趙冰茹，毋狀元，董 紅，霍 飛，陳 童，羅永明，王岳強(qiáng)，季 斐，鄭新寶*

(1．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2．新疆阿勒泰地區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆 阿勒泰 836501；3．新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，新疆 烏魯木齊 830011)

中國(guó)擁有豐富的綿羊遺傳資源，其形成反映出不同生態(tài)環(huán)境下各民族畜牧業(yè)的文化發(fā)展歷程，也為今后新品種的培育奠定了豐富的遺傳基礎(chǔ)[1]。新疆復(fù)雜的地形地貌及多樣的生態(tài)與文化，構(gòu)成了綿羊系統(tǒng)發(fā)育與演變的自然基礎(chǔ)，成為中國(guó)綿羊遺傳資源最豐富的省區(qū)[2]。多浪羊、巴爾楚克羊、柯?tīng)柨俗窝?、巴音布魯克羊均是新疆南疆地區(qū)優(yōu)良的地方綿羊品種。從品種起源上看，多浪羊、巴音布魯克羊是外來(lái)品種同本地羊雜交培育而成，而巴爾楚克羊、柯?tīng)柨俗窝蚴怯僧?dāng)?shù)鼐d羊培育而成。從地理位置上看，多浪羊、巴爾楚克羊的核心產(chǎn)區(qū)位于塔里木盆地西北部，而柯?tīng)柨俗窝?、巴音布魯克羊位于天山高寒地帶[2]。

微衛(wèi)星標(biāo)記具有保守性，屬于等顯性遺傳，多態(tài)性豐富，被認(rèn)為是能廣泛應(yīng)用的遺傳標(biāo)記之一，對(duì)動(dòng)物遺傳多樣性研究起到了巨大的推動(dòng)作用[3-4]。本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，開(kāi)展了多浪羊、巴爾楚克羊、柯?tīng)柨俗窝?、巴音布魯克羊遺傳多樣性及遺傳分化的研究，以期為新疆特有的地方綿羊品種保護(hù)、揭示其遺傳結(jié)構(gòu)、品種分類(lèi)和科學(xué)開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)采集了分別來(lái)自新疆南疆地區(qū)麥蓋提縣種羊場(chǎng)、和靜縣巴音布魯克羊種羊場(chǎng)、阿合奇縣柯?tīng)柨俗窝虮Ｗo(hù)區(qū)、巴楚縣巴爾楚克羊種羊場(chǎng)的多浪羊、巴音布魯克羊、柯?tīng)柨俗窝?、巴爾楚克?個(gè)地方綿羊品種核心保種場(chǎng)或保護(hù)區(qū)的群體。由于公羊系譜檔案清晰完整，每只公羊代表一個(gè)血統(tǒng)，因此，在保證樣品個(gè)體具備品種的典型特征的基礎(chǔ)上，選擇無(wú)親緣關(guān)系、系譜檔案清晰的成年公羊。其中巴音布魯克羊15只，柯?tīng)柨俗窝?5只，巴爾楚克羊13只，多浪羊15只，共58只公羊。頸靜脈采血3 mL，EDTA抗凝，血樣運(yùn)輸過(guò)程中低溫保存，后于-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取血樣中基因組DNA。利用NanoDrop 2000(Thermo Scientific,USA)測(cè)定提取的DNA樣品的完整性和濃度，將所有樣品的濃度調(diào)整為50 ng/μL左右。

1.2.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(10 mmol/L)、Marker、6×DNA Loading Dye由上海生工生物技術(shù)有限公司提供；高度去離子甲酰胺(HIDI)、分子量標(biāo)記物L(fēng)IZ500由美國(guó)ABI公司提供。

1.2.3 引物篩選 采用聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和國(guó)際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)(ISAG)推薦的9個(gè)微衛(wèi)星引物，熒光引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，選擇綠色(HEX)和藍(lán)色(FAM)兩種熒光標(biāo)記，分子內(nèi)標(biāo)為L(zhǎng)IZ500(美國(guó)ABI公司合成)，引物信息詳情見(jiàn)表1。

