張玉秀，劉 楊，劉培衛(wèi)，留詩雨，黃 嫻，魏建和，＊＊

（1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點實驗室 海口570311；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室&瀕危藥材繁育國家工程實驗室 北京 100193；3. 海南碧凱藥物研究所有限公司 ?？?570216）

溫郁金(Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling)，又稱溫莪術(shù)，屬姜科（Zingiberaceae）姜黃屬（Curcuma）多年生草本植物[1]，是“片姜黃”、“溫莪術(shù)”和“溫郁金”等多種中藥材的基原植物，同時也是莪術(shù)油的主要來源[2]?，F(xiàn)代研究[3-5]證明溫莪術(shù)含有姜黃素類、莪術(shù)醇、β-欖香烯、莪術(shù)二酮等多種活性成分，具有很好的抑菌、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。溫莪術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)在浙江溫州，但僅靠道地產(chǎn)區(qū)小面積種植已不能滿足日益增長的市場需求，現(xiàn)已大量異地引種栽培[6-8]。實踐證明，很多藥用植物從原產(chǎn)地引種到新地區(qū)后，經(jīng)常出現(xiàn)性狀變異，基原不清和種質(zhì)退化等問題[9-10]。因此我們在基原鑒定的基礎(chǔ)上，對不同產(chǎn)地的溫莪術(shù)遺傳多樣性進(jìn)行了研究。

簡單序列重復(fù)區(qū)間（Inter-simple sequence repeat，ISSR）擴(kuò)增多態(tài)性是一種在簡單重復(fù)序列基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記，由加拿大科學(xué)家Zietkiewicz 等在1994 年首次提出[11]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、進(jìn)化與親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性與居群遺傳結(jié)構(gòu)檢測等方面[12-13]。如 Raina 等[14]利用 ISSR 技術(shù)對花生栽培種和野生種的親緣進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Arachis monticola和A. hypogaea親緣關(guān)系密切，同時表明A.villosa和A. ipaensis（二倍體，野生種)是A. monticola和A.hypogaea（四倍體，栽培種）的祖先。陳河龍等基于ISSR對蘆筍種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，將46份蘆筍種質(zhì)分為 Pacific Challenger 2、A 和 B 共 3 大類；而 A 類又分為3 個亞類，B 類分為4 個亞類[15]。關(guān)萍等基于ISSR技術(shù)對貴州5個不同產(chǎn)地粗毛淫羊藿進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)粗毛淫羊藿的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，并且居群間的親緣關(guān)系與地理分布關(guān)系密切，但人為引種會影響這種相關(guān)性[16]。

ISSR 技術(shù)在溫莪術(shù)遺傳多樣性方面已有不少的研究報道[17-19]，但得到了不同的結(jié)論。王佐元等應(yīng)用ISSR 標(biāo)記技術(shù)對瑞安、樂清和平陽三個地區(qū)5 個居群的溫莪術(shù)遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地溫莪術(shù)之間有較高的遺傳多樣性，且居群內(nèi)發(fā)生了較高的遺傳分化，基因交流也比較多[17]。陶正明等[18]運(yùn)用該技術(shù)對浙江溫莪術(shù)主產(chǎn)區(qū)6個居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)溫莪術(shù)居群間的多態(tài)性不豐富，遺傳多樣性水平較低。王曉慧等[19]利用ISSR-PCR 標(biāo)記技術(shù)研究了不同種及居群莪術(shù)的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，數(shù)據(jù)表明溫郁金不同居群間遺傳相似系數(shù)在97%以上，居群內(nèi)分化程度很低。本研究利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對道地產(chǎn)區(qū)（溫州）、其他種植區(qū)（海南、貴州）3個產(chǎn)地共8 個溫莪術(shù)居群進(jìn)行了研究，旨在從分子水平了解不同產(chǎn)地溫莪術(shù)的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，期望為藥用植物異地栽培及優(yōu)良種質(zhì)選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

