梅 雯，孫如麗，李 云，熊 偉，趙 一*

（1.大理大學(xué)第四附屬醫(yī)院，云南楚雄 675000；2.楚雄彝族自治州第二人民醫(yī)院，云南楚雄 675000；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）是惡性程度較高的消化道腫瘤，5 年生存率不足8%〔1〕。臨床上90%以上的胰腺癌為胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC），胰腺癌起病隱匿，多以黃疸或腹痛為首發(fā)癥狀，就診時超過80%的患者已進入中晚期，出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去最佳手術(shù)時機，僅有少數(shù)可行根治性手術(shù)治療〔2〕。近年來胰腺癌相關(guān)診療方法取得了快速發(fā)展，對胰腺癌的治療采取外科手術(shù)、敏感的化療和放療聯(lián)合應(yīng)用，但患者術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)仍然嚴(yán)重影響著患者生存率。隨著腫瘤個體化治療和靶向治療技術(shù)的發(fā)展，從分子水平研究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)機制有利于發(fā)現(xiàn)新的分子靶點，提供新的治療手段和提高患者生存率，對臨床治療具有重要現(xiàn)實意義。

DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase，Topo）是一種存在于細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)DNA 空間動態(tài)變化的核內(nèi)蛋白質(zhì)。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶通過結(jié)合并水解ATP，催化DNA 鏈的斷裂和結(jié)合，影響DNA 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)〔3〕。拓?fù)洚悩?gòu)酶具有兩種同工酶，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（TopoⅠ）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ），TopoⅡ型在哺乳動物細(xì)胞中的催化活性由兩種不同的同工酶介導(dǎo)，分別為TopoⅡα和TopoⅡβ，這兩種酶在結(jié)構(gòu)和功能上是相似的，但在細(xì)胞周期的核定位和相對濃度上都不同，兩種酶編碼不同的基因產(chǎn)物，表達(dá)TopoⅡα 的基因是TOP2A（topoisomeraseⅡalpha）。TOP2A基因位于17q12-21染色體，在DNA 復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄、染色體濃縮及染色單體分離等過程發(fā)揮重要作用〔4〕。TOP2A表達(dá)水平的高低和數(shù)量變化可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。TOP2A主要在增殖細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。文獻(xiàn)報道，TOP2A是活躍增殖細(xì)胞的敏感特異標(biāo)記物，TOP2A在腫瘤細(xì)胞增殖的不同時相其表達(dá)水平有所差異，在S期晚期和G2∕M 期表達(dá)增加，在有絲分裂后下降，且TOP2A以細(xì)胞周期依賴的方式磷酸化〔5〕。有研究發(fā)現(xiàn)，TOP2A在多種不同類型的腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)，如腸癌、食管癌、肝癌、胃癌等多種類型癌癥，且TOP2A表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞增殖水平呈正相關(guān)〔6-9〕。TOP2A的異常表達(dá)最常發(fā)生在乳腺癌中，被視為乳腺癌發(fā)展進程中的重要預(yù)后分子指標(biāo)〔10〕。TOP2A在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用，并與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，但目前關(guān)于TOP2A與胰腺癌的相關(guān)研究鮮有報道。從分子水平深入研究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展機制，尋找高靈敏度的分子標(biāo)志物，對胰腺癌的早期篩查和臨床診斷具有重要意義。本研究旨在利用現(xiàn)有的各種腫瘤生物信息數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)挖掘分析TOP2A基因在胰腺癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義，為TOP2A基因在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制提供線索和思路。

1 資料與方法

1.1從ONCOMINE數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)在ONCOMINE v4.5 數(shù)據(jù)庫中設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件為：①Gene：TOP2A；②Analysis Type：Cancervs.Normal Analysis；③Cancer Type：Pancreatic Cancer；④Data Type：mRNA；⑤Sample Type：Clinical Specimen；⑥臨界值設(shè)定條件（Pvalue＜1E-4，fold change 2，gene rank=top 10%，data type=all）。

1.2從GEPIA數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)在GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：∕∕gepia.cancer-pku.cn∕）中 設(shè)定 篩選 和 挖 掘數(shù)據(jù)的條件為：①Gene：TOP2A；②Cancer name：PAAD（pancreatic adenocarcinoma）；③“Expression on Box Polts”框中設(shè)置條件|Log2FC |Cutoff：1，P-value Cutoff：0.01；④“Pathological Stage Plot”輸入TOP2A；⑤“Similar Genes Detection”選 擇PAAD Tumor 和PAAD Normal；然后輸入相應(yīng)基因進行分析。