表1 9個(gè)微衛(wèi)星引物的信息Table 1 The information of 9 microsatellite loci

1.2.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) PCR反應(yīng)體系：10 ×Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物(10 mmol/ L)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板(50 ng/μL)1 μL，用超純水補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 變性30 s，55～60 ℃ 退火30 s(因位點(diǎn)而異)，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物合格后，由生工生物工程(上海)股份有限公司用DNA測(cè)序儀(AB 3730XL)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用GENEMAPPER4.0軟件(Applied biosystems)進(jìn)行分子量標(biāo)準(zhǔn)校對(duì)和微衛(wèi)星基因型分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)群體的觀察等位基因數(shù)(Observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles，Ne)、Shannon信息指數(shù)(Shannon's Information index，I)、多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)、觀察雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)等遺傳參數(shù)用PopGene32軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。F-statistics固定指數(shù)包括群體內(nèi)近交系數(shù)(Fixation index of subpopulation，F(xiàn)is)、總?cè)后w近交系數(shù)(Fixation index of total population，F(xiàn)it)、群體間分化系數(shù)(Fixation index resulting from comparing subpopulations to the total population，F(xiàn)st)和基因流(gene flow，Nm)，用FSTAT Version 2.9.3.2軟件分析。用DISPAN軟件包計(jì)算Nei's標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(Nei's standard genetic distance , DS)和Nei's遺傳一致度(Nei's genetic identity, I)；構(gòu)建基于DS的UPGMA樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星座位多態(tài)性變化

PCR產(chǎn)物在DNA測(cè)序儀(AB 3730XL)測(cè)序后基因分型部分結(jié)果如圖1所示。各峰圖可清晰統(tǒng)計(jì)綿羊微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因的片段長(zhǎng)度。由于熒光毛細(xì)管電泳具有典型性峰形，便于統(tǒng)計(jì)判斷等優(yōu)點(diǎn)，保證了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

2.2 不同綿羊品種的遺傳多樣性比較

表2結(jié)果表明，每個(gè)位點(diǎn)的Ne在不同群體中的分布是不均勻的，有比較明顯的差異。9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Na與Ne之間相差均較大，說(shuō)明在這些基因座上，群體的等位基因分布不均勻，遺傳差異較大，這可能是由于人工選擇所造成的。而即使同一個(gè)微衛(wèi)星座位，在不同的品種群體內(nèi)，其等位基因頻率和等位基因數(shù)目分布也是不均一的，如MAF70座位，柯?tīng)柨俗窝虻任换驍?shù)目均多于其它3個(gè)品種，這充分體現(xiàn)了品種遺傳上的差異。9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為高度多態(tài)，這表明4個(gè)綿羊品種呈現(xiàn)豐富的遺傳多樣性。

表 2 4個(gè)綿羊品種9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Genetic diversity indexs in the 4 sheep breeds on the 9 microsatellite loci

2.3 群體雜合度和遺傳分化分析

平均雜合度的大小可近似反映出群體遺傳結(jié)構(gòu)變異的高低，表3和表4結(jié)果表明：群體平均雜合度在0.7146～0.8573之間，座位的平均雜合度在0.7497～0.8600之間。各品種平均雜合度越大，反映了各品種變異程度也越大。對(duì)各微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行F-統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明：FST的變化范圍為0.0222～0.0545，平均值為0.0372；群體每代遷移數(shù)在4.3371～11.0227，平均值為6.4686。

表 3 4個(gè)綿羊品種觀察雜合度和期望雜合度Table 3 The observed and expected heterozygosity in the 4 sheep breeds

表4 9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的F-統(tǒng)計(jì)量表，基因流，期望雜合度和觀察雜合度Table 4 F-statistic analysis, gene flow, and the expected and observed heterozygosity on the 9 microsatellite loci

