唐科志，周常勇

（西南大學柑桔研究所，重慶 400712）

0 引言

【研究意義】由鏈格孢菌橘致病型（Alternaria alternatatangerine pathotype）引起的柑橘褐斑病（Alternaria brown spot，ABS）可危害柑橘的嫩梢、嫩葉及果實，常對部分寬皮柑橘生產(chǎn)帶來嚴重問題[1-3]。澳大利亞于1903年首次報道該病害[4]，隨后在美國、哥倫比亞、土耳其、以色列等柑橘產(chǎn)地相繼發(fā)現(xiàn)。2010年，在我國云南的栽培品種上首次鑒定到柑橘褐斑病菌[5]，此后，在國內(nèi)其他柑橘產(chǎn)區(qū)也陸續(xù)暴發(fā)該病[6-8]。近年來，柑橘褐斑病在敏感品種紅橘（Citrus reticulataBlanco, cv. Hongjv）上的暴發(fā)已造成局部地區(qū)橘類產(chǎn)業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。國內(nèi)外對柑橘褐斑病菌部分功能基因研究已取得一定進展[9-12]，但其流行規(guī)律、致病機理以及寄主應答機制仍不清楚，有待進一步深入研究?！厩叭搜芯窟M展】WANG等[13-14]對鏈格孢菌橘致病型菌株 Z7進行了全基因組測序分析，證明柑橘褐斑病菌功能基因主要為ACT毒素合成基因、信號轉(zhuǎn)導基因、次級代謝相關(guān)基因、ROS解毒相關(guān)基因等，并通過轉(zhuǎn)錄組測序研究了主要轉(zhuǎn)錄因子對菌株產(chǎn)孢及致病性的調(diào)控；WU等[15]通過對霜霉病菌（Plasmopara viticola）侵染葡萄前后的葉片樣品進行RNA-seq測序，共獲得15 249個候選的差異表達基因；XU等[16]通過RNA-seq研究了棉花受黃萎病菌（Verticillium dahlia）侵染后的轉(zhuǎn)錄組變化，共鑒定到3 442個與防御相關(guān)的基因，其中木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達在抗病品系中表達顯著上調(diào)，推測木質(zhì)素可能在棉花抗病中發(fā)揮重要作用；WARD等[17]借助 RNA-seq技術(shù)研究了覆盆子根腐病抗病及感病品系受到病原菌Phytophthora rubi侵染后的基因表達差異，結(jié)果顯示W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子、三羧酸循環(huán)、木質(zhì)素合成及編碼病程相關(guān)蛋白的基因等均表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄表達上調(diào)；WANG等[18]利用RNA-seq技術(shù)研究了葡萄柚的抗病及感病品系在黃龍病菌（CandidatusLiberibacter asiaticus）侵染后的轉(zhuǎn)錄表達差異，發(fā)現(xiàn)兩個品系在轉(zhuǎn)錄因子、次級代謝、受體激酶及激素信號轉(zhuǎn)導等多個途徑相關(guān)基因均存在表達差異，通過后續(xù)驗證，推測出與黃龍病菌抗性相關(guān)的兩個基因DMR6-like和 NPR1-like；李湘龍等[19]通過 RNA-seq技術(shù)分析水稻與稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）互作早期的轉(zhuǎn)錄表達譜，為研究稻瘟病菌效應蛋白基因及其功能打下了基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c】RNA-seq可為植物響應脅迫過程中基因表達調(diào)控、蛋白質(zhì)功能和代謝通路等研究提供大量信息，在植物病原菌的致病機理、植物對病原菌的脅迫應答，以及病原菌與植物寄主相互作用的機制機理等研究中應用十分廣泛。但利用RNA-seq技術(shù)進行鏈格孢菌橘致病型與柑橘互作的研究尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用RNA-seq技術(shù)對鏈格孢菌橘致病型侵染紅橘前后的基因表達變化進行分析，找到紅橘響應鏈格孢菌橘致病型侵染的關(guān)鍵基因，為柑橘的抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于 2018—2019年在西南大學柑桔研究所國家柑桔苗木脫毒中心實驗室完成。

