陳銳棋 黃思聰

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，廣東省廣州市 510120； 2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是組織工程較為理想的種子細(xì)胞，具有自我更新和增殖能力，能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等分化[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)可通過誘導(dǎo)間充質(zhì)骨祖細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟和功能，是促進(jìn)骨和軟骨恢復(fù)的重要分子[2]，其中BMP-2是最有效的骨生長因子，能有效促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[3]。然而，BMP-2存在半衰期短、臨床所需劑量大、高成本等缺點(diǎn)，而且大劑量使用BMP-2會(huì)誘發(fā)炎癥反應(yīng)，對(duì)骨組織的修復(fù)得不償失[4]。因此BMP-2的使用濃度目前是其臨床使用的一個(gè)重要討論方向。本研究希望通過探討B(tài)MP-2濃度對(duì)兔BMSCs(rBMSCs)生長及分化的作用并初步分析其可能的通路機(jī)制，了解BMP-2對(duì)BMSCs的生長規(guī)律的影響，旨在為臨床更好地利用BMSCs提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 BMP-2(PeproTech公司)，rBMSCs(廣州呼吸研究所制備與鑒定)；10%胎牛血清的MEM、0.25% 胰蛋白酶、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Beckman)，倒置相差顯微鏡(Leica)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma)及超凈工作臺(tái)(ESCO)。

1.2 rBMSCs復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng) 從液氮凍存瓶中取出rBMSCs凍存管復(fù)蘇至已含5ml 10%MEM培養(yǎng)液的T25中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。待T25里的細(xì)胞長至85%時(shí)(約6d)，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代至T75中培養(yǎng)。待T75里的細(xì)胞長至85%時(shí)(約6d)，傳代至3個(gè)T75，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞長至85%，1×PBS洗細(xì)胞后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，10%MEM培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)為約1×104，向4×24孔板中每孔加入0.5ml細(xì)胞工作液，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 BMP-2共培養(yǎng) 待步驟1.2細(xì)胞完全貼壁后(約24h)，其中3塊24孔板的各孔中分別加入終濃度為100ng/ml，50ng/ml、10ng/ml的BMP-2工作液。10%MEM為對(duì)照組。每4d換液1次共12d。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù) 每天用倒置相差顯微鏡觀察步驟1.3過程中細(xì)胞的形態(tài)特征，并用0.25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀4塊24孔板中的其中兩個(gè)孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)繪制兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線。

1.5 Notch通路相關(guān)分子檢測 提取及檢測試劑盒均購自天根公司，按操作說明檢測第6天及第12天步驟1.3處理過程中各組細(xì)胞Notch1/Jagged1/Hes1(見表1)表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果以2-△△Ct表示。

表1 Notch通路相關(guān)分子引物

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad-Prism-6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，生長曲線比較采用多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)方法，細(xì)胞組間數(shù)目和基因表達(dá)比較采用ANOVA分析進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05認(rèn)為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 BMP-2濃度對(duì)rBMSCs細(xì)胞增殖的影響 4組rBMSCs的生長曲線(圖1)顯示，前6d是指數(shù)增生期，第6天細(xì)胞的增殖生長出現(xiàn)退化現(xiàn)象，從第9天開始就逐漸進(jìn)入平臺(tái)期。多樣本秩和檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3個(gè)梯度濃度的BMP-2共培養(yǎng)的rBMSCS生長規(guī)律與對(duì)照組無明顯差別(P=0.729)。培養(yǎng)過程中第6、12天各組細(xì)胞量無明顯差異(P=0.625)。

2.2 BMP-2濃度對(duì)rBMSCs生長形態(tài)的影響 如圖2所示：第6天，對(duì)照組細(xì)胞基本保持長梭形，聚集生長現(xiàn)象不明顯。100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形向多角形、不規(guī)則形轉(zhuǎn)化，同時(shí)聚集生長現(xiàn)象明顯加強(qiáng)。第12天，3個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞形態(tài)呈多樣性，聚集生長明顯，但組間形態(tài)無明顯差異；而對(duì)照組細(xì)胞依然沒有呈現(xiàn)出聚集生長現(xiàn)象。

2.3 BMP-2濃度對(duì)rBMSCs生長過程中Notch通路相關(guān)分子表達(dá)的影響 Real-time PCR結(jié)果(圖3)顯示，第6天，與對(duì)照組細(xì)胞相比，100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的Notch1/Jagged1/Hes1表達(dá)均明顯上升，實(shí)驗(yàn)組間無明顯差異(P>0.05)。到第12天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各個(gè)基因表達(dá)均比第6天有不同程度的增加(P<0.05)，且依然高于培養(yǎng)同樣天數(shù)的對(duì)照組細(xì)胞；對(duì)照組細(xì)胞第6天與第12天比較，Notch1/Jagged1/Hes1表達(dá)無明顯改變(P>0.05)。