2.4 基于聚類(lèi)分析的遺傳關(guān)系

各品種間的Nei's標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(DS)和Nei's遺傳一致度(I)見(jiàn)表5，結(jié)果表明：柯?tīng)柨俗窝蚺c巴音布魯克羊群體的遺傳距離最遠(yuǎn)(DS=0.2970)，其次是多浪羊和柯?tīng)柨俗窝蛉后w(Ds=0.2763)，遺傳距離最近的是多浪羊與巴爾楚克羊群體(Ds=0.1914)，巴爾楚克羊與巴音布魯克羊群體(Ds=0.2079)遺傳距離次之。這一結(jié)果與它們的地理分布基本一致。

4個(gè)綿羊品種基于DS的UPGMA樹(shù)的聚類(lèi)結(jié)果如圖2所示，主要分為2個(gè)分支：多浪羊群體最先分離出來(lái)，單獨(dú)聚為一類(lèi)，為第一分支；剩下的3個(gè)群體聚為一類(lèi)，為第二分支，巴音布魯克羊再分離出來(lái)，巴爾楚克羊和柯?tīng)柨俗窝蚓蹫橐活?lèi)。

表 5 4個(gè)綿羊品種的Nei's遺傳一致度(I，對(duì)角線上)和Nei's標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(DS，對(duì)角線下) Table 5 Nei's genetic identity (I, above the diagonal) and Nei's standard genetic distance(DS, below the diagonal) among 4 sheep breeds

3 討 論

本研究對(duì)4個(gè)綿羊品種的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行分析，共檢測(cè)到136個(gè)等位基因，平均有效等位基因數(shù)Ne在5.20～6.03之間，均大于5個(gè)，從而說(shuō)明各品種內(nèi)的遺傳變異比較豐富。研究表明[5-6]，一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)至少應(yīng)有4個(gè)等位基因才能較為準(zhǔn)確的應(yīng)用于遺傳多樣性評(píng)估，因此，本研究所用的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均可以用于綿羊遺傳多樣性的評(píng)估。在遺傳連鎖分析中，平均多態(tài)信息含量值大于0.7的微衛(wèi)星位點(diǎn)為最理想的選擇標(biāo)記[7]，研究中選用的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC值平均為0.83，均為高度多態(tài)位點(diǎn)，因此，本試驗(yàn)選取的微衛(wèi)星標(biāo)記在4個(gè)綿羊群體中具有豐富的遺傳多態(tài)性，可作為進(jìn)一步連鎖分析的侯選遺傳標(biāo)記，同時(shí)也說(shuō)明這些地方品種間的個(gè)體差異性較大，遺傳變異大，選擇潛力大[8]。但由于本試驗(yàn)樣本量較少，9種微衛(wèi)星標(biāo)記在這4個(gè)地方綿羊品種中還可能存在新的等位基因和基因型，有待擴(kuò)大群體樣本量深入分析。

遺傳雜合度能反映群體在多個(gè)座位上的遺傳變異，作為衡量群體遺傳變異的最適參數(shù)之一[9]。本研究中群體平均雜合度在0.7146～0.8573之間，9個(gè)座位的平均雜合度為0.8058，屬于高度雜合群體。度量群體間遺傳差異程度的遺傳分化系數(shù)(Fst)僅為0.0372，說(shuō)明群體間的遺傳變異為3.72%，而96.28%為群體內(nèi)的遺傳變異，表明4個(gè)綿羊品種具有相對(duì)較高的遺傳多樣性?；蛄骺梢苑从巢煌N群之間基因交流的過(guò)程，揭示種群間可能相互滲透的基因及影響遺傳分化的遺傳現(xiàn)象。研究表明，當(dāng)Nm>1時(shí)，反映群體間的基因流水平較高，群體間遺傳分化較小；當(dāng)Nm>4時(shí)，則充分反映了種群間的基因交流，群體間遺傳分化更??；當(dāng)Nm<1時(shí)，說(shuō)明群體可能由于遺傳漂變而發(fā)生了分化[10-11]。本研究4個(gè)綿羊品種在9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的基因流平均值為6.4686，其中最大值達(dá)到了11.0227，最小值為4.3371，說(shuō)明4個(gè)綿羊群體間存在較活躍的基因交流。