1.1 供試材料及樣品采集

鏈格孢菌橘致病型菌株 Z7由浙江大學李紅葉教授提供，保存于國家柑桔苗木脫毒中心實驗室。寄主材料為紅橘，種植于國家柑桔苗木脫毒中心網(wǎng)室。取活化后的鏈格孢菌橘致病型菌株 Z7于 PDB培養(yǎng)基上，30℃、150 r/min搖菌48 h。收集單個菌絲球接種大小、葉齡和成熟度均一致的紅橘離體葉片，將處理組和未接種菌絲的對照組葉片于 28℃培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)。接種28 h后，葉片出現(xiàn)輕微反應，未見明顯癥狀，此時采集樣品，利用RNA-seq技術(shù)分析紅橘對鏈格孢菌橘致病型的早期防御機制。每個樣本同時取兩份，一份送交公司測序，另一份液氮中速凍后保存于-80℃冰箱用于后期試驗驗證。對照和處理組分別設(shè)置3個生物學重復（對照樣本名稱分別為C0_1/2/3，接種菌株樣本名稱分別為ZC_1/2/3）。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

1.2.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測 采用Trizol（Invitrogen）提取寄主葉片總RNA[11]，并用RQ1 RNase-Free DNase（Promega）處理去除DNA。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行 RNA條帶初步分析。使用分光光度計NanoDropTM（ThermoFisher）進行樣本純度的檢測，通過OD260/280及OD260/230比值進行判斷。采用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Nano Kit）檢測樣品總RNA的濃度、完整性（RIN值、28S/18S）及片段大小，主要根據(jù)真核生物rRNA的完整性來判斷，包括28S rRNA、18S rRNA及5.8S rRNA的峰值及電泳條帶完整性。

1.2.2 文庫構(gòu)建與上機測序 樣品提取總RNA后，用Dynalbeads oligo（dT）磁珠富集有polyA尾巴的mRNA，加入 fragment buffer將 RNA片段化，再以片段化的mRNA為模板，采用隨機的N6 primer進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA一鏈，再合成cDNA二鏈，純化并經(jīng)DNA末端修復，加堿基A，加測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，完成文庫構(gòu)建。利用BGISEQ-500平臺采用雙末端法（Pair-End）對文庫進行測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

1.3.1 原始測序數(shù)據(jù)處理 測序得到的原始序列中含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads，為了保證后續(xù)信息分析質(zhì)量，需要對原始測序數(shù)據(jù)進行過濾，得到 clean reads，以保證后續(xù)分析數(shù)據(jù)的可靠性。

1.3.2 參考基因組比對 針對上述得到的 clean reads，使用HISAT[20]將clean reads比對到甜橙參考基因組序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10702），然后統(tǒng)計比對上的基因組的比對率以及 reads在染色體上的分布，從整體上了解樣品差異。

1.3.3 表達量分析及差異表達基因檢測 使用Bowtie 2將clean reads比對到上述較為完整的參考序列，再使用RSEM計算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達水平。使用PossionDis算法進行差異基因檢測，參數(shù)為|log2fold change (FC)|≥1，q-value≤0.01。

1.3.4 差異表達基因功能分析 利用 GO數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能分類，利用KEGG分析代謝途徑，使用P-value＜0.05作為顯著富集基因的閾值，使用MapMan軟件對差異基因進行圖形化分析。

1.4 qRT-PCR驗證

采用與轉(zhuǎn)錄組測序相同的樣品材料，隨機選取差異表達基因進行qRT-PCR分析，驗證轉(zhuǎn)錄組測序分析數(shù)據(jù)的可靠性。

通過 DNAman軟件設(shè)計引物，然后由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行引物的合成，并通過電泳及qRT-PCR熔解曲線檢測引物特異性。相關(guān)驗證基因擴增引物序列見表 1。使用 2-ΔΔCT法計算基因的相對表達并換算成log2FC。

2 結(jié)果

2.1 與參考基因組比對結(jié)果

測序 reads經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)控后，將各樣品過濾后的clean reads與甜橙基因組進行比對分析，各樣品的比對率及唯一比對率都相對比較均勻，詳細的比對結(jié)果見表2。經(jīng)測序得到的6個轉(zhuǎn)錄組文庫中的數(shù)據(jù)與甜橙參考基因組進行比對后獲得的 mapped reads占總reads的74%以上，根據(jù)樣品間分析可知，對照樣品中的mapping率接近90%，說明在接菌后隨著菌體在葉片內(nèi)增殖，病原菌的轉(zhuǎn)錄本影響總的mapping。

2.2 差異表達基因篩選

根據(jù)差異基因篩選條件q-value≤0.01，差異倍數(shù)|log2FC|≥1，鏈格孢菌橘致病型接種紅橘28 h后獲得上調(diào)差異基因5 173個，下調(diào)差異基因為6 555個（圖1）。

表2 比對參考基因組結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Summary of genome mapping

