許安萍，王 鑫，韓 麗，李志剛

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京 100010；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

老年性癡呆，又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶功能不斷衰退，并可能伴有精神癥狀和行為障礙[1]，是最常見的癡呆類型。隨著社會老齡化的必然趨勢，AD 作為一種老年期常見病，其產(chǎn)生的沉重家庭負(fù)擔(dān)及嚴(yán)重社會問題日益突出，已經(jīng)成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一[2]。

海馬區(qū)是學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。谷氨酸是中樞內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其在興奮性突觸傳遞和突觸可塑性改變中發(fā)揮關(guān)鍵作用。突觸傳遞的可塑性變化是學(xué)習(xí)、記憶的神經(jīng)生理基礎(chǔ)。而記憶加固依賴于N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受體(NMDARs)的協(xié)調(diào)活動[3-4]。研究[5-6]表明，NMDARs 通過介導(dǎo)鈣離子依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，參與學(xué)習(xí)空間策略。然而，在AD 等與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病中，NMDARs 介導(dǎo)的功能通常被破壞[7,8]。研究[9-11]已證實電針具有改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用，但其作用機制仍未完全闡釋，是否與督脈電針調(diào)節(jié)NMDARs 功能尚不明確?；诖?，本研究以“通督啟神”理論為指導(dǎo)，選用百會穴(GV20)、印堂穴(GV29)及水溝穴(GV26)三個督脈穴位，通過Morris水迷宮實驗，觀察電針干預(yù)對小鼠認(rèn)知能力的影響；聚焦NMDARs，應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）技術(shù)，探討電針治療對海馬N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受體NMDAR1及NMDAR2B的調(diào)節(jié)作用，旨在探討督脈電針在AD預(yù)防中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 月齡 APP/PS1 雄性小鼠和 C57BL/6J 年齡、性別匹配小鼠購自于北京華阜康生物科技有限公司(實驗動物許可證號：SCXK(Jing)2014-0004)。小鼠體重為（28.0 ± 2.0）g，于北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心單籠飼養(yǎng)，給予常規(guī)飲食。室溫保持在（24 ± 2）℃，濕度40%-60%。每天更換墊料和飲用水，保持鼠籠清潔和干燥。在實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。本實驗嚴(yán)格按照中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)實驗動物的使用要求進行操作。

1.2 主要實驗儀器試劑

主要實驗儀器及試劑見表1。

1.3 動物分組與干預(yù)方法

16只APP/PS1小鼠采用隨機數(shù)字表法分為兩組：癡呆模型組和電針治療組，每組8 只。另外，8 只C57BL/6J小鼠為對照組。

根據(jù)以往研究結(jié)果，本實驗選取百會穴、水溝穴及印堂穴，定位方法參考《實驗動物腧穴標(biāo)準(zhǔn)》。電針治療組，利用自制鼠套固定后進行電針干預(yù)，隔日1次，連續(xù)治療4 周。具體穴位定位及操作方法見表2。對照組及癡呆模型組小鼠，以相同方法用自制鼠袋束縛20 min。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 Morris 水迷宮

Morris水迷宮測試分為2個實驗，第1個實驗是定位航行實驗，于電針治療結(jié)束后第二天進行，持續(xù)4天。第2 個實驗是空間探索實驗，于定位航行實驗后進行。

定位航行實驗[12]：Morris 水迷宮劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 個象限。正式實驗前1 天，保持動物在水池中自由游泳90 s，上午、下午各1 次，使其熟悉迷宮環(huán)境。正式實驗時，水池注水30 cm 深，滴加奶粉使水呈不透明，使用溫度計監(jiān)測水溫并維持在（22±1）℃，保持實驗過程中室內(nèi)光線強度一致。圓柱形平臺置于Ⅲ象限中央水面下2 cm。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ3 個象限各選距離水池圓心相等的點作為入水點，訓(xùn)練時先將動物置于平臺上10 s，然后將動物面朝池壁輕輕放入水中，圖像采集系統(tǒng)記錄小鼠從入水至找到平臺的時間（即逃避潛伏期），小鼠在平臺上停留5 s視為上臺成功。若60 s內(nèi)找不到平臺，逃避潛伏期記為60 s。每天Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ3 個象限各訓(xùn)練2 次，以6 次潛伏期的算術(shù)均值作為這一天的成績進行統(tǒng)計分析。以此評價小鼠空間學(xué)習(xí)能力。