本研究計(jì)算了Nei's標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離進(jìn)行了UPGMA聚類(lèi)。4個(gè)地方品種間的遺傳距離以柯?tīng)柨俗窝蚺c巴音布魯克羊的距離最遠(yuǎn)，距離最近的是多浪羊與巴爾楚克羊。聚類(lèi)結(jié)果表明多浪羊群體單獨(dú)聚為一類(lèi)，剩下的3個(gè)群體聚為一類(lèi)，而巴爾楚克羊和柯?tīng)柨俗窝螂S后又聚為一類(lèi)。李海等[12]利用血液蛋白多型性標(biāo)記新疆南疆多浪羊、卡拉庫(kù)爾羊和巴音布魯克羊3種綿羊遺傳結(jié)構(gòu)，證實(shí)了它們相互間的遺傳差異，聚類(lèi)結(jié)果表明：多浪羊與巴音布魯克羊的遺傳距離較大，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。楊燕等[13]利用26個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了中國(guó)7個(gè)地方綿羊品種的種內(nèi)遺傳變異和品種間遺傳關(guān)系，聚類(lèi)結(jié)果表明哈薩克羊、阿勒泰羊和巴音布魯克羊遺傳關(guān)系很近，三者聚為一類(lèi)。

巴音布魯克羊的地理位置位于天山中部，以和靜縣巴音布魯克草原為中心，是來(lái)源于蒙古羊同當(dāng)?shù)鼐d羊雜交，經(jīng)長(zhǎng)期風(fēng)土馴化形成的地方優(yōu)良品種[14]。巴爾楚克羊的地理位置位于新疆塔里木盆地西北緣，以巴楚縣為中心，品種來(lái)源于當(dāng)?shù)鼐d羊經(jīng)長(zhǎng)期精心選育，逐步形成的地方優(yōu)良品種[15]?？?tīng)柨俗窝虻牡乩砦恢梦挥谔焐侥掀录八锬九璧匚骶?，以克孜勒蘇柯?tīng)柨俗巫灾沃轂跚】h為中心，品種來(lái)源于當(dāng)?shù)鼐d羊經(jīng)長(zhǎng)期精心選育，逐步形成的地方優(yōu)良品種[16]。多浪羊的地理位置位于新疆塔里木盆地西部，以麥蓋提縣為中心，品種來(lái)源于中亞地區(qū)阿富汗購(gòu)入的4只羊同當(dāng)?shù)鼐d羊雜交，經(jīng)多年精心選育逐步形成的地方優(yōu)良品種[17]。本研究中多浪羊與巴爾楚克羊遺傳距離很近，這與二者都位于塔里木盆地西部綠洲，距離近且沒(méi)有大的天然屏障有關(guān)，因此有較多的基因交流。而柯?tīng)柨俗窝蚺c巴音布魯克羊遺傳距離較遠(yuǎn)，可能與二者位于天山山區(qū)不同區(qū)域有關(guān)。在本研究中多浪羊群體單獨(dú)聚為一類(lèi)，剩下的3個(gè)品種中巴音布魯克羊再分離出來(lái)，最后巴爾楚克羊和柯?tīng)柨俗窝蚓蹫橐活?lèi)，這可能是由于巴爾楚克羊和柯?tīng)柨俗窝蚓悄辖镜匮蚪?jīng)長(zhǎng)期精心選育，逐步適應(yīng)了不同的生態(tài)環(huán)境，而巴音布魯克羊、多浪羊是由外來(lái)品種同當(dāng)?shù)匮螂s交后長(zhǎng)期選育的結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究表明新疆南疆地區(qū)4個(gè)地方綿羊品種遺傳多樣性豐富，遺傳雜合度較高，保持了群體的遺傳穩(wěn)定性，為進(jìn)一步保護(hù)和利用當(dāng)?shù)鼐d羊品種提供了更為全面的遺傳學(xué)依據(jù)，具有一定參考價(jià)值。同時(shí)，結(jié)合新疆綿羊品種資源現(xiàn)狀，保種工作應(yīng)有機(jī)結(jié)合開(kāi)發(fā)利用，才可以保持可持續(xù)性發(fā)展。