1.3 MethHC數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)在MethHC 數(shù)據(jù)庫（http：∕∕methhc.Mbc.Nctu.Edu.tw）中設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件為：①Gene Reach：PAAD；②“Elect a gene region”中選擇Promoter；③List your interested genes：TOP2A。

1.4 String數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)String數(shù)據(jù)庫（https：∕∕string-db.org ∕）中設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件為：①Protein name：TOP2A；②Organism：Homo sapiens；③Munber of nodes：11；④PPI enrichmentP-value：1.3E-10；⑤High confidence：0.700；⑥Max number of interactors to show：10。

1.5從Kmplot數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)在Kmplot 數(shù)據(jù)庫（http：∕∕kmplot.com∕analysis∕）中設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件為：①RNA-seq；②Gene：TOP2A；③Cancer symbol：pancreatic ductal adenocarcinoma；④Survival：分別選擇總體生存率（overall survival，OS）和無復(fù)發(fā)生存期（relapse-free survival，RFS）。

1.6 The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件為：TOP2A。數(shù)據(jù)庫共有3 種TOP2A 免疫組化抗體（No：HPA006458，No：HPA026773，No：CAB002448），對正常胰腺組織和胰腺癌組織進行免疫組化實驗。選擇克隆號為No：HPA006458 的抗體對1 例正常胰腺組織和11 例胰腺癌組織的TOP2A蛋白表達(dá)程度進行分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析正常組織與腫瘤組織之間TOP2A基因表達(dá)差異采用t檢驗。TOP2AmRNA 表達(dá)水平與胰腺癌患者病理分期的關(guān)系采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。TOP2A基因表達(dá)量與患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier 和Log-Rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TOP2A在部分腫瘤類型中的表達(dá)ONCOMINE數(shù)據(jù)庫共有462 項研究結(jié)果涉及TOP2A在腫瘤組織與對應(yīng)非腫瘤組織中表達(dá)差異的比較。其中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的有132 項，TOP2A高表達(dá)的研究有125 項，低表達(dá)的研究有7 項（P＜0.05）。TOP2A在消化系統(tǒng)腫瘤的表達(dá)情況見表1。

表1 ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中TOP2A表達(dá)有差異的消化系統(tǒng)腫瘤

2.2TOP2A在胰腺癌中的表達(dá)結(jié)果提取ONCOMINE v4.5 數(shù)據(jù)庫中的信息發(fā)現(xiàn)，從2003 年至2009年，共有10 個子數(shù)據(jù)集涉及TOP2A在胰腺癌組織和正常組織中的表達(dá)，共包括322 個樣本。文章分 別發(fā)表于Hepatogastroenterology〔11〕、Oncogene〔12〕、Neoplasia〔13〕、Cancer Sci〔14〕、Cancer Cell〔15〕、Clin Cancer Res〔16〕和Am J Pathol〔17〕。對10 個子數(shù)據(jù)集薈萃分析發(fā)現(xiàn)，與正常胰腺組織（對照組）相比，TOP2A在胰腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，中位表達(dá)數(shù)值為1 169.0，P=0.008，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3TOP2A在不同胰腺癌研究芯片的表達(dá)差異在ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中，獲取TOP2AmRNA在胰腺癌研究芯片中的表達(dá)結(jié)果，對相關(guān)數(shù)據(jù)作箱圖比較分析，有7 項研究（Lacobuzio-Donahue Pancreas 2，Pei Pancreas， Grutzmann Pancreas， Logsdon Pancreas，Segara Pancreas， Buchholz Pancreas， Badea Pancreas）均顯示，相較于正常胰腺組織，TOP2AmRNA 在胰腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1A～G。但其中1 項研究（Ishikawa Pancreas）中，TOP2AmRNA 在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.109）。見圖1H。