樣品采自浙江溫州溫莪術(shù)主產(chǎn)地、海南溫莪術(shù)種植基地和貴州麻江種植地。海南和貴州麻江最初種植的種莖都來自浙江溫州，在當(dāng)?shù)剡B續(xù)種植4年以上。目前海南種植基地的種莖少量來自浙江溫州，絕大部分為自留種，為了減少誤差，課題組在海南種植基地多地、多點采樣。采樣后立即用硅膠干燥留存?zhèn)溆?。所有樣品由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所朱平老師鑒定為溫莪術(shù)（C.wenyujinY.H.Chen et C.Ling），樣品信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地溫莪術(shù)的來源及編號

1.2 方法

1.2.1 儀器

凝膠水平電泳儀（君意JY600c，中國）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad ChemiDoc，美國）、微波爐（美的，中國）、高速離心機(jī)（Hettich 220R，德國）、核酸蛋白質(zhì)儀（Thermo Nanodrop 2000，美國）、梯度PCR 儀（Biometra TProfessional，德國）

1.2.2 試劑

植物總DNA 提取試劑盒（OMEGA HP Plant DNA Kit，中國）、2×Taq PCR MasterMix（Transgen As151，中國）、液氮（海南青峰生物科技有限公司）、核酸染色劑（Solarbio Gold view I 型，中國）、超純水（Thermo，美國）、Agarose（Biowest Agarose G-10，西班牙）、β-巰基乙醇（上海艾研生物科技有限公司）、冰醋酸（西隴科學(xué)股份有限公司）、無水乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司）、TBE 電泳緩沖液（Biosharp，中國）、D2000 Marker（Tiangen，中國）。

1.2.3 DNA提取

參照OMEGA 公司的植物總DNA 試劑盒的操作方法（適用于新鮮/冷凍樣品提取），提取每個樣品葉片的總DNA。為了避免樣品間的交叉污染，每個樣品需單獨處理，提取后用核酸蛋白質(zhì)儀檢測DNA濃度和純度，濃度值要求在 20 ng?μL-1以上，OD260 和 280 的比值在1.8-2.0范圍內(nèi)。

1.2.4 ISSR引物篩選

采用加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia，UBC）設(shè)計的引物為篩選對象，引物由華大基因（深圳）股份有限公司合成，通過已確定的反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序從20條引物中篩選出多態(tài)性好、擴(kuò)增譜帶清晰的6條引物（表2）。

1.2.5 引物最佳退火溫度確定

反應(yīng)體系 25 μL，包括 DNA 模板 1 μL，2×EcoTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物1 μL，ddH2O 10.5 μL。采用PCR 儀進(jìn)行退火溫度梯度試驗，逐一確定所篩選引物的最佳退火溫度。設(shè)定退火溫度梯度范圍50-62℃，自動形成8 個梯度。PCR 擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，50-62 ℃復(fù)性 30 s，72℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)；72℃延伸 10 min；反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測拍照，根據(jù)多態(tài)性條帶多少及清晰度確定每條引物的最佳退火溫度（圖1、表2）。

圖1 最佳退火溫度篩選（UBC-859）

表2 ISSR分析的引物

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

ISSR-PCR 條帶分析和數(shù)據(jù)處理以D2000 Marker作為相對分子質(zhì)量標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)PCR 擴(kuò)增條帶在瓊脂糖凝膠上的遷移程度，確定各居群ISSR-PCR 條帶的位置。同一條引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，依據(jù)電泳圖譜中同一位置上DNA條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計與聚類分析，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，用 Excel 軟件建立0/1格式的原始表征二元數(shù)據(jù)矩陣。利用PopGene 32 軟件計算多態(tài)位點百分率（PPB）、等位遺傳標(biāo)記數(shù)（Na）、有效等位遺傳標(biāo)記數(shù)（Ne）、總的遺傳多樣性（Ht）、居群內(nèi)遺傳多樣性（Hs）、各居群間的遺傳分化指數(shù)（Gst）、基因流（Nm）、Nei’s 遺傳多樣性（He）、Nei’s 遺傳距離（D）、Shannon’s 信息指數(shù)（I）等；通過NTsys 2.1中的非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)建立聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物篩選和最佳退火溫度確定

