朱俊訪，李 博，聶 陽

（廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實驗實訓(xùn)中心 廣州 510520）

淡竹葉為禾本科植物淡竹葉（Lophatherum gracileBrongn）的干燥莖葉[1]，具有解熱、利尿、抗菌和抗腫瘤等藥理作用[2]。淡竹葉在我國大部分地區(qū)均有分布，具有良好的藥理活性且資源十分豐富。淡竹葉藥材含有豐富的碳苷黃酮[3]，包括牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷、日當(dāng)藥黃素和當(dāng)藥黃素等，其中以異葒草苷含量較高[4]。現(xiàn)有報道[5-6]表明，淡竹葉總黃酮具有清除自由基、抗氧化和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等藥理作用，其中葒草苷具有抗缺氧、保護心肌、抗血栓等作用，牡荊素具有抗心肌缺血等作用[7]，異葒草苷具有較強的抗氧化作用[8]。淡竹葉生長周期短，更生能力旺，資源豐富，除藥用外，尚可用于食品、保健品等方面，值得充分開發(fā)利用，因此，淡竹葉是一種具有廣闊開發(fā)應(yīng)用前景的天然藥物。

傳統(tǒng)的中藥活性成分提取、純化方法主要是先采用有機溶劑提取，如竹葉黃酮常用的提取方法有回流提取、超聲提取等，然后通過層析、大孔吸附樹脂、重結(jié)晶、制備色譜等進一步分離、純化，存在步驟多而繁瑣、溶劑消耗大、成本高、污染環(huán)境等方面的問題[9-11]。因此針對傳統(tǒng)分離方法的缺點，有需要開發(fā)一種有效、簡便、選擇性高的分離新技術(shù)來解決這種高成本、低收率的問題，分子印跡技術(shù)恰好滿足這一要求。分子印跡技術(shù)具有制備簡單、成本廉價、能重復(fù)使用等優(yōu)點，尤其是特異的分子識別性能、高效率的富集與分離能力能夠使結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)很容易得到分離，使中藥成分純化工藝得以簡化，節(jié)省了溶劑的用量，減少了環(huán)境污染，因此，分子印跡聚合物在中藥活性成分的分離純化應(yīng)用中具有極大的發(fā)展空間[12-15]。

本研究利用分子印跡技術(shù)，以異葒草苷為模板分子，制備異葒草苷的分子印跡聚合物（MIPs），采用電鏡掃描對MIPs 的結(jié)構(gòu)進行了表征，對其吸附性能進行了評價，并研究了該聚合物對淡竹葉中黃酮類成分異葒草苷的吸附分離效果。分子印跡技術(shù)具有強特異性及選擇性，在中藥有效成分研究中具有良好的應(yīng)用前景[16]，通過本研究以期為分子印跡聚合物在中藥有效成分分離上的應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本研究所用的材料與儀器包括：LC-2010A 高效液相色譜儀（日本島津儀器公司）；UV2600 紫外分光光度計（尤尼科儀器有限公司）；JSM7800掃描電鏡（日本電子株式會社）；AUY120 電子天平（日本島津儀器公司）；HH-4 恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；SB5200DTN 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；異葒草苷對照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.26%，批號18020610），成都曼思特生物科技有限公司；淡竹葉（批號20160401，廣州市華宇藥業(yè)有限公司），經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院康大力副教授鑒定為淡竹葉；2-乙烯基吡啶（2-VP）、丙烯酰胺（AM）、偶氮二異丁氰（AIBN），科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），喬科化學(xué)有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 功能單體選擇及用量篩選

本研究采用紫外分光光度法考察異葒草苷與AM和2-VP 兩種功能單體在甲醇中的相互作用，通過紫外光譜的變化，對功能單體進行篩選。在0.1 mmol·L-1異葒草苷溶液中分別加入不同濃度的AM 和2-VP，使異葒草苷與功能單體的比例分別為1∶2、1∶4、1∶6，充分振蕩后放置12 h，分別以相同濃度的功能單體做參比，測定紫外光譜，分析紫外光譜變化，分析確定最佳功能單體的種類及配比。

