楊萬運，冷嘉琦，羅艷玲，韓瑞花，王智軍

(山東威高藥業(yè)股份有限公司，山東 威海 264210)

復方氨基酸注射液的飛速發(fā)展使得臨床危重癥患者得到良好的腸外營養(yǎng)支持，保證了機體的正氮平衡，促進了蛋白質(zhì)的合成[1]。復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液是含有甘氨酰谷氨酰胺和甘氨酰酪氨酸及15種氨基酸的腸外營養(yǎng)注射劑。在放置和生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸、焦谷氨酸、環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)等雜質(zhì)。其中谷氨酸在受熱過程中會脫水發(fā)生環(huán)化反應生成焦谷氨酸，甘氨酰谷氨酰胺發(fā)生氨基酸脫水縮合反應，生成環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)[2]。焦谷氨酸具有一定的對谷氨酸等受體的阻斷作用，也可能引起神經(jīng)毒性和代謝異常，這些雜質(zhì)的存在對復方氨基酸注射液的臨床用藥安全構(gòu)成了潛在的威脅。

本文采用離子交換樹脂[3]處理樣品后再用HPLC法同時測定焦谷氨酸、環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)和焦谷氨酸的含量。方法重現(xiàn)性好，準確度高，適用于復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DV215CD電子分析天平(奧豪斯)；pHS-3C型(雷磁)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；離子交換柱(取Dowex 50W×8離子交換樹脂適量，填充置內(nèi)徑為1.5cm的萃取小柱中，填充高度為7cm，用水淋洗并懸浮于水中)。

1.2 試藥

樣品：復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液；對照品：焦谷氨酸(廠家：西格瑪)，環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)(廠家：中檢院)，(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸(廠家：自制)；磷酸二氫鈉和磷酸均為分析純，試驗用水為水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain AQ-C18(4.6×250mm,5μm)；流動相：0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH值=2.1)；流速：1.0mL/min；柱溫：18℃；檢測波長：205nm；進樣量：50μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸對照品6mg，焦谷氨酸對照品17.5mg，環(huán)-甘氨酰谷氨酰胺對照品26.5mg，置50mL容量瓶中，用水定容至刻度，作為混合對照品溶液。精密量取2mL，加至離子交換柱(內(nèi)徑1.5cm，高7cm，，填料Dowex 50W×8經(jīng)20mL水淋洗并懸浮于水中)，用水洗脫，收集洗脫液于100mL 容量瓶中，定容至刻度，搖勻即得混和對照溶液。同法配制單個雜質(zhì)對照溶液。

2.2.2 供試品溶液與空白輔料的制備

分別精密量取復方氨基酸雙肽注射液樣品，空白輔料(液體制劑室提供)2mL加至離子交換柱內(nèi)(內(nèi)徑1.5cm高7cm)，用水洗脫，收集洗脫液于100mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性考察

分別精密量取上述溶液各50μL，按2.1所述液相色譜條件分析檢測。結(jié)果 表明溶劑及空白輔料的色譜圖中(圖1)，均無環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)峰、(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸和焦谷氨酸峰，表明溶劑和空白輔料均不干擾測定；3種雜質(zhì)與其他峰分離度均大于1.5，本色譜條件專屬性良好。

自上至下，樣品；(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸對照溶液；混合對照溶液；空白輔料；溶劑

2.3.2 線性關系考察

稱取焦谷氨酸氨酸、環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)對照品適量，用水溶解，分別將溶液稀釋成每1mL水中含環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)約為2、4、6、8、10、12和15μg，含焦谷氨酸1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4和9.9μg，含(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸約為0.017、0.96、1.68、2.40、3.12和3.84μg的混合對照溶液。取上述溶液注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。以進樣量(μg)為X軸，以峰面積為Y軸進行線性回歸，得環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)回歸方程y=2254343x+7301，r=1.000；焦谷氨酸回歸方程：y=992116x+186.5，r=0.9999，見表1和圖2；(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸回歸方程為y=50672x-187.89，r=1.000，結(jié)果表明：3種雜質(zhì)的進樣量與其峰面積均呈良好的線性關系。