表1 主要實驗儀器試劑信息

空間探索實驗：定位航行實驗結(jié)束后，撤除平臺。然后分別在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限的入水點放入小鼠，記錄小鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺所在位置的次數(shù)及在Ⅲ象限停留時間進行統(tǒng)計分析。以此評價小鼠空間記憶能力。

1.4.2 Western Blot 檢測

（1）樣本制備：Morris 水迷宮測試后 1 天，每組隨機選取6只小鼠麻醉后開顱取海馬，然后儲存在-80℃冰箱備用。

（2）Western blot 步驟：海馬組織蛋白抽提后，BCA法進行蛋白定量，以RIPA 調(diào)整蛋白濃度，加入5 ×還原樣品緩沖液后樣品終濃度：4 mg/ml。煮沸變性5 min。配制12%的分離膠，濃縮膠濃度為5%。20 μg/孔上樣，濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V 300 mA 恒流，0.45 μm 孔徑 NC 膜，轉(zhuǎn)膜時間 1 h。將膜完全浸沒3% BSA-TBST 中室溫輕搖30 min 封閉后分別加入NMDAR1（1:1000）及NMDAR2B（1:2000）抗體，4℃孵育過夜。加入二抗（1:20000），洗膜后加入ECL，反應(yīng)后膠片曝光顯影定影后掃描分析結(jié)果。β-actin作為內(nèi)參蛋白。

表2 實驗穴位定位及操作方法

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，Morris 水迷宮定位航行實驗中逃避潛伏期采用重復(fù)測量設(shè)計資料的多變量方差分析（Repeated measures two-way ANOVA）分析；Morris 水迷宮空間探索實驗及Western blot 結(jié)果采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）分析，組間采用最小顯著差異法（LSD）分析。P< 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實驗結(jié)果

在Morris 水迷宮定位航行實驗中，空間學(xué)習(xí)能力通過小鼠爬上平臺躲避水的時間(逃避潛伏期)來評估。對照組及電針治療組的逃避潛伏期均隨著訓(xùn)練有所減少，但癡呆模型組的逃避潛伏期無明顯變化，說明模型小鼠的學(xué)習(xí)能力下降（見圖1）；與第1 天相比，對照組在第3 天，電針治療組在第4 天，逃避潛伏期開始明顯縮短（P<0.01)（見圖2）。

2.2 空間探索實驗結(jié)果

在Morris 水迷宮空間探索實驗中，癡呆模型組小鼠在第Ⅲ象限目標(biāo)平臺穿越次數(shù)及該象限停留時間均較對照組明顯減少(P<0.05)，說明模型小鼠的記憶能力受損；與癡呆模型組相比，電針治療組的穿越平臺次數(shù)及在Ⅲ象限停留時間均有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖3-4）。

2.3 Western Blot結(jié)果

與對照組比較，癡呆模型組小鼠的海馬NMDAR1及NMDAR2B 表達水平明顯下降(P< 0.01)；與癡呆模型組相比，電針治療組的NMDAR1 及NMDAR2B 表達均有所增加(P<0.01)（見圖5-6）。

3 討論

根據(jù)中醫(yī)理論，“腦為元神之府”，AD 以認(rèn)知障礙和記憶能力損害為主要表現(xiàn)，病位在腦。《素問·骨空論》中記載督脈“入絡(luò)腦”。督脈是臟腑氣血精氣上輸于腦的重要路徑，其功能正常，陽氣得以運行于周身，內(nèi)化精微以養(yǎng)神明；若督脈為病，神無所統(tǒng)，則會導(dǎo)致神志相關(guān)病癥[13]。前期研究[14,15]表明，通調(diào)督脈可以調(diào)節(jié)β淀粉樣蛋白相關(guān)分泌酶及降解酶的水平，增加腦血流量，良性調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞有關(guān)通路[16]，從而促進淀粉樣蛋白代謝，保護認(rèn)知功能，改善記憶能力，達到治療AD的作用。

