楊萬(wàn)運(yùn)，冷嘉琦，羅艷玲，韓瑞花，王智軍

(山東威高藥業(yè)股份有限公司，山東 威海 264210)

復(fù)方氨基酸注射液的飛速發(fā)展使得臨床危重癥患者得到良好的腸外營(yíng)養(yǎng)支持，保證了機(jī)體的正氮平衡，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的合成[1]。復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液是含有甘氨酰谷氨酰胺和甘氨酰酪氨酸及15種氨基酸的腸外營(yíng)養(yǎng)注射劑。在放置和生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸、焦谷氨酸、環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)等雜質(zhì)。其中谷氨酸在受熱過(guò)程中會(huì)脫水發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成焦谷氨酸，甘氨酰谷氨酰胺發(fā)生氨基酸脫水縮合反應(yīng)，生成環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)[2]。焦谷氨酸具有一定的對(duì)谷氨酸等受體的阻斷作用，也可能引起神經(jīng)毒性和代謝異常，這些雜質(zhì)的存在對(duì)復(fù)方氨基酸注射液的臨床用藥安全構(gòu)成了潛在的威脅。

本文采用離子交換樹(shù)脂[3]處理樣品后再用HPLC法同時(shí)測(cè)定焦谷氨酸、環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)和焦谷氨酸的含量。方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，適用于復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DV215CD電子分析天平(奧豪斯)；pHS-3C型(雷磁)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；離子交換柱(取Dowex 50W×8離子交換樹(shù)脂適量，填充置內(nèi)徑為1.5cm的萃取小柱中，填充高度為7cm，用水淋洗并懸浮于水中)。

1.2 試藥

樣品：復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液；對(duì)照品：焦谷氨酸(廠家：西格瑪)，環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)(廠家：中檢院)，(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸(廠家：自制)；磷酸二氫鈉和磷酸均為分析純，試驗(yàn)用水為水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain AQ-C18(4.6×250mm,5μm)；流動(dòng)相：0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH值=2.1)；流速：1.0mL/min；柱溫：18℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm；進(jìn)樣量：50μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸對(duì)照品6mg，焦谷氨酸對(duì)照品17.5mg，環(huán)-甘氨酰谷氨酰胺對(duì)照品26.5mg，置50mL容量瓶中，用水定容至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。精密量取2mL，加至離子交換柱(內(nèi)徑1.5cm，高7cm，，填料Dowex 50W×8經(jīng)20mL水淋洗并懸浮于水中)，用水洗脫，收集洗脫液于100mL 容量瓶中，定容至刻度，搖勻即得混和對(duì)照溶液。同法配制單個(gè)雜質(zhì)對(duì)照溶液。

2.2.2 供試品溶液與空白輔料的制備

分別精密量取復(fù)方氨基酸雙肽注射液樣品，空白輔料(液體制劑室提供)2mL加至離子交換柱內(nèi)(內(nèi)徑1.5cm高7cm)，用水洗脫，收集洗脫液于100mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專(zhuān)屬性考察

分別精密量取上述溶液各50μL，按2.1所述液相色譜條件分析檢測(cè)。結(jié)果 表明溶劑及空白輔料的色譜圖中(圖1)，均無(wú)環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)峰、(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸和焦谷氨酸峰，表明溶劑和空白輔料均不干擾測(cè)定；3種雜質(zhì)與其他峰分離度均大于1.5，本色譜條件專(zhuān)屬性良好。

自上至下，樣品；(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸對(duì)照溶液；混合對(duì)照溶液；空白輔料；溶劑

2.3.2 線性關(guān)系考察

稱(chēng)取焦谷氨酸氨酸、環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)對(duì)照品適量，用水溶解，分別將溶液稀釋成每1mL水中含環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)約為2、4、6、8、10、12和15μg，含焦谷氨酸1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4和9.9μg，含(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸約為0.017、0.96、1.68、2.40、3.12和3.84μg的混合對(duì)照溶液。取上述溶液注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量(μg)為X軸，以峰面積為Y軸進(jìn)行線性回歸，得環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)回歸方程y=2254343x+7301，r=1.000；焦谷氨酸回歸方程：y=992116x+186.5，r=0.9999，見(jiàn)表1和圖2；(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸回歸方程為y=50672x-187.89，r=1.000，結(jié)果表明：3種雜質(zhì)的進(jìn)樣量與其峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

表1 樣品中焦谷氨酸線性結(jié)果

圖2 焦谷氨酸線性圖

2.3.3 定量限與檢測(cè)限考察

分別稱(chēng)取3種雜質(zhì)對(duì)照品適量，當(dāng)環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)進(jìn)樣量為0.318ng時(shí)，其峰高約為噪音的11倍，其定量限為0.29ng；環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)進(jìn)樣量為0.095ng時(shí)，其峰高約為噪音的3倍，其檢測(cè)限為0.095ng。焦谷氨酸進(jìn)樣量為0.281ng時(shí)，其峰高約為噪音的10倍，其定量限為0.28ng；焦谷氨酸進(jìn)樣量為0.084ng時(shí)，其峰高約為噪音的5倍，其檢測(cè)限為0.05ng。(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸進(jìn)樣量為0.833ng時(shí)，其峰高約為噪音的9.8倍，其定量限為0.85ng；(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸進(jìn)樣量為0.25ng時(shí)，其峰高約為噪音的3倍，其檢測(cè)限為0.25ng。