每個物種都有各自的適宜的ISSR 引物，根據(jù)文獻(xiàn)從UBC 設(shè)計的100 條ISSR 引物中首先選擇20 條引物，發(fā)現(xiàn)其中的6條引物擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶性較好（表2）。圖2 為引物UBC-859 擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后獲得的凝膠圖，從圖中可以看出此引物的ISSR條帶的多態(tài)性較好，不同樣品間差異明顯（圖2）。

ISSR-PCR 試驗中，退火溫度對條帶的有無和清晰度有顯著的影響，例如UBC-859的最佳退火溫度為53.8℃，高于這個溫度條帶數(shù)減少，低于這個溫度清晰度下降（圖1）。對上述篩選到的6 條引物的退火溫度進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，篩選到了各自的最佳退火溫度（表2）。

2.2 遺傳多樣性分析和居群間遺傳變異分析

2.2.1 遺傳多樣性分析

圖2 引物UBC-859對溫莪術(shù)樣品的擴(kuò)增結(jié)果

6 條引物共擴(kuò)增出42 條清晰、可重復(fù)的DNA 條帶。通過對8 個居群的溫莪術(shù)進(jìn)行ISSR 遺傳多樣性分析表明（表 3），瑞安1、瑞安2、臨高1、臨高2、澄邁1、澄邁2、紅旗、貴州多態(tài)位點百分率（PPB）在19.05%-47.62%之間，其中紅旗最高（47.62%），臨高2 最低（19.05%），平均值為29.17%。居群內(nèi)Nei’s 基因多樣性（He）在 0.0640-0.1440 之間 ，平均值為 0.1005；Shannon’s 指數(shù)（I）在 0.0998-0.2220 之間，平均值為0.1511?？梢钥闯鰷剌g(shù)居群內(nèi)ISSR 多態(tài)性不豐富，遺傳多樣性水平偏低。

2.2.2 居群間遺傳變異分析

通過對溫莪術(shù)居群間和居群內(nèi)的遺傳分化及基因流分析，結(jié)果顯示，8個溫莪術(shù)居群總的遺傳多樣性（Ht）為 0.1709，居群內(nèi)的遺傳多樣性（Hs）為 0.1045，說明溫莪術(shù)居群內(nèi)和居群間都存在一定的遺傳分化。根據(jù)Ht 和Hs 計算不同溫莪術(shù)居群間的遺傳分化系數(shù)Gst 為0.3886，即總的遺傳變異中有38.86%的變異存在于居群間，61.14%的變異存在于居群內(nèi)，表明居群內(nèi)遺傳分化大于居群間遺傳分化。居群間每代個體的基因流系數(shù)（Nm）為0.7868，表明居群間基因流動性水平偏低。

2.2.3 不同產(chǎn)地溫莪術(shù)的聚類分析

運(yùn)用PopGene 32 軟件計算出溫莪術(shù)各居群間遺傳一致性和遺傳距離，然后基于遺傳一致性運(yùn)用NTsys 2.1 軟件進(jìn)行UPGMA 聚類（圖3）。從結(jié)果中可以看出溫莪術(shù)各居群間的遺傳一致性的范圍為0.8481-0.9736，平均值為 0.9155，遺傳距離（D）范圍為0.0268-0.1647，平均值為0.0901，這些數(shù)據(jù)表明溫莪術(shù)不同居群間在分子水平上差異較小。具體到居群間可以看出，臨高1和臨高2溫莪術(shù)的遺傳一致性最高（0.9736），遺傳距離最?。?.0268）（表4），在聚類圖上最先聚為一支（圖3）；貴州麻江與臨高1溫莪術(shù)的遺傳一致性最低（0.8481），遺傳距離最大（0.1647）（表4），在聚類圖上最后才與其他居群聚在一起（圖3）。