圖1 鏈格孢菌橘致病型侵染引起紅橘差異表達基因火山圖Fig. 1 Volcano plot of DEGs of tangerine inoculated with A. alternata tangerine pathotype

2.3 差異表達基因GO功能富集分析

紅橘受鏈格孢菌橘致病型侵染的差異基因根據(jù)GO分類的規(guī)則分為3大類：分子功能、細胞組分和生物學過程（圖2）。在生物學過程中差異基因主要屬于蛋白磷酸化、代謝過程、氧化還原過程和跨膜運輸。細胞組分中只包括兩類與膜相關(guān)的條目。分子功能相關(guān)的基因富集最多，其中更多基因富集在蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、催化活性、蛋白激酶活性和氧化還原活性。

對所有富集的GO term進行篩選，篩選條件為多重檢驗校正q-value＜0.05，利用WEGO通過比較所有富集的基因和差異基因占基因總數(shù)的百分比，可以得出哪些差異的比例高出一般基因富集的水平，如圖 3所示，在代謝過程、膜系統(tǒng)、抗氧化活性、轉(zhuǎn)運及核酸綁定相關(guān)基因GO富集程度高于平均水平。

將差異基因分成表達上調(diào)和表達下調(diào)基因，圖 4顯示在同病原菌互作過程中，紅橘不同代謝途徑的基因均呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)，值得注意的是碳水化合物代謝過程中上調(diào)基因91個而下調(diào)基因146個，說明病原菌侵染直接破壞紅橘的碳水化合物代謝。葉綠體相關(guān)的基因和調(diào)控光系統(tǒng)的基因也主要呈下調(diào)狀態(tài)，說明光合作用也受到負面影響。微管相關(guān)基因也是以下調(diào)狀態(tài)為主，說明細胞骨架也被病原菌攻擊受損。DNA綁定的轉(zhuǎn)錄因子活性增強，說明大量轉(zhuǎn)錄因子被激活調(diào)控下游抗病基因表達，蛋白激酶活性也以上調(diào)為主，說明免疫相關(guān)的PTI和ETI中大量受體激酶也被病原菌激活。

2.4 差異表達基因KEGG功能富集分析

以KEGG Pathway為單位，應用超幾何檢驗，分析鑒別差異表達基因中顯著富集的代謝通路或信號轉(zhuǎn)導途徑。Pathway富集到的通路涉及到6 975個差異基因，對所有富集的KEGG Pathway進行篩選，共獲得20條顯著富集的Pathway，分別為代謝途徑（ko01100）、次生代謝物合成（ko01110）、碳循環(huán)（ko01200）、糖酵解/糖異生（ko00010）、丙酮酸代謝（ko00620）、光合作用（ko00195）、檸檬酸循環(huán)（ko00020）、光合作用-天線蛋白質(zhì)（ko00196）、脂肪酸降解（ko00071）、卟啉和葉綠素代謝（ko00860）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（ko00260）、氨基糖和核苷酸糖代謝（ko00520）、谷胱甘肽代謝（ko00480）、α-亞麻酸代謝（ko00592）、苯丙烷類生物合成（ko00940）、植物激素信號轉(zhuǎn)導（ko04075）、抗壞血酸代謝（ko00053）、雙酚降解（ko00363）、檸檬烯和蒎烯的降解（ko00903）、二苯乙烯、二芳庚烯和姜辣素的生物合成（ko00945）（圖5）。

2.5 紅橘響應鏈格孢菌橘致病型侵染差異表達基因

2.5.1 植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑及相關(guān)基因 接種鏈格孢菌橘致病型28 h RNA-seq結(jié)果顯示，紅橘防御相關(guān)的植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑中多個基因表達具有差異，乙烯（ET）、水楊酸（SA）和生長素（AUX）等重要防御相關(guān)的植物激素信號通路受到影響（圖6）。

在紅橘響應鏈格孢菌橘致病型的激素信號轉(zhuǎn)導中乙烯起了主導作用。首先，乙烯受體ETR的3個成員Cs9g08850、Cs5g33560和Cs5g14390被該菌不同程度激活，ETR下游的激酶CTR1中Cs6g15490、Cs3g17090表達量也隨之升高，隨后受MPK-MEKK將信號進一步放大，到信號下游Cs4g17960和Cs7g05390（編碼EBF 1/2），Cs3g06940、Cs3g06930、orange1.1t04381、Cs2g29100（編碼EIN3）和最終的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子乙烯響應因子ERF 1/2均表現(xiàn)出表達量升高趨勢。