圖1 各組逃避潛伏期變化趨勢圖

圖2 各組逃避潛伏期組內(nèi)比較

圖3 各組穿越平臺次數(shù)比較

圖4 各組Ⅲ象限停留時間比較

圖6 各組海馬NMDAR2B表達情況

AD 起病隱匿，早期癥狀輕微，典型的征象是記憶障礙，疾病中期患者認(rèn)知障礙隨著病情進展逐漸出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)空間定向障礙。學(xué)習(xí)與記憶兩者關(guān)系密切，學(xué)習(xí)是獲取新知識的過程，其結(jié)果是記憶。評估小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的方法有多種，Morris 水迷宮實驗是目前公認(rèn)有效的方法之一[17]。在定位航行實驗中，小鼠通過多次練習(xí)尋找水下固定的圓形平臺，從而獲得穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知。結(jié)果顯示，癡呆模型組小鼠逃潛伏期均值高于對照組，并且通過4 天訓(xùn)練無明顯變化。這一現(xiàn)象表明，APP/PS1 小鼠6 月齡學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，避水積極性下降。而電針治療組中，APP/PS1 小鼠的逃避潛伏期隨訓(xùn)練逐漸下降，在第4天明顯縮短，提示電針對癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)能力有促進作用。在空間探測實驗中，模型組小鼠表現(xiàn)出對目標(biāo)(平臺)無明顯傾向性的隨機搜索策略。這一策略表明小鼠的學(xué)習(xí)行為模式發(fā)生了改變，記憶能力明顯受損。而電針治療組平臺穿越次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間均有所增加，提示電針對癡呆模型小鼠記憶同樣具有保護作用。

谷氨酸是一種興奮性氨基酸，是中樞內(nèi)重要的內(nèi)源性興奮性氨基酸遞質(zhì)，對神經(jīng)元有極強的興奮作用。谷氨酸在中樞神經(jīng)元間發(fā)揮的興奮性突觸傳遞作用主要通過NMDAR。中樞谷氨酸受體至少分為5種，研究[18]表明，NMDARs參與了海馬CA1區(qū)長時程增強（LTP）等突觸可塑性誘導(dǎo)及學(xué)習(xí)和記憶機制，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)和記憶等關(guān)鍵功能的基礎(chǔ)[19]。在認(rèn)知能力減退為主要特征的疾病中，NMDARs的表達下降引起NMDAR依賴性的突觸可塑性降低[20]。NMDAR 存在多個亞單位，但功能性的 NMDAR 由 NMDAR1 和 NMDAR2 共同組成，NMDAR1和NMDAR2共表達可顯著增強通道活性。其中NMDAR1是發(fā)揮生物效應(yīng)的必要結(jié)構(gòu)蛋白。NMDAR與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，其中NMDAR2B與之最為密切[21]。本實驗結(jié)果表明，督脈電針促進癡呆模型組小鼠海馬NMDAR1及NMDAR2B的表達。

綜上所述，本研究重點在于督脈電針對癡呆模型小鼠海馬NMDARs的影響。實驗結(jié)果顯示電針治療組的學(xué)習(xí)記憶能力改善，并且NMDAR1及NMDAR2B的表達增加。因此，電針可能通過調(diào)整NMDARs介導(dǎo)的LTP，增強認(rèn)知能力。這可能是電針治療癡呆的作用途徑之一[22-24]。值得注意的是，NMDARs還參與介導(dǎo)Ca2+/鈣調(diào)蛋白通路、NO 通路等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，然而各條信號通路并不是孤立的，而是彼此聯(lián)系，其在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶的過程中可能存在其他潛在作用機制[25-26]。今后，本課題組將圍繞NMDARs進一步研究相關(guān)信號通路，深入探討電針保護學(xué)習(xí)和記憶等腦高級功能的機制。