǎng)基，最終獲得 828個突變株，分別記為MU1—MU828。

圖1 紫外誘變時間對非洲哈茨木霉ACCC 33109原生質體致死率的影響Fig. 1 Effects of UV mutagenesis duration on the protoplast lethality rate of T. afroharzianum ACCC 33109

基于平板對扣試驗，非洲哈茨木霉ACCC 33109及其突變株均能不同程度地抑制尖鐮孢ACCC 37438的菌絲生長，且抑制效果隨時間的延長而增強，表現(xiàn)為病原菌菌絲生長緩慢，色素減少，菌落邊緣菌絲稀疏且不規(guī)則生長（圖 2）。突變株均能產生具有抑菌作用的揮發(fā)性有機物，抑制效果差異較大。其中抑菌率＜10%的有146株，10%—20%有270株，20%—30%有315株，30%—40%有70株，40%—50%有25株，＞50%有 2株，30個突變株的抑菌率高于野生株ACCC 33109（37.18%）。其中，突變株 MU153和MU792經過多次傳代培養(yǎng)性狀穩(wěn)定，抑菌率分別為53.86%和15.83%，且菌落形態(tài)與野生株有明顯差異。

2.2 ACCC 33109和MU153對黃瓜促生和防病效果

盆栽試驗中，CK2（病原菌對照）、處理2和處理4均在第2周開始發(fā)病，表現(xiàn)為黃瓜根部開始變?yōu)楹稚龋珻K1（清水對照）、處理1和處理3生長正常。第3周處理2和處理4發(fā)病情況減輕，CK2發(fā)病情況變重，表現(xiàn)為植株矮小、根部和莖基部褐色加深和葉片開始黃化等，CK1、處理1和處理3生長正常。第4周CK2黃瓜開始出現(xiàn)整株枯萎死亡現(xiàn)象，CK1、處理1、處理2、處理3和處理4生長正常。

6周后，處理2和處理4的發(fā)病率較CK2分別下降了55.56%和66.67%，病情指數(shù)分別下降了38.89和47.23。突變株MU153對黃瓜枯萎病的相對防治效果為89.69%，相對野生株ACCC 33109提高了15.88%（表2）。ACCC 33109和MU153不僅可以防治黃瓜枯萎病，而且可以促進黃瓜生長，表現(xiàn)為植株株高增大、葉片增多和須根發(fā)達等（圖3）。

圖2 非洲哈茨木霉揮發(fā)性有機物對尖鐮孢的抑菌活性（28℃, 5 d）Fig. 2 Inhibitory activities of the VOCs produced by T. afroharzianum against F. oxysporum (28℃, 5 d)

圖3 非洲哈茨木霉防治黃瓜枯萎病盆栽試驗Fig. 3 A pot experiment of T. afroharzianum against cucumber fusarium wilt

表2 黃瓜枯萎病發(fā)病率、病情指數(shù)和相對防治效果Table 2 Incidence rate, disease index and relative control effect of cucumber fusarium wilt

2.3 野生菌株和突變菌株形態(tài)特征比較

非洲哈茨木霉 ACCC 33109和突變株 MU153、MU792在CMA、PDA和SNA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)3 d后除SNA上生長的MU792外均長滿平板，但菌落形態(tài)有較大差異（圖4）。在CMA培養(yǎng)基上，ACCC 33109菌落白色，產生不明顯輪紋，菌落圓形，氣生菌絲豐富，為絨毛狀，不產生色素；MU153菌落初為白色，第3天變?yōu)闇\綠色，菌落圓形，氣生菌絲豐富，菌落背面顏色由無色變?yōu)闇\黃色；MU792菌落始終為白色，呈放射狀，形成明顯的同心輪紋，氣生菌絲較少，不產生色素。在PDA培養(yǎng)基上，ACCC 33109菌落白色、圓形，氣生菌絲豐富，為絮狀，不產生色素；MU153菌落初為白色，后變?yōu)榫G色，菌落圓形，氣生菌絲豐富，菌落背面顏色由無色變?yōu)闇\綠色；MU792菌落始終為白色，氣生菌絲豐富，為絮狀，不產生色素。在SNA培養(yǎng)基上，ACCC 33109菌落由白色變?yōu)闇\綠色，呈放射狀，菌落邊緣不規(guī)則，氣生菌絲稀疏，不產生色素；MU153菌落由白色變?yōu)闇\綠色，呈放射狀，氣生菌絲稀疏，呈絨毛狀，菌落背面顏色由白色變?yōu)闇\綠色；MU792生長較慢，培養(yǎng)3 d后菌落半徑3.8—4.0 cm，菌落始終為白色，氣生菌絲豐富，呈絨毛狀，不產生色素。

圖4 非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153和MU792在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig. 4 Colony morphology of T. afroharzianum ACCC 33109, MU153 and MU792 on CMA, PDA, and SNA plates

非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153和MU792在PDA平板28℃培養(yǎng)3 d后均產生分生孢子梗和分生孢子（圖 5）。原生質體紫外誘變提高了 MU153的瓶梗長度、瓶梗長/寬、支持細胞寬度、支持細胞長度、孢子長、寬和孢子長/寬，降低了MU153分生孢子梗最寬處和基部寬；提高了 MU792的瓶梗長/寬、支持細胞長度、孢子長和寬，降低了MU792分生孢子梗最寬處、基部寬、支持細胞寬度和孢子長/寬（表3）。