圖2 差異表達基因GO富集Fig. 2 DEGs GO enrichment

圖3 差異表達基因WEGO分類Fig. 3 WEGO classification of DEGs

圖4 差異表達基因GO分類Fig. 4 GO classification of DEGs

圖5 差異表達基因的KEGG通路分析Fig. 5 KEGG pathway analysis of DEGs

而在生長素信號中大部分的關(guān)鍵基因表達下調(diào)，AUX作為生長素信號的最上游，大量的紅橘同源基因Cs8g16440、Cs3g05470、Cs2g05440、Cs3g05500、orange1.1t00508等均呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，而生長素響應蛋白編碼基因Cs8g16440、Cs3g05470、Cs2g05440、Cs3g05500、orange1.1t00508等也隨AUX信號誘導劇烈上升，在生長素信號途徑重要轉(zhuǎn)錄因子家族中的生長素響應因子ARF是具有多個成員的基因家族，而紅橘中絕大部分成員如Cs8g16440、Cs3g05470、Cs2g05440、Cs3g05500、orange1.1t00508、Cs5g32400都表現(xiàn)出受鏈格孢菌橘致病型誘導的負調(diào)控表達。

在 SA合成-降解途徑中，Cs2g18260編碼的UGT74F1在體外將UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移至水楊酸（形成葡糖苷）、苯甲酸、槲皮素和草酸鹽。Cs2g18240對應S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶超家族蛋白，具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性參與水楊酸合成，Cs5g21260（編碼UGT74F1）由水楊酸、病毒、真菌和細菌誘導，參與色氨酸合成途徑。這些參與水楊酸合成途徑的基因受鏈格孢菌橘致病型誘導后均表達下調(diào)，推測在該菌侵染過程中有大量SA合成。在SA信號轉(zhuǎn)導途徑中大量的TGA轉(zhuǎn)錄因子同樣受該菌誘導，而下游的PR基因不同成員既有表達上調(diào)也有表達下調(diào)，這些基因除了受SA調(diào)控外也受其他信號影響。

2.5.2 紅橘響應鏈格孢菌橘致病型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 轉(zhuǎn)錄因子（TF）是開啟基因轉(zhuǎn)錄過程的“主要開關(guān)”。圖 7顯示本研究在差異表達基因中發(fā)現(xiàn)來自不同 TF家族的多個成員。最具代表性的TF類是WRKY系列，在紅橘中大概有50個成員，大部分成員均受鏈格孢菌橘致病型誘導正調(diào)控，其中WRKY22、WRKY33、WRKY72、WRKY75、WRKY28都相較于對照上調(diào) 10倍以上，同時也包括WRKY13在內(nèi)的一些成員響應該菌并表達下調(diào)。bZIP類轉(zhuǎn)錄因子能與WRKY蛋白發(fā)生互作，通常與 WRKY參與相同的調(diào)控模式。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示在差異表達基因中 bZIP家族的大部分成員（Cs1g26010、Cs3g10860、Ccs7g29820）也受該菌侵染上調(diào)表達，只不過表達顯著性稍低于 WRKY轉(zhuǎn)錄因子。由于乙烯信號途徑基因的大量表達，在轉(zhuǎn)錄因子中有一類稱為乙烯響應因子的蛋白與該信號途徑聯(lián)系緊密，而差異表達分析也驗證了相關(guān)的數(shù)據(jù)，在該菌侵染28 h后的樣品中超過50%的ERF家族成員（Cs3g23270、Cs4g06410、Cs5g33540）表達上調(diào)，其他 TF家族也不同形式的被誘導差異表達，包括NAC、MYB、ZF-HD、B3、HB、C2H2、TiFy和bHLH家族。

圖6 KEGG map分析植物激素信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的差異表達基因Fig. 6 DEGs involved in plant hormone signal transduction analyzed by KEGG map

圖7 MapMan分析轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的差異表達基因Fig. 7 DEGs involved in transcription factor analyzed by MapMan

