吳玲芳 ，梁文儀 ，張?zhí)m珍 ＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102；2. 河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 石家莊 050091；3. 河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心 石家莊 050091；4. 河北省中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心 石家莊 050091）

余甘子為大戟科Euphorbiaceae葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblicaL．的干燥成熟果實(shí)。余甘子初食味酸澀，良久乃甘，故名“余甘子”，又稱油甘子、牛甘子、喉甘子、魚木果等[1]。余甘子味甘、酸、澀、涼，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱涼血，消食健胃，生津止咳的功效。余甘子在全球分布較為廣泛，主要分布于菲律賓、馬來西亞、南美、印度、斯里蘭卡、印度尼西亞、中南半島和中國。在我國主產(chǎn)于江西、福建、臺(tái)灣、廣東、海南、廣西、四川、貴州和云南等省區(qū)。余甘子為藏族習(xí)用藥材，與訶子、毛訶子統(tǒng)稱三果。大三果為藏醫(yī)經(jīng)典小復(fù)方，應(yīng)用極為廣泛。在傳統(tǒng)藏藥中，余甘子主治培根病、赤巴病、血病、高血壓病等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，余甘子具有抗炎[2-4]，抗氧化[5-15]，抗衰老[5-15]，保肝[16-17]，抗腫瘤[17-34]等藥理作用。余甘子富含鞣質(zhì)類、酚酸類、黃酮類、生物堿類和維生素C 等成分[1-34]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)余甘子中鞣質(zhì)和酚酸類成分具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。

中國藥典中余甘子質(zhì)量控制方法主要有分光光度法測(cè)定余甘子總鞣質(zhì)的含量，高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定余甘子藥材中沒食子酸的含量。國內(nèi)外有不少學(xué)者研究并報(bào)道了余甘子中少量幾種化學(xué)成分含量測(cè)定的方法[35-53]。例如張文莉等[35]采用UPLC法測(cè)定了余甘子中沒食子酸、柯里拉京、訶子鞣質(zhì)和鞣花酸4個(gè)成分的含量。李琦等[36]采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定余甘子中沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸5個(gè)成分的含量。李斌等[41]報(bào)道了余甘子中沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸3種成分含量測(cè)定的方法。另有多篇文獻(xiàn)報(bào)道余甘子及其制劑中單一成分沒食子酸含量測(cè)定的方法，但是同時(shí)測(cè)定余甘子中多種鞣質(zhì)和酚酸類成分含量的方法未見報(bào)道。本課題組多年來致力于藏藥的研究，先后研究了藏藥余甘子、訶子、毛訶子三種單味藥，以及這三味藥所組成的藏醫(yī)經(jīng)典小復(fù)方三果湯。對(duì)其主要化學(xué)成分、藥理作用及作用機(jī)制、體內(nèi)外代謝等內(nèi)容進(jìn)行了系列探索。發(fā)現(xiàn)藏藥多富含鞣質(zhì)，并且以可水解鞣質(zhì)居多，且藏藥中的可水解鞣質(zhì)及小分子酚酸類成分有良好的抗腫瘤作用，體內(nèi)外抗腫瘤效果均較好，有望開發(fā)為一種抗腫瘤新藥。

本課題組前期研究并報(bào)道了余甘子鞣質(zhì)部位的提取純化工藝、體內(nèi)外抗腫瘤活性、總鞣質(zhì)含量測(cè)定方法、沒食子酸、鞣花酸、柯里拉京三個(gè)單體成分的含量測(cè)定方法及指紋圖譜評(píng)價(jià)研究[22-23,52-58]，對(duì)余甘子進(jìn)行了化學(xué)成分、藥理作用、藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布、排泄、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等一系列研究。本研究建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定余甘子藥材中主要成分沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、老鸛草素、柯里拉京、訶子林鞣酸、訶黎勒酸和鞣花酸含量的方法，填補(bǔ)了余甘子藥材多種化學(xué)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定的空白，可為余甘子藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為藏醫(yī)藥現(xiàn)代化和藏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Waters 1525 型高效液相色譜儀；Waters 2996 型DAD檢測(cè)器；Empower軟件；自動(dòng)進(jìn)樣器；微孔濾膜（津騰）；注射器（國藥集團(tuán)）；離心管（北京匯?？苾x有限責(zé)任公司）；十萬分之一電子分析天平：Sartorious BT 25S型（北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（功率：100 W，型號(hào)：KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）；稱量紙（洛陽北方玻璃技術(shù)股份有限公司）；棕色進(jìn)樣瓶（Thermo Scientific，北京匯?？苾x科技有限公司）。