2.4 野生菌株和突變菌株對碳源代謝表型分析

圖6結果表明ACCC 33109、MU153和MU792均可代謝 FF板中所有物質，利用率有顯著差別，MU153對FF板中46種物質的代謝能力高于ACCC 33109，達到顯著水平的有2種，分別為甘油和麥芽糖。MU792對FF板中69種物質的代謝能力低于ACCC 33109，達到顯著水平的物質有 8種，分別為β-環(huán)糊精、D-半乳糖醛酸、D-蜜二糖、水蘇糖、木糖醇、D-糖質酸、琥珀酰胺酸和琥珀酸，達到極顯著水平的物質有4種，分別為D-棉子糖、γ-羥基丁酸、對羥基苯乙酸和葵二酸。ACCC 33109利用率低于MU153且高于MU792的物質有29種，達到顯著水平的物質有2種，分別為α-D-半乳糖和吐溫-80，達到極顯著水平的物質有1種，為D-葡萄糖醛酸（表4）。

2.5 非洲哈茨木霉代謝底物種類對其抑菌活性影響

MU153基于α-D-半乳糖、糊精、麥芽糖、α-D-葡萄糖和吐溫-80 5種底物產生的揮發(fā)性有機物對尖鐮孢的抑菌率均明顯高于野生株，MU792產生揮發(fā)性有機物對尖鐮孢的抑菌率均低于野生株。以α-D-葡萄糖為底物時，ACCC 33109、MU153和MU792產生的揮發(fā)性有機物對尖鐮孢的抑菌率均高于其他 4種碳源，并且MU153抑菌率達到了最高為56.17%（圖7）。

圖5 非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153和MU792的分生孢子梗結構Fig. 5 Conidiogenous structures of T. afroharzianum ACCC 33109, MU153 and MU792

表3 非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153和MU792的分生孢子梗相關數(shù)據(jù)Table 3 Conidiogenous data of T. afroharzianum ACCC 33109, MU153 and MU792

圖6 非洲哈茨木霉碳源代謝熱圖（26℃, 7 d）Fig. 6 Heatmap of carbon utilization of T. afroharzianum (26℃, 7 d)

表4 非洲哈茨木霉ACCC 33109代謝能力高于MU792低于MU153的物質Table 4 Substances utilized by T. afroharzianum ACCC 33109 at higher rate than MU792 but lower than MU153

3 討論

木霉抑菌性揮發(fā)性有機物種類鑒別和產生機制是近年來的研究熱點和難點。CHEN等[26]研究發(fā)現(xiàn)，蓋姆斯木霉（Trichoderma gamsii）YIM PH30019可產生二甲基二硫醚、二苯并吡喃、甲硫醇和酮類等揮發(fā)性物質抑制三七根腐??；張雯雯等[27]研究表明，11株木霉菌產生的揮發(fā)性有機物均可抑制尖鐮孢的生長，經GC-MS檢測共發(fā)現(xiàn)257種揮發(fā)性有機物；LI等[28]研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉和深綠木霉（Trichoderma atroviride）產生的28種揮發(fā)性有機物可抑制尖鐮孢的生長，對扣試驗表明尖鐮孢還可誘導木霉揮發(fā)性有機物的產生。

圖7 不同碳源條件下非洲哈茨木霉ACCC 33109、MU153和MU792抑菌作用（28℃, 5 d）Fig. 7 Effects of different carbon sources on the inhibitory activities of the VOCs produced by T. afroharzianum ACCC 33109,MU153 and MU792 (28℃, 5 d)

本研究中，分別以α-D-半乳糖、糊精、麥芽糖、α-D-葡萄糖和吐溫-80為碳源時，非洲哈茨木霉突變株MU153抑菌率均高于野生株 ACCC 33109，MU792抑菌率均低于ACCC 33109，其抑菌活性與碳源利用效率呈正相關。以α-D-葡萄糖為底物時，ACCC 33109、MU153和MU792抑菌率最高，分別為48.08%、56.17%和40.94%。分析原因可能是葡萄糖作為單糖最易被菌株吸收利用，從而菌株生長變快，菌絲量增多，產生大量的抑菌揮發(fā)性物質，這與文獻報道一致。如詹藝舒等[29]研究發(fā)現(xiàn)，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）以α-D-葡萄糖為碳源時，菌體量高達 8.35 g·mL-1，對康氏木霉（Trichoderma koningii）抑菌率最高，為58.56%，顯著高于乳糖、蔗糖和可溶性淀粉等碳源；蔡邵寧[30]研究表明，蛹蟲草（Cordyceps militaris）以α-D-葡萄糖為單一碳源培養(yǎng)16 d時，菌絲干重超過7 g·L-1，對大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑制效果最好，抑菌率高于蔗糖和淀粉；吳惠貞等[31]研究表明，羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）分別以葡萄糖、蔗糖和麥芽糖為碳源時，活菌數(shù)均在109CFU/mL以上，對大腸桿菌的抑菌圈均在7.65 mm以上，抑菌率高于甘油和果糖等碳源。紫外誘變不僅改變了菌株對碳源的利用率，可能還改變了菌株對碳源的利用方式，使誘變菌株產生了不同的抑菌揮發(fā)性物質。MUKHERJEE等[32]研究表明，綠色木霉的誘變突變株G2以葡萄糖為碳源時，其代謝產物是野生株的2—3倍，包含綠膠霉素類物質和一些尚未鑒定的物質。

4 結論

通過原生質體紫外誘變和對扣法獲得一株高產抑菌揮發(fā)性有機物的非洲哈茨木霉突變株MU153。與野生株ACCC 33109相比，該菌株抑菌率提高了16.68%，且菌落形態(tài)、菌落顏色以及分生孢子梗均有顯著變化；以最適底物α-D-葡萄糖為碳源時，MU153抑菌率高達56.17%；盆栽試驗中 MU153具有抑菌、促生的雙重效果，是一株具有重要應用潛力的生防菌。