2.3.4 精密度試驗(yàn)

按照“2.2.2”中供試品溶液制備方法，平行制備六份樣品，記錄峰面積，測(cè)得六份樣品中環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)含量的RSD(n=6)為0.36%，焦谷氨酸含量的RSD為0.61%(n=6)，(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸含量的RSD(n=6)為0.14%。由不同的分析人員在不同時(shí)間、不同的儀器進(jìn)行測(cè)定，平行制備六份樣品，計(jì)算兩人所得12份樣品中3種雜質(zhì)含量的RSD(n=12)均小于1%，表明本方法精密性良好。

2.3.5 加樣回收率考察

精密稱(chēng)取3種雜質(zhì)適量，加水制成每1mL含環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)1.07mg，焦谷氨酸0.73mg和(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸0.3mg的混合對(duì)照品溶液，精密量取樣品1mL加對(duì)照溶液0.5mL加至離子交換柱內(nèi)(內(nèi)徑1.5cm，高7cm)，用水洗脫，收集洗脫液于100mL量瓶中，定容至刻度，搖勻即得。平行配制3份，作為70%回收率供試品溶液。精密量取樣品1mL加對(duì)照溶液0.75mL。同上述方法，制得100%回收率供試品溶液，精密量取樣品1mL加對(duì)照溶液1mL，制得100%加樣回收樣品溶液，每個(gè)濃度平行制備3份，計(jì)算回收率。試驗(yàn)結(jié)果表明：環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)、焦谷氨酸和(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸的回收率均在98%～102%范圍中，且回收率RSD%均小于1.5%，結(jié)果表明本法的準(zhǔn)確度可靠。

3.2 離子交換柱對(duì)雜質(zhì)檢測(cè)的影響

取3種雜質(zhì)對(duì)照品適量，加水溶解，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，未過(guò)離子交換柱，分別制成50%，100%，150%的混合對(duì)照品溶液；同法取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加至離子交換柱內(nèi)(內(nèi)徑1.5cm，高7cm，填料Dowex 50W×8經(jīng)20mL水淋洗并懸浮于水中)，加水淋洗，收集流出液，分別制成50%，100%，150%的混合對(duì)照品溶液。

分別精密量取上述溶液各50μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，通過(guò)過(guò)柱前后相關(guān)物質(zhì)的峰面積比值表現(xiàn)離子交換柱對(duì)雜質(zhì)的吸附能力(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示，過(guò)離子交換柱前后，3種雜質(zhì)的峰面積均無(wú)顯著性變化，表明離子交換柱對(duì)雜質(zhì)無(wú)吸附性，本方法可準(zhǔn)確檢測(cè)本品中所含雜質(zhì)。

表2 離子交換柱對(duì)雜質(zhì)檢測(cè)的影響

3.3 洗脫曲線

精密量取混合對(duì)照2mL，加至離子交換柱內(nèi)，每5mL洗脫液接入一個(gè)試管中，分別取50μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)(1)的平均過(guò)柱收率為98.51%，焦谷氨酸(2)的平均過(guò)柱收率為98.98%。通過(guò)測(cè)定洗脫液中各相關(guān)組分的峰面積，繪制洗脫曲線，從洗脫曲線可知，當(dāng)供試品洗脫20次(約100mL)時(shí)，焦谷氨酸氨酸和環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)幾乎全部被洗脫下來(lái)，見(jiàn)圖3，證明使用離子交換樹(shù)脂進(jìn)行吸附的方法可行。

圖3 洗脫曲線圖

3 結(jié)論

基于離子交換樹(shù)脂可吸附多種氨基酸的原理來(lái)研究氨基酸類(lèi)藥物中特定相關(guān)物質(zhì)的方法，此方法可有效去除多種氨基酸以降低對(duì)目標(biāo)雜質(zhì)的檢測(cè)干擾。但尚無(wú)3種雜質(zhì)的目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)方法和過(guò)柱后是否有殘留的相關(guān)數(shù)據(jù)，本研究基于此，建立了相關(guān)驗(yàn)證方法，可直觀確定目標(biāo)物質(zhì)經(jīng)離子交換樹(shù)脂后是否可以洗脫完全，與藥物中其他氨基酸類(lèi)成分分離完全。

研究結(jié)果表明本方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，靈敏度高，可用于復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，能有效地反應(yīng)藥品質(zhì)量，適用于該藥物的質(zhì)量控制。