為了確定模板分子與功能單體的最佳比例，固定制備工藝中除功能單體外的其他條件，通過改變功能單體的用量，分別制備印跡聚合物，根據(jù)所得聚合物的性狀及平衡吸附量（Q）來判斷功能單體最佳用量。

1.3 印跡聚合物的制備[17]

稱取1.5 mmol 異葒草苷溶解于25 mL 甲醇/氯仿（2∶3）中，超聲振蕩10 min，再加入一定量的功能單體2-VP，超聲振蕩10 min靜置30 min，加入30 mmol交聯(lián)劑EDMA，加入50 mg 引發(fā)劑AIBN，充分混勻超聲振蕩10 min，通氮氣15 min，密封，置于65℃水浴中聚合24 h，得果凍塊狀聚合物。將聚合物取出晾干后研磨，粉末過120目篩后放入索氏提取器中，用甲醇-冰醋酸（9∶1，V/V）回流提取，直至提取液在360 nm下無模板分子吸收，再用甲醇洗去殘留的冰醋酸，粉末晾干后真空干燥24 h 后備用，得異葒草苷的分子印跡聚合物?？瞻子≯E聚合物（NIPs）的制備除了不加模板分子異葒草苷外，其余步驟同MIPs的制備。使用掃描電鏡測定所得異葒草苷MIPs和NIPs的外貌形態(tài)并進行分析。

1.4 印跡聚合物靜態(tài)吸附性能實驗

稱取40 mg 的異葒草苷印跡聚合物10 份，分別放入25 mL具塞錐形瓶中，分別加入用甲醇配制的濃度為0.01 mmol·L-1、0.02 mmol·L-1、0.03 mmol·L-1、0.04 mmol·L-1、0.05 mmol·L-1、0.06 mmol·L-1、0.07 mmol·L-1、0.08 mmol·L-1、0.09 mmol·L-1和 0.10 mmol·L-1的異葒草苷對照品溶液，室溫振蕩24 h，取吸附后的溶液進行離心、過濾，濾液于360 nm 處測定吸光度?？瞻拙酆衔锏撵o態(tài)吸附實驗的處理和操作同上。根據(jù)吸附前后溶液中模板分子異葒草苷的濃度變化計算分子印跡聚合物的吸附量（Q），并繪制等溫吸附曲線，計算公式見公式（1）。

上式中Q為平衡吸附量（μmol/g），C0為溶液中異葒草苷的起始濃度（μmol/L），Ce為平衡時溶液中異葒草苷的濃度（μmol/L），V為溶液體積（mL），W為印跡聚合物的質(zhì)量（g）。

1.5 動態(tài)吸附實驗

取二支玻璃色譜柱分別加入2.5 g干燥的MIPs，得異葒草苷的MIPs 填充柱A 柱和B 柱，另外再取一玻璃色譜柱加入2.5 g NIPs 為C 柱，分別以甲醇平衡色譜柱。分別吸取濃度為0.10 mmol·L-1的異葒草苷對照品溶液0.5 mL 加至平衡后的萃取柱MIPs-A 柱、MIPs-B 柱和NIPs-C柱。MIPs-A柱先用甲醇進行淋洗，收集洗脫液，每份2 mL，再用甲醇-冰醋酸（9∶1）洗脫，收集洗脫液，每份2 mL。MIPs-B 柱直接用甲醇-冰醋酸（9∶1）洗脫，收集洗脫液，每份2 mL。NIPs-C柱用甲醇進行淋洗，收集洗脫液，每份2 mL。在360 nm 處分別測定各洗脫液吸光度，實驗重復(fù)3次，分別繪制MIPs-A柱與MIPs-B柱、MIPs-A柱與NIPs-C柱的洗脫曲線。

1.6 淡竹葉提取液的制備

取淡竹葉100 g，粉碎后過50 目篩，使用80%乙醇浸泡提取24 h，提取3 次，合并提取液并濃縮至無醇味，使用等體積石油醚萃取3次，合并水相并濃縮得浸膏[18]。用甲醇超聲溶解上述浸膏，過濾，定容至25 mL容量瓶中，得供試品溶液（含異葒草苷37.6%）。