1.2 材料

余甘子藥材購自北京藏醫(yī)院（產(chǎn)地為尼泊爾）、經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系劉春生教授鑒定為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥果實(shí)。沒食子酸（CAS No：149-91-7），安石榴苷（CAS No：65995-63-3），沒食子酸甲酯（CAS No：99-24-1），均購自成都曼斯特生物科技有限公司，貯藏條件：4 ℃，密封，避光保存。老鸛草素：（CAS No：2360976-49-0）；柯里拉京（CAS No：23094-69-1），訶子林鞣酸（CAS No：18942-26-2），訶黎勒酸（CAS No：23049-71-5），鞣花酸（CAS No：476-66-4）均購自上海源葉生物科技有限公司，貯藏條件：4℃，密封，避光保存，純度為98%，符合含量測(cè)定的要求。

1.3 試劑

甲醇（Fisher, 色譜純）；蒸餾水（屈臣氏）；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 高效液相色譜條件

Diamonsil C18 色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相為A（甲醇）：（B）0.2% 醋酸水；流速為1 mL?min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。樣品及對(duì)照品色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 混合對(duì)照品色譜圖

圖2 余甘子藥材色譜圖

2.2 供試液的制備

余甘子藥材供試液制備：稱取余甘子藥材粉末（過 50 目篩）約200 mg，精密稱定，轉(zhuǎn)移至 100 mL 錐形瓶中，加入50% 甲醇水溶液50 mL，稱重，100 MHz超聲30 min，補(bǔ)足失量，濾過，取續(xù)濾液 2.00 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加50% 甲醇水溶液稀釋至刻度線，搖勻，備用，進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過。

2.3 線性關(guān)系考察

分別稱取沒食子酸對(duì)照品2.34 mg，安石榴苷對(duì)照品8.23 mg，其中安石榴苷A 含量為35.221%，其中安石榴苷B 含量為63.619%，沒食子酸甲酯對(duì)照品2.33 mg，老鸛草素對(duì)照品8.00 mg，柯里拉京對(duì)照品13.75 mg，訶子林鞣酸對(duì)照品2.74 mg，訶黎勒酸對(duì)照品2.10 mg，鞣花酸對(duì)照品4.50 mg，精密稱定，置于25 mL棕色量瓶，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液25、50、100、200、400、600、800 μL 于 1 mL 容量瓶，加50%的甲醇稀釋至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過。按照上述色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄色譜峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)X（μg），以峰面積為縱坐標(biāo)，得到回歸方程，見表1和2。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

分別取同一混合對(duì)照品，連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別測(cè)定沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、老鸛草素、柯里拉京、訶子林鞣酸、訶黎勒酸、鞣花酸的峰面積。計(jì)算色譜峰峰面積 RSD 分別為1.03、0.55、1.55、2.10、0.26、1.56、0.20、0.097%, 表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱取同一批余甘子藥材粉末，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試液，分別于樣品制備后0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、柯里拉京、訶黎勒酸、訶子林鞣酸、鞣花酸的峰面積。計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的峰面積RSD 分別為0.12、2.90、1.18、0.96、1.36、1.01、1.51、1.18%，表明樣品在24 h之內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取6 份余甘子藥材樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試液，平行制備6 份，分別測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、柯里拉京、訶黎勒酸、訶子林鞣酸、鞣花酸的含量分別為：2.50、0.22、0.18、056、0.68、0.26、0.90、2.10%，RSD 值分別為：3.52、1.94、1.24、0.95、0.66、2.03、1.23、0.76%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

表 1 流動(dòng)相梯度

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn)

混合對(duì)照品溶液配置：精密稱取安石榴苷3.46 mg（安石榴苷B 含量為63.62%，2.20 mg）、老鸛草素5.60 mg、柯里拉京6.80 mg、訶子林鞣酸2.60 mg、訶黎勒酸 9.00 mg，得安石榴苷 B 0.22 mg?mL-1、老鸛草素0.56 mg?mL-1，柯里拉京濃度為 0.68 mg?mL-1、訶子林鞣酸0.26 mg?mL-1、訶黎勒酸0.90 mg?mL-1的混合對(duì)照品溶液1，備用。精密稱取沒食子酸對(duì)照品5.00 mg、鞣花酸對(duì)照品4.02 mg，沒食子酸甲酯3.60 mg，置于1 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度線，得到混合對(duì)照品溶液2，備用。