表3 居群內(nèi)的遺傳多樣性

圖3 不同產(chǎn)地溫莪術(shù)群體間的UPGMA聚類圖

表4 Nei’s遺傳一致性（右上角）和遺傳距離（左下角）

3 討論

遺傳信息在外界或內(nèi)在的因素作用下，在復(fù)制過程中出現(xiàn)偏差導(dǎo)致了不同程度的遺傳變異，形成了物種間和物種內(nèi)豐富的遺傳多樣性[17]。物種或居群的遺傳多樣性是長期進(jìn)化的產(chǎn)物，是其生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提，一個居群或物種遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新的環(huán)境，即使無性繁殖占優(yōu)勢的種也不例外，遺傳多樣性是保護(hù)生物學(xué)研究的核心之一。因此，對遺傳多樣性的研究無疑有助于人們更清楚地認(rèn)識生物多樣性的起源和進(jìn)化，進(jìn)而為育種和遺傳改良奠定基礎(chǔ)[17]。

陶正明等[18]利用ISSR技術(shù)對溫州傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的6個溫莪術(shù)居群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其ISSR 多態(tài)位點百分率（PPB）為31.7%，遺傳一致性范圍為0.9129-0.9943，遺傳距離范圍為0.0057-0.0911，這些數(shù)據(jù)均表明這些道地產(chǎn)區(qū)的溫莪術(shù)之間遺傳變異小、較為穩(wěn)定。王曉慧等利用該技術(shù)對廣西、福建和浙江等5 個溫莪術(shù)居群研究發(fā)現(xiàn)，其PPB 范圍為3.08%-12.31%，遺傳一致性范圍為0.97-0.9991, 遺傳距離為0.009-0.030，這些數(shù)據(jù)表明這3 個產(chǎn)地溫莪術(shù)遺傳多樣性較小[19]。本文中8 個溫莪術(shù)居群的PPB 范圍為19.05%-47.62%，遺傳一致性范圍為0.8481-0.9736，遺傳距離為0.0268-0.1647。綜合以上的研究可以看出，不同溫莪術(shù)居群間遺傳多樣性普遍較低，居群間在分子水平上差異較小。但有的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，溫莪術(shù)有著較高的遺傳多樣性水平，且居群內(nèi)發(fā)生了較高的遺傳分化，這可能由于所選用的引物、樣本來源和樣本數(shù)量及分析方法等因素造成的。在今后的研究中,應(yīng)擴(kuò)大樣品收集的區(qū)域和樣本數(shù)量，同時結(jié)合其他技術(shù)手段，分析溫莪術(shù)遺傳多樣性，為尋找出優(yōu)良的種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

溫莪術(shù)原產(chǎn)浙江溫州，但隨著社會的發(fā)展，異地引種栽培越來越多[6-9]。據(jù)調(diào)查，海南和貴州種植的溫莪術(shù)的種莖最初都來自道地產(chǎn)地浙江溫州，其中海南溫莪術(shù)大規(guī)模種植已有5 年時間，目前絕大部分為自留種，貴州種植的溫莪術(shù)的種植至少有4年的時間，每年都是利用自留種莖無性繁殖。本文的數(shù)據(jù)表明，溫莪術(shù)從溫州引種到海南和貴州以后，其遺傳信息確實發(fā)生了一些改變，但整體上變異不大。究竟是自留種莖進(jìn)行繁殖好，還是每年從原產(chǎn)地購買種莖進(jìn)行繁殖好，還需要多年的對比研究。

中藥材是治病救人的特殊商品，必須保證其安全性、有效性、穩(wěn)定性及一致性。因此對異地引種栽培與道地產(chǎn)區(qū)的中藥材進(jìn)行科學(xué)的比較評價十分必要。早先課題組從形態(tài)學(xué)及化學(xué)水平證明了海南產(chǎn)溫莪術(shù)與道地產(chǎn)區(qū)溫莪術(shù)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)構(gòu)成基本一致[7,20]。本文通過對溫莪術(shù)5 個居群遺傳多樣性的分析，從分子水平證明了海南溫莪術(shù)和道地產(chǎn)區(qū)溫莪術(shù)的差異很小。隨著溫莪術(shù)引種栽培規(guī)模的增大和種植年限的增加，下一步我們將從遺傳信息、有效成分和療效等方面進(jìn)行比較研究，為海南產(chǎn)溫莪術(shù)的合理開發(fā)和利用提供保障，為其他中藥材的引種栽培提供參考。