1.7 HPLC分析

吸取淡竹葉提取液上樣，用甲醇洗脫，分別收集MIPs 柱和NIPs 柱洗脫液。使用以下色譜條件進行分析，考察MIPs對淡竹葉中異葒草苷的分離效果。

表1 流動相梯度表

色譜條件：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇和0.5%醋酸水溶液，按表1 進行梯度洗脫，進樣量為10 μL，柱溫25℃，體積流量為1.0 mL·min-1，檢測波長為360 nm[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能單體選擇

功能單體在聚合物制備過程中，主要是與模板分子通過共價或非共價作用形成復(fù)合物，模板分子和功能單體在聚合前能否形成穩(wěn)定的復(fù)合物是獲得高選擇性分子印跡聚合物的關(guān)鍵，因此，選擇合適功能單體種類及確定功能單體用量至關(guān)重要。增加功能單體的用量，會使模板分子和功能單體的預(yù)組裝更完全，但用量過大單體自身會發(fā)生締合，影響印跡聚合物中特異性結(jié)合位點的產(chǎn)生。本實驗通過紫外-可見分光光度法來確定最佳功能單體的種類和配比。根據(jù)紫外光譜原理，價電子與氫原子形成氫鍵，電子能量發(fā)生變化，分子軌道發(fā)生扭曲變形，電子躍遷概率發(fā)生變化，這些原因?qū)е挛舛劝l(fā)生變化。因此，通過比較紫外光譜的變化，可推測模板分子與功能單體間相互作用強度和配比等信息。

模板分子異葒草苷結(jié)構(gòu)具有多個酚羥基，具有一定的酸性，羰基氧原子上的未共用電子對有微弱的堿性。理論上，選擇堿性功能單體更有利于模板分子和功能單體形成穩(wěn)定的復(fù)合物，因此以AM 和2-VP 為備選功能單體。使用紫外分光光度法分別對0.1 mmol·L-1異葒草苷、異葒草苷：AM（1∶2、1∶4、1∶6）的和異葒草苷：2-VP（1∶2、1∶4、1∶6）進行光譜掃描，結(jié)果見圖1?？梢钥闯霎惾嚥蒈张c不同比例的2-VP 混合后，在250-290 nm 范圍內(nèi)的吸收曲線發(fā)生了明顯變化，吸光值隨2-VP 濃度增大而減小，說明模板分子與2-VP 之間有較強的作用力。異葒草苷與不同比例的AM 混合后，紫外圖譜沒有發(fā)生明顯變化，說明模板分子與功能單體作用較弱。由此可推斷2-VP 是一種較理想的功能單體，這可能是由于其與模板分子間存在氫鍵及酸堿作用，因此產(chǎn)生了較好的識別位點。

2.2 功能單體用量篩選

固定制備工藝中模板分子用量為1.5 mmol、交聯(lián)劑的用量為30 mmol，將功能單體的用量分別設(shè)為3 mmol、6 mmol、9 mmol 和 12 mmol，分別制備印跡聚合物，記錄所得聚合物的性狀，計算平衡吸附量（Q）。結(jié)果見表2，不同的功能單體用量制備得到1-4 號MIPs，其中1-3 號聚合物為果凍狀固體，而4 號聚合物由于添加的功能單體較多所形成的聚合物結(jié)構(gòu)不夠緊密因此為膠狀。所以綜合1-4 號MIPs 的性狀和Q值可判斷較佳工藝為3 號，即印跡分子異葒草苷的量為 1.5 mmol，功能單體 2-VP 的量為 9 mmol，交聯(lián)劑EDMA的量為30 mmol。