圖1 ONCOMINE芯片數(shù)據(jù)庫TOP2A mRNA在正常胰腺組織和胰腺癌組織研究芯片中的表達(dá)差異

2.4TOP2A與多個基因的相關(guān)性分析基于GEPIA數(shù)據(jù)庫基因相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胰腺癌組織TOP2A的mRNA表達(dá)水平與CDK1、HDAC1、NFE2L3、MTERF3、OLA1和RRM1基因mRNA 表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，R＞0）。見圖2。

圖2 TOP2A mRNA表達(dá)水平在胰腺癌患者中與其他基因mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

2.5TOP2AmRNA表達(dá)水平與胰腺癌患者病理分期的關(guān)系從GEPIA 數(shù)據(jù)庫下載TOP2AmRNA 表達(dá)水平與胰腺癌患者病理分期的相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示TOP2AmRNA 表達(dá)水平在胰腺癌患者不同病理分期中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），單因素方差分析得出F值為1.64，其對應(yīng)P值為0.183。見圖3。

圖3 TOP2A mRNA表達(dá)水平與胰腺癌患者病理分期的關(guān)系

2.6TOP2AmRNA表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性為了進一步明確TOP2AmRNA 表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，在Kmplot 數(shù)據(jù)庫中對TOP2AmRNA 表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)的數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果表明，TOP2AmRNA 表達(dá)量與胰腺癌患者的OS和RFS均有顯著相關(guān)性，與TOP2AmRNA低表達(dá)組相比，TOP2AmRNA 高表達(dá)組胰腺癌患者總體生存時間和無復(fù)發(fā)生存時間顯著縮短（OS：LogrankP=4.9E-0.5；RFS：LogrankP=0.000 75）。見圖4。

圖4 胰腺癌患者的預(yù)后與TOP2A mRNA表達(dá)水平的關(guān)系

2.7TOP2A啟動子區(qū)DNA甲基化水平分析從Meth-HC數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示TOP2A共有1個轉(zhuǎn)錄模板，編號為NM_001067，在胰腺導(dǎo)管腺癌中TOP2A啟動子區(qū)甲基化與正常胰腺組織甲基化水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 正常胰腺組織和胰腺導(dǎo)管腺癌TOP2A啟動子區(qū)甲基化水平比較

2.8 TOP2A相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)在String 數(shù)據(jù)庫中按照篩選條件，篩選出相互作用強度排位靠前的10 個與TOP2A 有相互作用的蛋白質(zhì)，分別是NCAPG、CDC20、UBE2C、PBK、TPX2、DLGAP5、CCNB2、TOP1、CDK1、BUB1。見圖6。這些蛋白相互作用，可能參與了胰腺癌細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等功能，在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

圖6 與TOP2A相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

2.9 TOP2A蛋白在胰腺癌中的表達(dá)情況在The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中，選擇克隆號為No：HPA006458 的抗體，分析TOP2A 蛋白在1 例正常胰腺組織和11 例典型胰腺癌組織中的表達(dá)情況。其中有5 例胰腺癌組織蛋白表達(dá)及抗體染色程度為“高等”水平；6例為“中等”水平；0例為“低等”水平。TOP2A 蛋白在胰腺癌組織中較正常胰腺組織高表達(dá)（左側(cè)正常組患者id 2032，蛋白表達(dá)水平低；右側(cè)腫瘤組患者id 1320，蛋白表達(dá)水平高）。見圖7。

圖7 TOP2A蛋白在正常胰腺組織和胰腺癌中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色）

3 討論

ONCOMINE 數(shù)據(jù)庫是目前世界最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫，提供癌癥全面的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床信息，整合了TCGA、GEO 和已發(fā)表文獻(xiàn)來源的DNA 和RNA-seq 數(shù)據(jù)。GEPIA 是由北京大學(xué)開發(fā)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析網(wǎng)站，其數(shù)據(jù)來自于TCGA 和GTEx 兩大數(shù)據(jù)庫。MethHC數(shù)據(jù)庫其數(shù)據(jù)來自于TCGA，用于分析18 種腫瘤和對應(yīng)正常組織DNA 甲基 化和mRNA∕miRNA 相 關(guān)信 息。String 數(shù)據(jù)庫可用以提取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫采用特制抗體檢測每種蛋白在人正常組織、腫瘤組織、細(xì)胞系和血液內(nèi)的分布和表達(dá)情況，結(jié)果用免疫組織化學(xué)染色圖表示。為了更好地了解TOP2AmRNA 和蛋白在胰腺癌組織中的作用及其機制，通過數(shù)據(jù)挖掘，分析并探討其在胰腺癌組織中的表達(dá)水平及預(yù)后意義，為進一步研究TOP2A在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制提供理論依據(jù)。

