曾 靜， 葛文松， 楊蕊旭， 范建高， 汪保燦

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 消化內(nèi)科， 上海 200092

1 病例資料

患兒女性，13歲，藏族。因“皮膚鞏膜黃染13年”于2018年12月13日入住本院?；颊叱錾蠹闯霈F(xiàn)皮膚鞏膜黃染至今，黃染偶可于進(jìn)食油膩食物后加深，近期勞累后黃染加重，入院前查肝功能：總膽紅素343 μmol/L，ALT 17 U/L，AST 37 U/L。病史特點(diǎn)：自幼皮膚鞏膜黃染，勞累、進(jìn)食油膩食物后黃染程度加重，無(wú)皮膚瘙癢，無(wú)乏力，無(wú)關(guān)節(jié)疼痛。多次查肝功能提示總膽紅素升高，波動(dòng)于200～300 μmol/L，以非結(jié)合膽紅素升高為主，酶學(xué)正常。父母非近親結(jié)婚，患者兄弟姐妹5人，家族中母親有類(lèi)似黃疸病史，妹妹出生時(shí)有黃疸，但均未行特殊檢查。體格檢查：全身皮膚、鞏膜可見(jiàn)黃染，余無(wú)陽(yáng)性體征。入院后輔助檢查：膽汁酸2.1 μmol/L，ALT 12 U/L，AST 23 U/L，ALP 309 U/L，GGT 11.0 U/L，總膽紅素340.0 μmol/L，直接膽紅素23.1 μmol/L。血常規(guī)均正常。網(wǎng)織紅細(xì)胞、觸珠蛋白正常。病毒性肝炎、自身免疫性肝病和肝豆?fàn)詈俗冃缘南嚓P(guān)檢測(cè)均為陰性。腹部超聲與磁共振成像未顯示任何異常。綜合患者病情，考慮Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型。予以苯巴比妥誘導(dǎo)試驗(yàn)，后復(fù)查肝功能：膽汁酸1.8 μmol/L，ALT 11 U/L，AST 21 U/L，ALP 256 U/L，GGT 13.0 U/L，總膽紅素220.6 μmol/L，直接膽紅素19.1 μmol/L。

同時(shí)對(duì)黃疸相關(guān)基因進(jìn)行序列分析，用乙二胺四乙酸抗凝管抽取患者外周靜脈血2 ml。采用QIAamp DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)抽提基因組DNA，并測(cè)量其吸光度值及濃度。提取的DNA用DNA酶片段化后采用磁珠法進(jìn)行純化，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并連接上接頭序列，經(jīng)定制的Panel探針(illumina Inc,USA)兩次捕獲及純化，再經(jīng)PCR擴(kuò)增和純化后獲得的最終文庫(kù)在NextSeq500測(cè)序儀(illumina Inc,USA)上對(duì)Panel相關(guān)基因的外顯子區(qū)進(jìn)行測(cè)序。所有測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果采用BWA軟件與參考序列(UCSC hg19)進(jìn)行比對(duì)，采用儀器默認(rèn)設(shè)置[1]，使用文獻(xiàn)[2]報(bào)道方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋。經(jīng)篩選流程篩選，并結(jié)合患者臨床資料和生物信息學(xué)軟件(PolyPhen2、LRT、Mutation Taster等)預(yù)測(cè)結(jié)果，對(duì)各個(gè)基因的功能、變異情況以及遺傳模式進(jìn)行分析，得到可疑候選突變。對(duì)可疑候選突變的位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增及進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

最終發(fā)現(xiàn)了UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)1A1基因的兩個(gè)突變。一個(gè)是在第1外顯子的核苷酸位置211處用A取代G(c.211G>A)，導(dǎo)致UGT1A1酶的密碼子71處的甘氨酸(G)變?yōu)楸彼?R)(p.G71R)(圖1)。第二個(gè)是第5外顯子的核苷酸位置1456處的T至G的轉(zhuǎn)換(c.1456T>G)，導(dǎo)致密碼子486處的酪氨酸(Y)被天冬氨酸(D)取代(p.Y486D)(圖2)。在其他外顯子中均未檢測(cè)到突變。經(jīng)過(guò)UGT1A1全編碼子測(cè)序突變分析，最終明確診斷為Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型。

2 討論

遺傳性非結(jié)合性高膽紅素血癥的分類(lèi)是基于歷史中相關(guān)的兩個(gè)報(bào)告。Gilbert綜合征(Gilbert syndrome，GS)最初是在1901年被報(bào)道為一種家族性非溶血性良性高膽紅素血癥[3]。1952年，Crigler和Najjar獨(dú)立報(bào)道了可以引起核黃疸的嚴(yán)重家族性非結(jié)合性高膽紅素血癥[4]，并將先天性家族非結(jié)合性高膽紅素血癥分為兩組：先天性家族性非溶血性高膽紅素血癥伴核黃疸和家族性非溶血性良性高膽紅素血癥。1969年，Arias等[5]將黃疸嚴(yán)重并對(duì)苯巴比妥無(wú)反應(yīng)的一類(lèi)作為Crigler-Najjar綜合征 Ⅰ 型(Crigler-Najjar syndrome，CNS-Ⅰ)，黃疸良性并對(duì)苯巴比妥有反應(yīng)的一類(lèi)作為CNS-Ⅱ。