2.5.3 次級代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)基因 在響應鏈格孢菌橘致病型過程中，與黃酮醇、花青素、萜類化合物和生物堿生物合成相關(guān)的基因受該菌誘導產(chǎn)生劇烈變化（圖 8）。萜類合成中大部分基因表現(xiàn)下調(diào)，而黃酮類合成相關(guān)的差異表達基因既有表達上調(diào)又有表達下調(diào)，總體來說表達上調(diào)基因的數(shù)量和表達趨勢均強于表達下調(diào)基因，其中黃烷酮-3-羥化酶（Cs1g03950）、2-oxoglutarate（Cs5g29930、Cs9g02930、Cs9g14520、Cs9g14500）和 Fe(II)/ascorbate oxidase（orange1.1t03581、orange1.1t03576、orange1.1t03582）均在侵染過程中積累，UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶家族則在黃酮和花青素合成過程中表達下調(diào)。硫代葡萄糖苷有抗蟲和抑菌的作用，在該菌的影響下總體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，而生物堿相關(guān)基因和類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因表達趨勢與此相反。此外，該菌還誘導了涉及木質(zhì)素生物合成的基因 PAL（Cs8g16290、Cs7g24940）、4CL（Cs5g06990）、HTC（Cs1g14450），表明在受侵染的組織中木質(zhì)素沉積，木質(zhì)化可作為限制病原菌定殖的有效防御機制，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出感染組織中細胞壁活動劇烈變化，支持了植物在感染期間感知病原并激活防御機制的觀點。

2.5.4 病原與植物互作途徑相關(guān)基因 MAPK信號途徑中CsMPK7、CsMKK3、CsMAP3Ka信號級聯(lián)均受鏈格孢菌橘致病型激活表達，同時表達量上調(diào)的還有下游主要轉(zhuǎn)錄因子成員ERF、WRKY、bZIP、MYB。ETI中的 R 蛋白基因（Cs5g21850、Cs5g21860、orange1.1t03118），TIR-NBS-LRR類抗病蛋白編碼基因（Cs1g26330）和NB-ARC類抗病蛋白編碼基因（orange1.1t03734）均響應該菌正向調(diào)控表達，NB-LRR家族也是由該菌侵染誘導引起寄主細胞程序性死亡并產(chǎn)生過敏反應（HR）。

植物跨膜受體能感知細胞外微生物相關(guān)分子，跨膜受體對應不同的受體激酶，激酶有不同的胞外結(jié)構(gòu)域?qū)R別不同的胞外分子。本研究結(jié)果顯示，受感染的紅橘顯著富集受體激酶和受體蛋白質(zhì)，在被鏈格孢菌橘致病型侵染28 h后，紅橘多個LRR類受體基因（Cs2g04320、Cs2g04330、Cs6g10370）被激活，此外還有DUF受體激酶、LRK受體激酶、LysM類受體激酶、WAK受體激酶和凝集素受體激酶這些不同類型的激酶基因都有超過 5個以上的家族成員被劇烈誘導。此外多種基因編碼抗菌蛋白也在該菌激活下引起上調(diào)，這些基因?qū)儆诓〕滔嚓P(guān)（PR）超家族，包括多個家族組成的抗病群體構(gòu)成植物誘導防御機制，編碼PR基因的轉(zhuǎn)錄本PR-1、PR-2（β-1-3-葡聚糖酶）、PR-3、PR-4、PR-8、PR-11（幾丁質(zhì)酶）、PR-5（thaumatin）、PR-6（蛋白酶抑制劑）、PR-9（過氧化物酶）和PR-10（核糖核酸酶）在鏈格孢菌橘致病型侵染期間累積。高等植物中的保護酶系統(tǒng)在遭受脅迫過程中保護植物不受細胞內(nèi)ROS造成的氧化損傷，調(diào)控抗氧化活性清除ROS對植物的傷害依賴于過氧化物酶（POD）家族蛋白。顯然，在紅橘受到鏈格孢菌橘致病型侵害的過程中需要積累大量的 POD 基因，因此Cs2g09310、Cs2g28680、Cs7g20700等22個POD成員基因均受到活性氧信號激發(fā)大量表達。其他上調(diào)防御基因包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白酶抑制劑和NADPH氧化酶負責產(chǎn)生超氧離子，這些結(jié)果證實柑橘內(nèi)部啟動了完全的防御反應（圖9）。

圖8 MapMan分析次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的差異表達基因Fig. 8 DEGs involved in secondary metabolite biosynthesis analyzed by MapMan

圖9 MapMan分析寄主-病原互作相關(guān)的差異表達基因Fig. 9 DEGs involved in host-pathogen interaction analyzed by MapMan