3 討論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的到來，各國越來越重視個(gè)體化治療的發(fā)展和應(yīng)用，隨著資金的注入和研發(fā)水平的提高，細(xì)胞治療也逐漸成為個(gè)體化治療的主要手段。干細(xì)胞治療手段在細(xì)胞治療中是目前世界各國爭相研究并取得重大進(jìn)展的領(lǐng)域[1]，其中在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和骨缺損修復(fù)等方面的成功尤為突出[2,5]。骨缺損治療一直是臨床骨科醫(yī)師所面臨的難題，雖然機(jī)體本身有創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制，但較大的創(chuàng)面缺損不能自行愈合。骨移植是治療大骨缺損的常用方法，但自體移植存在供區(qū)骨供應(yīng)有限、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)增加、手術(shù)時(shí)間延長等因素，異體植骨則可能會(huì)引起機(jī)體排斥反應(yīng)、疾病傳播、骨不連等并發(fā)癥，嚴(yán)重限制了骨移植的臨床應(yīng)用[6]。干細(xì)胞治療手段則為上述難題提供了新的治療突破口，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)屬于多能細(xì)胞，在早期發(fā)育中來自中胚層和外胚層[7]。首先在骨髓中發(fā)現(xiàn)，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，它不僅具有胚胎干細(xì)胞的分化功能，而且可以在體外大規(guī)模復(fù)制、培養(yǎng)和低溫保存[8]，被認(rèn)為是骨組織工程的種子細(xì)胞。BMSCs可生成包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，并在實(shí)現(xiàn)和維持適當(dāng)?shù)墓橇糠矫姘l(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]。

人骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-2(BMP-2)是一種強(qiáng)大的骨誘導(dǎo)蛋白，可以招募不同組織來源的MSCs并誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞[11]；2002年獲得了美國FDA的批準(zhǔn)，作為骨移植替代品用于脊柱融合和開放性脛骨骨折等[12]。BMP-2半衰期短，雖然高劑量的BMP-2可以產(chǎn)生良好的骨形成量，但也誘導(dǎo)了過度的炎癥反應(yīng)且導(dǎo)致并發(fā)癥(包括：骨質(zhì)量惡化、脂肪組織形成等)發(fā)生率顯著增加[13]，對(duì)骨損傷的修復(fù)得不償失。因此，高劑量BMP-2的有效性仍然是一個(gè)臨床關(guān)注的重要問題[4]。本次研究使用了100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3個(gè)梯度濃度的BMP-2共培養(yǎng)rBMSCs，以無添加BMP-2的rBMSCS為對(duì)照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)3種濃度的BMP-2與對(duì)照組的細(xì)胞增殖生長曲線的規(guī)律基本相同，提示在文中采用的濃度范圍內(nèi)，BMP-2對(duì)rBMSCs的增殖促進(jìn)能力并不明顯，需要提升rBMSCs的增殖效率可能需要更高濃度的BMP-2。而在BMP-2加入后，細(xì)胞形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)rBMSCs分化趨勢增強(qiáng)，同時(shí)聚集生長現(xiàn)象更明顯，表明BMP-2對(duì)rBMSCs向功能細(xì)胞分化還是具有強(qiáng)大的促進(jìn)作用，但結(jié)果顯示BMP-2濃度對(duì)rBMSCs生長形態(tài)的影響不大。

Notch信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡和分化程序[14]。靶細(xì)胞上的Notch受體(Notch1-4)通過配體Jagged(Jag1、Jag2) 與鄰近細(xì)胞結(jié)合而被激活，Hes1則是典型Notch信號(hào)通路的下游靶基因[15]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BMP-2的加入能有效活化rBMSCs的Notch通路，該通路的相關(guān)靶基因Notch1/ Jagged1/Hes1表達(dá)均有不同程度的上升，但同樣的，BMP-2濃度的改變并無引起Notch通路活化程度的差異，從Notch1/Jagged1/Hes1表達(dá)的變化可以看出，Notch通路的活化程度與rBMSCs生長分化趨勢相吻合。有研究報(bào)道在成骨細(xì)胞不同分化階段有條件地過表達(dá)Notch證實(shí)Notch通路的激活能有助BMSCs早期分化，促進(jìn)骨愈合[16]。結(jié)合本次結(jié)果，我們推測BMP-2對(duì)rBMSCs生長形態(tài)的影響可能通過Notch通路實(shí)現(xiàn)，但并無濃度依賴性。而Inzana研究則發(fā)現(xiàn)Notch通路活化及加速骨形成的程度與BMSCs的減少量一致[17]，暗示Notch可能對(duì)BMSCs增殖的促進(jìn)作用有限，一定程度上給結(jié)果2.1提供了合理的解釋。

綜上所述，BMP-2可能通過Notch通路促進(jìn)rBMSCs的分化，但沒有濃度依賴。提示如果保證BMSCs達(dá)到一定數(shù)量，較低濃度的BMP-2也可能達(dá)到有效促進(jìn)BMSCs分化，幫助骨愈合的效果，同時(shí)有機(jī)會(huì)減低高劑量BMP-2帶來過度炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。