稱取余甘子藥材粉末（過50 目篩）6 份，每份約100 mg，分別向每一份樣品中分別精密加入“混合對(duì)照品溶液 1”1 mL 和“混合對(duì)照品溶液 2”0.5 mL，加50%甲醇48.50 mL，稱重，超聲，100 MHz 超聲30 min，補(bǔ)足原重量，濾過，取續(xù)濾液2.00 mL，置于10 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，精密吸取20 μL 進(jìn)樣，計(jì)算沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、老鸛草素、柯里拉京、訶子林鞣酸、訶黎勒酸、鞣花酸色譜峰的平均加樣回收率依次分別為 ：100.15%，102.04%，101.20%，99.94%，99.75%，100.69%，100.30%，100.30%。RSD 依次分別為0.63%，3.76%，3.37%，1.08%，1.53%，1.22%，0.98%，1.98%（n=6）。

2.8 HPLC法測(cè)定余甘子藥材中8種成分的含量

稱取產(chǎn)地為尼泊爾、廣西、新疆、福建、四川、印度、云南、貴州產(chǎn)余甘子藥材粉末（過50 目篩）200 mg，每個(gè)產(chǎn)地取6 份，精密稱定，轉(zhuǎn)移至100 mL 錐形瓶中，加入50%甲醇水溶液50 mL，稱重，100 MHz 超聲30 min，補(bǔ)足失量，濾過，取續(xù)濾液2.00 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇水溶液稀釋至刻度線，搖勻，備用，制備6 份余甘子藥材供試品溶液，進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過。按照“液相色譜條件”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定計(jì)算平均值及RSD 值，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地余甘子藥材中8個(gè)成分的含量

3 總結(jié)和討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本論文采用梯度洗脫法分離了余甘子藥材中主要成分，62 min 內(nèi)分離完全，各成分分離效果良好，符合含量測(cè)定的要求。實(shí)驗(yàn)前期通過二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行了全波長(zhǎng)（190-400 nm）掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個(gè)成分在270 nm 處有最大吸收，且雜質(zhì)成分干擾較小，故選擇270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本文考察了乙腈和甲醇兩種有機(jī)相，純水、不同濃度的醋酸水、不同濃度磷酸水作為水相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈為有機(jī)相時(shí)，各成分都包裹在一起，分離效果不好，于是選擇甲醇作為有機(jī)相。同時(shí)所測(cè)成分均為弱酸性成分，添加少量的醋酸可以使峰形良好，減少色譜峰拖尾現(xiàn)象，故最終選擇甲醇-0.2%的醋酸水作為流動(dòng)相。

3.3 柱溫的選擇

本文考察了25℃，30℃，35℃柱溫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30℃時(shí)，各成分分離效果較好，于是選擇30℃為柱溫。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果的分析

從6 份樣品中各成分含量可以看出，酚酸類成分沒食子酸、鞣花酸含量相對(duì)較高，鞣質(zhì)類成分含量相對(duì)較低，其原因可能有兩種，其一，沒食子酸和鞣花酸在藥材中本身含量相對(duì)較高。其二，沒食子酸和鞣花酸是其他可水解鞣質(zhì)類成分的基本結(jié)構(gòu)單元，可水解鞣質(zhì)類成分不穩(wěn)定，在酸、堿、酶以及受熱的條件下容易水解，生成沒食子酸，鞣花酸等小的結(jié)構(gòu)單元。需要說明的是由于安石榴苷A 在藥材中信號(hào)太低，采用普通液相和紫外檢測(cè)器不能對(duì)其定量，故只定了其余8個(gè)成分的量，但是后期采用UPLC-MSn法對(duì)藥材化學(xué)成分進(jìn)行定性分析時(shí)，檢測(cè)到了安石榴苷A，說明其在余甘子藥材中確實(shí)存在，只是含量較低。另分離富集的余甘子抗癌有效部位中安石榴苷A 含量顯著提高，可以定量，這些將在后續(xù)論文中進(jìn)行報(bào)道。各份樣品中每種成分含量RSD 值較小，說明樣品制備方法比較可靠，平行操作，各成分差異較小。本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可為余甘子的質(zhì)量控制提供依據(jù)。