2.6 qRT-PCR驗證

為檢測轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的真實性和可靠性，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的差異基因，選取了一些已報道明確與植物抗病相關(guān)的基因且在差異表達分析中l(wèi)og2FC接近10的成員，通過qRT-PCR技術(shù)檢測其表達水平。由圖10可以看出調(diào)控抗氧化活性的POD基因（Cs2g09310、Cs7g20700）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因（orange1.1t03618）在接種鏈格孢菌橘致病型的樣品中均顯著表達上調(diào)，細胞壁代謝相關(guān)的漆酶（Cs6g07410）和果膠轉(zhuǎn)移酶（Cs3g10430）受該菌攻擊也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，PTI響應的受體激酶 LRR（orange1.1t05311）也受該菌誘導，同樣ETI調(diào)控的R基因NB-ARC 蛋白（Cs1g01180）也上調(diào)，幾丁質(zhì)酶（Cs5g21860、orange1.1t03118）作為主要的抗病蛋白上調(diào)倍數(shù)均超過 10倍，轉(zhuǎn)錄因子 NAC（Cs5g15470）、MYB（Cs4g12760）和WRKY（Cs6g20850）均為植物抗逆過程中重要的調(diào)控因子，qRT-PCR和轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)顯示所檢測的3個轉(zhuǎn)錄因子均受該菌誘導顯著上調(diào)，qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組顯示基因表達變化趨勢一致。

圖10 差異表達基因qRT-PCR鑒定Fig. 10 Identification of DEGs by qRT-PCR

3 討論

3.1 植物防御反應中的激素平衡

本研究中的 MPK信號通路和乙烯信號途徑均富集大量上調(diào)的差異基因，MPK家族成員接受鏈格孢菌橘致病型信號從而控制紅橘 ET信號合成，通過ET信號調(diào)控下游ERF類轉(zhuǎn)錄因子起到激活抗病基因的作用。本氏煙的Ca2+結(jié)合蛋白Calreticulin 3a在識別源自致病疫霉（Phytophthora infestans）的MAMP后參與ET的誘導產(chǎn)生，進一步證明ET信號傳導是產(chǎn)生抗微生物毒素所必需的[21]。Ca2+信號（CDPK和 CML）在本研究中被激活，因此 Ca2+也參與響應鏈格孢菌橘致病型入侵信號并激活 ET產(chǎn)生來調(diào)控抗病反應。

通過MapMan和KEGG所注釋的差異基因顯示，紅橘茉莉酸（JA）途徑中的激素合成及信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因均發(fā)生劇烈變化，其中編碼JA生物合成所需12-氧代二亞油酸還原酶的7個基因全部上調(diào)，JA受鏈格孢菌橘致病型侵染后大量合成作為抗病信號激活下游基因表達。關(guān)于 JA參與防御反應的報道很多，如通過激發(fā)子和病原體攻擊增加內(nèi)源性 JA和茉莉酸甲酯（MeJA）水平，外源性應用JA或MeJA誘導防御反應基因表達[22-23]。本研究中的JA下游PR基因和相關(guān)次生代謝產(chǎn)物合成基因均受到不同程度誘導。蕓薹生鏈格孢（A. brassicicola）感染上調(diào)JA生物合成和JA誘導的防御基因[24]。通過直接對擬南芥噴霧接種蕓薹生鏈格孢分生孢子能激活JA相關(guān)基因表達[25]。JA在小麥冠腐病菌（Fusarium pseudograminearum）攻擊期間延遲了小麥癥狀的產(chǎn)生[26]，并且增強了對殼多胞（Stagonospora nodorum）感染的抗性[27]，因此JA信號通路是植物對抗死體營養(yǎng)型真菌特別是鏈格孢真菌的主要信號轉(zhuǎn)導途徑。