UGT是一種結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜蛋白，在把葡萄糖醛酸從UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移到其他分子上的過(guò)程中起到催化作用。所以，它在膽紅素的代謝中起著關(guān)鍵作用，可以提高受體分子的水溶性，從而促進(jìn)了膽紅素從體內(nèi)通過(guò)膽汁和尿液排泄[6]。在人類(lèi)中，UGT分為兩個(gè)家族，UGT1和UGT2。UGT1家族包含9種功能酶(UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A5、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9和UGT1A10)和4種假基因(UGT1A2P、UGT1A11P、UGT1A12P和UGT1A13P)， 由2q37上的單個(gè)基因編碼[7]。UGT1A1是唯一與膽紅素代謝相關(guān)的酶，主要在肝臟中表達(dá)[6]。UGT1A1基因的遺傳變異，導(dǎo)致酶活性的減少或缺失，進(jìn)而導(dǎo)致不同程度的高非結(jié)合膽紅素血癥，包括前面提到的GS和CNS[8-10]。GS在不同種族間的相應(yīng)突變和多態(tài)性上存在一定差異。其中在白種人和非洲人中，大多數(shù)GS是TATA盒啟動(dòng)子變異UGT1A1*28[11]。但在東亞，包括日本、中國(guó)和韓國(guó)，UGT1A1*6多態(tài)性是重要的原因[12-14]。而CNS-Ⅰ的基因突變可發(fā)生在UGT1A1的第1外顯子，也可發(fā)生在第2～5外顯子，CNS-Ⅱ的突變位點(diǎn)多在UGT1A1的第1、2、4、5外顯子[10]。

圖1 UGT1A1外顯子l(Exon1)測(cè)序結(jié)果

圖2 UGT1A1外顯子5(Exon5)測(cè)序結(jié)果

不同的突變位點(diǎn)，導(dǎo)致酶活性減少或缺失的程度不同，進(jìn)而對(duì)患者膽紅素代謝水平產(chǎn)生不同的影響。該類(lèi)疾病應(yīng)該對(duì)肝葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶水平進(jìn)行測(cè)定，從而做相應(yīng)的診斷。但真正臨床實(shí)施存在一定困難，臨床上該類(lèi)疾病的鑒別主要還是以患者的臨床表現(xiàn)以及膽紅素水平為診斷依據(jù)。GS患者通常膽紅素升高程度較低(20～80 μmol/L)，臨床上無(wú)需特殊干預(yù)，定期隨訪(fǎng)膽紅素水平即可。CNS-Ⅰ型的總膽紅素水平通常超過(guò)正常范圍的25倍(342～684 μmol/L)，在嚴(yán)重的CNS-Ⅰ中，UGT1A1活性完全缺乏導(dǎo)致遺傳性高非結(jié)合膽紅素血癥，同時(shí)可能引起膽紅素腦病(核黃疸)，這類(lèi)患者并無(wú)特殊有效的治療方案，最終需行肝移植并且預(yù)后差。但CNS-Ⅱ患者由于酶活性仍部分存在(10%)，總膽紅素水平通常在正常范圍的6～25倍(103～342 μmol/ L)[15]，這類(lèi)患者可以存活至成年[16]，嚴(yán)重時(shí)可予以苯巴比妥治療，將膽紅素控制在合適的水平，適當(dāng)時(shí)可逐步停藥[17-19]。

在本文中，筆者發(fā)現(xiàn)該高非結(jié)合膽紅素血癥的藏族女孩具有UGT1A1基因中的兩個(gè)突變組成的復(fù)合雜合突變(p.G71R和p.Y486D)。根據(jù)病史，以及臨床生化和遺傳學(xué)的發(fā)現(xiàn)，臨床上給予CNS-Ⅱ的診斷。根據(jù)既往相關(guān)研究結(jié)果，在p.G71R和p.Y486D的單一純合子中，UGT1A1活性分別為野生型活性的(32.2±1.6)%和(7.6±0.5)%。p.G71R和p.Y486雙純合子的酶活性為(6.2±1.6)%，而G71R的雜合子活性為(60.2±3.5)%[20-21]。p.G71R多態(tài)性是亞洲人群中最常見(jiàn)的GS的遺傳原因，突變頻率為11%～21%。p.Y486D的錯(cuò)義突變既往在日本和中國(guó)的CNS-Ⅱ患者中報(bào)道。在先前報(bào)道的CNS-Ⅱ病例中，p.Y486D和p.G71R經(jīng)常在同一時(shí)間觀(guān)察到雜合或純合子突變[18-19,21-22]。p.G71R突變并不會(huì)導(dǎo)致UGT1A1活性明顯降低，疾病程度一般較輕。而由于第5外顯子的p.Y486D突變會(huì)影響所有從UGT1家族表達(dá)的亞型(從UGT1A1到1A10)的葡萄糖醛酸化，所以p.Y486D突變是較嚴(yán)重的。

綜上所述，第1外顯子和第5外顯子可能是亞洲人群中UGT1A1基因的熱點(diǎn)突變區(qū)域，而p.G71R和p.Y486D是導(dǎo)致UGT1A1遺傳相關(guān)的高非結(jié)合膽紅素血癥的兩種最常見(jiàn)突變。對(duì)于原因不明的高非結(jié)合膽紅素血癥，應(yīng)進(jìn)行UGT1A1基因分析，特別是第1外顯子和第5外顯子區(qū)域的分析。對(duì)具有特殊基因型的患者，尤其包括家庭成員的相關(guān)基因分析可以幫助了解疾病的基因型與表型的聯(lián)系以及進(jìn)行臨床診斷。