目前關(guān)于TOP2A與腫瘤進展的研究大多集中在其對DNA 結(jié)構(gòu)的調(diào)控上。TOP2A通過調(diào)控DNA鏈的斷裂和重新連接，從而影響DNA 的拓?fù)錉顟B(tài)和復(fù)制。研究表明，腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和化療藥物耐藥性等主要是通過調(diào)節(jié)DNA 拓?fù)錉顟B(tài)和DNA 復(fù)制來實現(xiàn)〔18〕。有研究表明，TOP2A通常在增殖活躍的細(xì)胞中過度表達(dá)，并且高表達(dá)可能與癌細(xì)胞侵襲性有關(guān)〔5〕。據(jù)報道，TOP2A過表達(dá)與脂肪肉瘤和肝細(xì)胞癌等癌癥的侵襲性密切相關(guān)〔19-20〕。另外有研究報道TOP2A在胰腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且高表達(dá)患者生存率較低，TOP2A可激活Wnt-β-catenin 通路，誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而增加癌基因的轉(zhuǎn)錄，TOP2A的高表達(dá)可能與癌細(xì)胞生長速度、浸潤程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力等有關(guān)〔21〕。通過比較TOP2A在胰腺癌和正常胰腺組織中的表達(dá)，對ONCOMINE 數(shù)據(jù)庫和The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中的TOP2A分析發(fā)現(xiàn)，mRNA 水平和蛋白水平在胰腺癌中均呈高表達(dá)（P＜0.05）。此外，TOP2A在乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌等惡性腫瘤中的預(yù)后價值已得到證實〔22-24〕。然而，目前TOP2A在胰腺癌中的預(yù)后價值尚未得到證實。通過Kmplot 數(shù)據(jù)庫中下載TOP2AmRNA 表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，TOP2AmRNA 與胰腺癌患者OS 和RFS 均有相關(guān)性，TOP2AmRNA 高表達(dá)者比低表達(dá)者預(yù)后差。因此，推測TOP2A可能成為胰腺癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。另外通過基因相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TOP2A與CDK1、HDAC1和NFE2L3等基因有顯著相關(guān)性，這些基因可能相互作用參與了胰腺癌的發(fā)生與發(fā)展過程。在String 數(shù)據(jù)庫中按照篩選條件，篩選出相互作用強度排位靠前的10 個與TOP2A 有相互作用的蛋白質(zhì)，這些蛋白相互作用，導(dǎo)致TOP2A在調(diào)節(jié)DNA 結(jié)構(gòu)方面的活性發(fā)生改變，可能參與了胰腺癌細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等功能，在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，而具體機制需進一步實驗驗證加以闡明。值得注意的是，TOP2AmRNA 表達(dá)水平與胰腺癌臨床分期差異無統(tǒng)計學(xué)意義，分析可能原因：①上述研究結(jié)論僅僅是在轉(zhuǎn)錄水平上得出的，有一定局限性；②TOP2AmRNA 表達(dá)水平與胰腺癌臨床分期的關(guān)系受眾多因素共同參與調(diào)節(jié)，絕非某一個促癌因子能起到?jīng)Q定性作用，TOP2A的作用勢必被其他拮抗因子影響，而具體原因需進行后續(xù)研究加以驗證。

總之，通過腫瘤基因數(shù)據(jù)庫相關(guān)基因信息的深入挖掘發(fā)現(xiàn)，在mRNA 水平和蛋白水平上，TOP2A在胰腺癌組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與胰腺癌的預(yù)后有明顯關(guān)聯(lián)，通過對數(shù)據(jù)庫進行大量數(shù)據(jù)挖掘為發(fā)現(xiàn)胰腺癌新的分子靶點奠定理論基礎(chǔ)，也為今后胰腺癌的研究提供重要線索和數(shù)據(jù)支持。與此同時，數(shù)據(jù)庫高效能的分析能力和大量的樣本使分析結(jié)果具有極大的參考價值，避免了由于研究樣本量過小產(chǎn)生的誤差，合理利用已有信息資源，縮短科研周期，降低科研成本。