圖1 異葒草苷與不同濃度功能單體的紫外光譜

表2 功能單體用量篩選

2.3 聚合物表面形態(tài)研究

掃描電鏡是一種微觀形貌觀察手段，主要是利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態(tài)。使用掃描電鏡對制備所得異葒草苷MIPs 和NIPs 的表面形態(tài)進行測定，研究聚合物的微觀結(jié)構(gòu)以及表面的形態(tài)差異，對聚合物的聚合情況進行評價。由圖2可以看出，異葒草苷MIPs 和NIPs 的表面形態(tài)具有較大差異，NIPs 的表面較為光滑、均一、質(zhì)地緊密，而異葒草苷MIPs 表面較為粗糙、具有大量的小孔，這可能是由于異葒草苷MIPs 中模板分子被洗脫后留下的“印跡”空穴，正是這些空穴使得該MIPs具有了特殊的吸附性和選擇性，因此這更有利于對模板分子的吸附。

2.4 靜態(tài)吸附實驗

通過靜態(tài)吸附實驗研究異葒草苷在印跡聚合物和非印跡聚合物上的吸附行為，使用吸附量對平衡濃度作圖，得吸附等溫線見圖3。由圖3可見在所研究的濃度范圍內(nèi)，MIPs 對異葒草苷具有一定的吸附能力，吸附量隨著溶液濃度的升高逐漸增大，最大吸附量可達 2.5 μmol?g-1，在相同濃度下 NIPs 對異葒草苷的吸附相對較小。隨濃度的增加，MIPs和NIPs吸附量之差越來越大，推測MIPs對目標(biāo)分子具有選擇性的吸附能力，而NIPs 不存在這種特異性的結(jié)合位點，且對模板分子只有弱的非選擇性吸附，因此，NIPs 對目標(biāo)分子吸附能力較差。

圖2 分子印跡聚合物的SEM圖片

圖3 印跡聚合物的等溫結(jié)合曲線

2.5 動態(tài)吸附實驗

MIPs-A 柱、MIPs-B 柱和 NIPs-C 柱分別使用 0.10 mmol/L 異葒草苷對照品溶液上樣，使用分光光度法分別測定異葒草苷在相同MIPs 柱不同洗脫液及MIPs 柱與NIPs 柱間的洗脫保留情況，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。圖4-①為MIPs 柱與NIPs柱上樣后使用甲醇洗脫的泄露曲線圖，由圖可看出NIPs 柱比MIPs 柱更早出峰且峰型更窄，這是由于模板分子異葒草苷在MIPs中具有特異的結(jié)合位點，而在NIPs 中不具有這種結(jié)合位點，因此，異葒草苷在MIPs 柱上的保留時間更長。圖4-②為MIPs 柱使用不同洗脫液洗脫的泄露曲線，MIPs-A 柱先使用甲醇洗脫、再用甲醇∶冰醋酸（9∶1）洗脫，相比MIPs-B 柱只使用甲醇進行洗脫，MIPs-A 柱在洗脫后期多出一個峰，這是由于MIPs 對模板分子異葒草苷具有一定的吸附能力，在使用更強的洗脫劑甲醇∶冰醋酸（9∶1）時被更集中的洗脫下來。通過對比動態(tài)吸附試驗結(jié)果，可以說明制備所得MIPs 對模板分子異葒草苷具有一定的吸附能力且吸附能力比NIPs強。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

使用1.7 項下的色譜條件，測定異葒草苷的系列濃度的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定3次，對平均峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x）進行線性分析，計算得回歸方程y=251960x+251712（r=0.9991）。結(jié)果顯示異葒草苷在17.44-52.32 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗

精密吸取異葒草苷對照品溶液10 μL，采用1.7 項的色譜條件，連續(xù)進樣6 次，測定異葒草苷峰面積，經(jīng)計算RSD=0.22%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.6.3 重現(xiàn)性試驗

取同一供試品溶液5份，在1.7項的色譜條件進行測定，記錄異葒草苷的峰面積，經(jīng)計算RSD=2.38%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液分別于0 h，2 h，4 h，8 h，16 h進樣10 μL，記錄異葒草苷的峰面積，經(jīng)計算RSD=1.35%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 回收率試驗