3.2 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物防御反應

鏈格孢菌橘致病型侵染紅橘的過程調(diào)控抗病基因表達的主要為WRKY和ERF轉(zhuǎn)錄因子，檢測到的43個差異表達的 WRKY轉(zhuǎn)錄因子中只有 9個表達下調(diào)，其余成員均顯著上調(diào)，其中WRKY22/28/72/75的log2FC接近10。由于受乙烯信號的刺激，乙烯響應因子 ERF（Cs7g19640、Cs7g04300、Cs1g04680和Cs1g04650）顯著上調(diào)并且超過10倍以上。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子可作為防御基因表達中的正或負調(diào)節(jié)因子，并且是不同防御信號途徑的靶標[28]。擬南芥 WRKY70參與防御途徑之間的交互作用，對壞死細菌軟腐菌（Pectobacterium carotovorum）的抗性起重要作用，作為SA響應轉(zhuǎn)錄的激活因子又是JA響應轉(zhuǎn)錄的抑制劑[29]。AtWRKY70在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）感染中被誘導，并且wrky70突變體表現(xiàn)出對此菌的敏感性增強，卻對死體營養(yǎng)型真菌蕓薹生鏈格孢具有抗性[30]。本研究中紅橘的WRKY70作為擬南芥AtWRKY的同源基因，也受鏈格孢菌橘致病型激活，說明WRKY70對植物抵御死體營養(yǎng)型真菌的機制有一定相似性。擬南芥wrky33突變體對上述兩種菌均非常敏感，表明WRKY33是對這些死體營養(yǎng)型真菌防御的關(guān)鍵正調(diào)控因子[31]。WRKY33整合寄主信號傳導以賦予對病原體攻擊抗性的作用模式，并且WRKY33與MAP4及MPK4的底物MKS1在細胞核相互作用來實現(xiàn)對抗病信號的調(diào)控[32-33]。在菊花中也篩選到一個響應鏈格孢的轉(zhuǎn)錄因子基因CmWRKY33.1，通過在菊花中過表達證實該基因亦能增強菊花對該菌的敏感性[34]。過表達菊花的另一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因CmWRKY15可激活ABA相關(guān)下游基因，增加過表達植株對細極鏈格孢（A. tenuissima）的敏感性[35]。在甜橙基因組中預計有超過50個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，本試驗接種鏈格孢菌橘致病型28 h后通過MapMan注釋到WRKY成員中80%以上顯著上調(diào)，紅橘受該菌脅迫后激活轉(zhuǎn)錄因子的主要成員為WRKY，其轉(zhuǎn)錄的部分成員可能是紅橘對鏈格孢菌橘致病型的感病基因。

APETALA2/乙烯響應元件結(jié)合因子（AP2/ERF）家族構(gòu)成一個大型植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族，擬南芥中有140多個成員，水稻中有160個成員[36]。轉(zhuǎn)錄分析揭示AP2/ERF型轉(zhuǎn)錄因子家族成員在病原菌攻擊后被強烈誘導。ERF亞家族成員顯示出對 GCC序列（AGCCGCC）的最大親和力，并且參與對生物應激響應基因的調(diào)節(jié)，特別是與JA和ET信號傳導途徑相關(guān)的基因[37-39]。過表達ERF1的轉(zhuǎn)基因擬南芥系足以賦予植株對灰葡萄孢、棉花枯萎病菌（F. oxysporum）和小不整球殼菌（Plectosphaerellacucumerina）的抗性[40-41]。ERF59/ORA59的過表達增強對灰葡萄孢的抗性，而RNAi-ORA59沉默的株系更易受影響[36]。ERF1和ERF59/ORA59似乎都是JA和ET信號通路的關(guān)鍵整合子[25]。ORA59被證明是抵消SA介導的JA/ET應答基因抑制的關(guān)鍵介質(zhì)[42]。在鏈格孢菌橘致病型侵染過程中紅橘的ERF家族成員受病原菌劇烈誘導，也說明紅橘在響應該菌侵染的過程中ET水平改變作為信號刺激下游抗病基因表達來實現(xiàn)抗菌目的。

3.3 植物次級代謝產(chǎn)物介導的防御反應

苯丙烷代謝途徑是參與植物防御反應的主要次級代謝產(chǎn)物通路之一，該途徑主要通過誘導植物產(chǎn)生具有抗病原微生物活性的次級代謝產(chǎn)物[43]。ZHU等[44]在對蘋果響應鏈格孢菌蘋果致病型（A.alternataapple pathotype）的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶基因被誘導表達，該基因參加修飾多種植物抗毒素。氧脂素作為一種具有保護作用的分子，其相關(guān)的合成基因LOX也受該菌誘導。本研究中β-葡萄糖苷酶基因和LOX同源基因也受鏈格孢菌橘致病型誘導大量表達。另外，木質(zhì)素合成相關(guān)的漆酶（Cs6g07400、Cs6g07410）、HCT（Cs7g29080）、COMT（Cs5g18010、orange1.1t05423、Cs5g24990、orange1.1t00578、Cs5g24910）表達量均超出對照 6倍以上。DORIA等利用雙向電泳研究柑橘響應該菌的蛋白質(zhì)組學也發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素合成相關(guān)基因 Caffeic acid 3-O-methyltransferase-like（COMT）和 Caffeoyl-coa O-methyltransferase-like（CCOMT）顯著上調(diào)表達[45]。煙草在抵御鏈格孢菌煙草致病型（A. alternatatobacco pathotype）時能響應激發(fā)子誘導的JA信號苯丙烷途徑中feruloyl-CoA 6′-hydroxylase 1表達生成東莨菪素[46]。此外，在紅橘響應鏈格孢菌橘致病型的過程中，咖啡因代謝途徑中的差異基因（Cs2g30140和Cs7g23340）均顯著上調(diào)，因此次生代謝產(chǎn)物能直接或間接地參與紅橘對該菌的抗病過程。