表1 樣品中焦谷氨酸線性結(jié)果

圖2 焦谷氨酸線性圖

2.3.3 定量限與檢測限考察

分別稱取3種雜質(zhì)對照品適量，當環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)進樣量為0.318ng時，其峰高約為噪音的11倍，其定量限為0.29ng；環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)進樣量為0.095ng時，其峰高約為噪音的3倍，其檢測限為0.095ng。焦谷氨酸進樣量為0.281ng時，其峰高約為噪音的10倍，其定量限為0.28ng；焦谷氨酸進樣量為0.084ng時，其峰高約為噪音的5倍，其檢測限為0.05ng。(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸進樣量為0.833ng時，其峰高約為噪音的9.8倍，其定量限為0.85ng；(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸進樣量為0.25ng時，其峰高約為噪音的3倍，其檢測限為0.25ng。

2.3.4 精密度試驗

按照“2.2.2”中供試品溶液制備方法，平行制備六份樣品，記錄峰面積，測得六份樣品中環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)含量的RSD(n=6)為0.36%，焦谷氨酸含量的RSD為0.61%(n=6)，(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸含量的RSD(n=6)為0.14%。由不同的分析人員在不同時間、不同的儀器進行測定，平行制備六份樣品，計算兩人所得12份樣品中3種雜質(zhì)含量的RSD(n=12)均小于1%，表明本方法精密性良好。

2.3.5 加樣回收率考察

精密稱取3種雜質(zhì)適量，加水制成每1mL含環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)1.07mg，焦谷氨酸0.73mg和(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸0.3mg的混合對照品溶液，精密量取樣品1mL加對照溶液0.5mL加至離子交換柱內(nèi)(內(nèi)徑1.5cm，高7cm)，用水洗脫，收集洗脫液于100mL量瓶中，定容至刻度，搖勻即得。平行配制3份，作為70%回收率供試品溶液。精密量取樣品1mL加對照溶液0.75mL。同上述方法，制得100%回收率供試品溶液，精密量取樣品1mL加對照溶液1mL，制得100%加樣回收樣品溶液，每個濃度平行制備3份，計算回收率。試驗結(jié)果表明：環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)、焦谷氨酸和(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸的回收率均在98%～102%范圍中，且回收率RSD%均小于1.5%，結(jié)果表明本法的準確度可靠。

3.2 離子交換柱對雜質(zhì)檢測的影響

取3種雜質(zhì)對照品適量，加水溶解，得混合對照品儲備液。精密量取混合對照品儲備液適量，未過離子交換柱，分別制成50%，100%，150%的混合對照品溶液；同法取混合對照品儲備液適量，加至離子交換柱內(nèi)(內(nèi)徑1.5cm，高7cm，填料Dowex 50W×8經(jīng)20mL水淋洗并懸浮于水中)，加水淋洗，收集流出液，分別制成50%，100%，150%的混合對照品溶液。

分別精密量取上述溶液各50μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，通過過柱前后相關物質(zhì)的峰面積比值表現(xiàn)離子交換柱對雜質(zhì)的吸附能力(見表2)。結(jié)果顯示，過離子交換柱前后，3種雜質(zhì)的峰面積均無顯著性變化，表明離子交換柱對雜質(zhì)無吸附性，本方法可準確檢測本品中所含雜質(zhì)。

表2 離子交換柱對雜質(zhì)檢測的影響

3.3 洗脫曲線

精密量取混合對照2mL，加至離子交換柱內(nèi)，每5mL洗脫液接入一個試管中，分別取50μL進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)(1)的平均過柱收率為98.51%，焦谷氨酸(2)的平均過柱收率為98.98%。通過測定洗脫液中各相關組分的峰面積，繪制洗脫曲線，從洗脫曲線可知，當供試品洗脫20次(約100mL)時，焦谷氨酸氨酸和環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)幾乎全部被洗脫下來，見圖3，證明使用離子交換樹脂進行吸附的方法可行。

圖3 洗脫曲線圖

3 結(jié)論

基于離子交換樹脂可吸附多種氨基酸的原理來研究氨基酸類藥物中特定相關物質(zhì)的方法，此方法可有效去除多種氨基酸以降低對目標雜質(zhì)的檢測干擾。但尚無3種雜質(zhì)的目標物質(zhì)的檢測方法和過柱后是否有殘留的相關數(shù)據(jù)，本研究基于此，建立了相關驗證方法，可直觀確定目標物質(zhì)經(jīng)離子交換樹脂后是否可以洗脫完全，與藥物中其他氨基酸類成分分離完全。

研究結(jié)果表明本方法專屬性強，重現(xiàn)性好，準確度高，靈敏度高，可用于復方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中有關物質(zhì)的測定，能有效地反應藥品質(zhì)量，適用于該藥物的質(zhì)量控制。