采用加樣回收法，精密稱取已知含量的供試品6份，分別加入適量的異葒草苷對照品，按1.6 項操作制備供試品溶液，在1.7 項的色譜條件進行測定峰面積，計算異葒草苷的平均回收率為99.1%，RSD=1.40%。

2.7 淡竹葉中異葒草苷分離研究

圖4 異葒草苷的動態(tài)吸附曲線

圖5 淡竹葉提取液高效液相色譜圖

圖6 淡竹葉洗脫液高效液相色譜圖

淡竹葉中含有多種黃酮類化合物，其中以異葒草苷含量較高，圖5 為淡竹葉提取液（含異葒草苷37.6%）使用1.7 項下色譜條件得到的高效液相色譜圖，圖6 為淡竹葉提取液經(jīng)過MIPs 柱洗脫所得的中段洗脫液（含異葒草苷83.6%）在同一色譜條件下所得的高效液相色譜圖。對比兩色譜圖可以看出，淡竹葉提取液經(jīng)MIPs 柱洗脫后的中段洗脫液除異葒草苷外其他色譜峰明顯減少，異葒草苷含量提高了46%，這可能是由于MIPs 對淡竹葉提取液中的異葒草苷具有一定的選擇性吸附能力，而對淡竹葉中的其他成分沒有選擇性吸附。淡竹葉中的其他成分在MIPs 柱中的保留時間較短，主要在洗脫前期被洗脫下來，而異葒草苷保留時間較長洗脫較慢。因此，說明MIPs柱對淡竹葉提取液中的異葒草苷存在一定的純化能力。

將淡竹葉提取液分別過MIPs 柱和NIPs 柱，收集洗脫液，洗脫液進行HPLC 分析，以異葒草苷為指標(biāo)考察聚合物對異葒草苷的分離效果。以異葒草苷的百分含量為縱坐標(biāo)，洗脫體積為橫坐標(biāo)，作異葒草苷在MIPs 柱和NIPs 柱的洗脫曲線圖，見圖7。通過比較兩條曲線可以看出，由于MIPs柱對異葒草苷具有特異性吸附性能力，異葒草苷在MIPs 柱的保留時間要比在NIPs 柱長，因此可將該MIPs 用于異葒草苷的分離純化。

3 討論

本研究制備了異葒草苷分子印跡復(fù)合物，并對該聚合物的表面形態(tài)和吸附性能進行了研究，結(jié)果表明，該分子印跡復(fù)合物對異葒草苷有較好的結(jié)合性能與分離能力，這是由于MIPs與模板分子異葒草苷之間存在多個相互作用的位點和相互匹配的空間，且形成了氫鍵等非共價鍵，使得MIPs對模板分子具有較強的吸附能力。制備的分子印跡聚合物能有效的富集淡竹葉中的異葒草苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達83.6%，與傳統(tǒng)方法相比，分子印跡聚合物在分離的效率、效果上有明顯的提高，不過與制備色譜的分離結(jié)果相比[11]，在純度上仍存在一些差距。雖然制備色譜能達到很好的分離純化效果，但也存在成本高、應(yīng)用不便等問題。因此制備所得異葒草苷分子印跡聚合物的吸附性能還有待進一步提高，可考慮進一步優(yōu)化制備條件、引入先進的制備方法，或者結(jié)合計算機模擬技術(shù)來提高合成和研發(fā)效率。

圖7 淡竹葉中異葒草苷的洗脫曲線圖

本研究為淡竹葉中異葒草苷的提取分離提供了新的方法，也為中藥有效成分的分離純化提供了新的思路。分子印跡技術(shù)具有制備過程簡單、周期短、穩(wěn)定性好、選擇性好、消耗少等優(yōu)點，應(yīng)用于中藥有效成分的分離純化，可以提高分離效率，減少溶劑用量，并有助于推動綠色中藥的發(fā)展。但是，分子印跡技術(shù)在其應(yīng)用過程中仍然存在一些問題，如水相中分子印跡聚合物的不相容性、結(jié)合位點不均勻、模板滲漏等，因此，分子印跡技術(shù)在中藥方面的應(yīng)用有待更進一步的研究。