類異戊二烯或萜類化合物是一組用于生長和發(fā)育的化學物質(zhì)，但也具有抵抗不同壓力的特殊功能[47]，煙草中的ERF轉(zhuǎn)錄因子受ET和JA信號調(diào)控，能激活下游的EAS12表達合成倍半萜類抗菌物質(zhì)甜椒醇抑制鏈格孢菌煙草致病型[48]。水稻OsTPS19超表達幫助植株產(chǎn)生大量檸檬烯從而抵御稻瘟病菌[49]。正常狀態(tài)下植物的萜類物質(zhì)具有參與抑制病原菌生長并且在植物體內(nèi)傳遞抗病信號的作用[50]，然而紅橘被鏈格孢菌橘致病型侵染過程中MapMan注釋的萜類合成30個基因中22個呈現(xiàn)下調(diào)表達，而在激素信號中ET和JA信號又呈現(xiàn)出上調(diào)表達，表明該菌對紅橘體內(nèi)萜類骨架的破壞導致抗病的萜烯類物質(zhì)合成受影響，造成萜類物質(zhì)含量不足以抑制該菌導致感病。

3.4 紅橘防御鏈格孢菌橘致病型侵染的 ROS信號及ROS清除

ROS產(chǎn)生與清理之間的平衡會受到許多不利因素的干擾，植物受到嚴重脅迫時 ROS平衡會被打破[51]。病原菌攻擊會造成大量的ROS產(chǎn)生來抑制病菌在植物體內(nèi)繁殖，病菌和植物體雙方都通過清除ROS維持自身細胞活性，鏈格孢菌通過NADPH氧化酶和過氧化物酶耐受植物產(chǎn)生的 ROS保證其毒力[10]。NADPH氧化酶是植物-病原體互作過程中產(chǎn)生 ROS的主要因子之一，通過將電子從細胞內(nèi)NADPH轉(zhuǎn)移到質(zhì)外體中的分子氧來催化超氧化物產(chǎn)生的跨膜蛋白[52]，可通過自發(fā)歧化或細胞壁超氧化物歧化酶（SOD）的催化活性將超氧化物進一步轉(zhuǎn)化為H2O2。ROS產(chǎn)生的主要來源是NADPH氧化酶[53]。本研究顯示柑橘能通過識別鏈格孢菌橘致病型的PPR導致CDPK活性升高，促使下游NADPH氧化酶同源基因rboh-Cs8g12000和Cs3g14240顯著升高來調(diào)控ROS抑制該病原菌生長。

過氧化物酶類如抗壞血酸過氧化物酶（APX）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）被證實為植物受到病原菌侵染時產(chǎn)生的病程相關(guān)蛋白，是有效的活性氧清除劑，在植物調(diào)控細胞的氧化還原動態(tài)平衡、防御反應及脅迫響應中具有重要作用[54]。植物中的酶法 ROS清除機制還包括SOD和過氧化氫酶（CAT），在鏈格孢菌橘致病型接種后的紅橘中檢測到Cs2g09310、Cs2g28680和Cs7g20700等20多個POD成員均受到真菌毒素刺激活性氧信號激發(fā)大量表達，其他抗氧化途徑中包括超過30個谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）受ROS誘導，抗壞血酸合成酶和APX都有不同程度上調(diào)，而在不同品種柑橘響應鏈格孢菌橘致病型的雙向電泳中篩選出的差異蛋白同樣發(fā)現(xiàn)GSTAPX[45]，從轉(zhuǎn)錄層面和蛋白層面說明感病柑橘通過保護酶系統(tǒng)調(diào)整自身內(nèi)部的ROS平衡來對抗該菌。

4 結(jié)論

鏈格孢菌橘致病型的侵染引起紅橘大量基因差異表達。利用qRT-PCR驗證了19個差異基因的表達量變化，均與 RNA-seq分析結(jié)果一致。GO功能分類顯示差異基因主要與分子功能、細胞成分和生物過程相關(guān)。KEGG和MapMan分析表明，受鏈格孢菌橘致病型誘導上調(diào)的差異表達基因可富集到病原菌識別、信號轉(zhuǎn)導、活性氧消除、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、次生代謝反應病程相關(guān)蛋白等生物脅迫相關(guān)基因類別。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，大量萜類合成酶在受鏈格孢菌橘致病型侵染后呈現(xiàn)下調(diào)表達，推測是紅橘對該菌敏感的原因。