茍娜娜，焦建鑫，黃 梅，尚占環(huán)*

(1.蘭州大學草地農業(yè)科技學院，草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅蘭州730020；2.蘭州大學生命科學學院，草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅蘭州730000)

環(huán)境改變或人為干擾通常會激活脊椎動物神經內分泌軸，導致動物體內應激激素(糖皮質激素)的釋放，而糖皮質激素的高低在一定程度上反映了動物對環(huán)境的適應能力及機體的防御抗損傷能力[1-3]。動物性腺分泌的性激素還可用來監(jiān)測其生殖生理狀況。因此，動物生理學研究中，類固醇激素水平可用來反映動物的應激水平、生殖狀態(tài)和健康狀況[4-5]。

對于非珍稀動物，可通過表皮收集動物血液或者宰殺動物獲取肌肉、肝臟和其他樣本以檢測動物的內分泌系統(tǒng)是否發(fā)生改變[1，6-7]。但對珍稀和瀕危動物來說這種采樣法存在諸多限制[1]。其次，對動物的捕獲、綁定和麻醉等過程本身是一種強烈的外部刺激，會使動物產生強烈的壓力。另外，由于野生動物生理參數的研究需要長期監(jiān)測和反復采樣，野生動物主要分布在偏僻地區(qū)，不僅隱蔽而且高度警惕，因此在野生動物研究中血液采樣不太實用[6]。因此，內分泌的非損傷性檢測成為許多研究人員的寶貴工具[1]。

目前，國內關于類固醇激素的非損傷性測定在動物上的研究主要集中在糞便樣品，對動物尿液、唾液以及毛發(fā)樣品中類固醇激素的報道極少。本文通過對類固醇激素的分類及作用進行概述，對唾液、尿液、糞便和毛發(fā)樣品類固醇激素的非損傷性測定方法及其應用進行對比和總結，以期為同行在后期研究中對不同環(huán)境動物體類固醇激素的非損傷性測定提供參考依據。

1 類固醇激素的分類及其作用

1.1 類固醇激素的分類

類固醇激素(steroid hormone)也稱為甾體激素，是四環(huán)脂肪烴化合物，在線粒體和內質網內膽固醇通過細胞色素P450(cytochrome P450)酶催化形成環(huán)戊烷多氫菲母核[8-9]，主要在胎盤、腎上腺皮質、精巢、卵巢等器官細胞，主要由性腺和腎上腺皮質分泌。腎上腺皮質主要分泌糖皮質激素(glucocorticoid)、鹽皮質激素(mineralocorticoid)和性激素(sex hormone)三類激素[4，10]。

糖皮質激素經束狀帶產生，通常包括皮質酮(corticosterone)和皮質醇(cortisol)[10]。不同種類動物分泌不同類型的糖皮質激素，如豬、牛、羊、靈長目類動物和人類等哺乳動物主要分泌皮質醇，而鳥類、嚙齒動物、禽類和兔類等主要分泌皮質酮，貓與狗體內二者的分泌量相近[11-12]。鹽皮質激素經球狀帶產生，主要由脫氧皮質酮和醛固酮組成[13]。

脊椎動物的性腺包括雄性睪丸和雌性卵巢。雄激素以睪酮為主，主要通過下丘腦-垂體-睪丸軸的一系列反饋調節(jié)產生。雌激素主要受下丘腦-腺垂體-卵巢軸的調節(jié)，主要包括雌酮化合物(estrone conjugates，EIC)、雌二醇(estradiol，E2)及雌三醇(estriol，E3)。此外，卵巢也分泌孕激素和少量的雄激素、抑制素[14-15]。

1.2 類固醇激素的作用

糖皮質激素可通過增加新陳代謝產生熱量和免疫反應來保持體內平衡，這在動物新陳代謝中起重要作用[16]，還可有效地降低炎癥細胞的產生和炎癥因子的表達，對于各種機械、化學、病原體和變態(tài)反應等引起的炎癥反應有抑制作用，有較強的抗炎和抗過敏等免疫調節(jié)功能[16-17]，若分泌過量，達到一定程度時，抑制蛋白質合成，加速各種組織中的蛋白質分解代謝率并導致體重減輕[12]。

性腺主要產生配子并分泌激素。雌二醇的水平與雌性動物的發(fā)情、交配、排卵以及妊娠都有一定的關聯性。此外，孕酮在維持其生殖內分泌平衡方面起著重要作用。不僅可抑制妊娠期的再發(fā)情，而且子宮內高濃度的孕酮有利于胚胎的穩(wěn)定，使受精卵正常著床，降低流產率[13，18]。而且，孕酮通過作用于中樞神經系統(tǒng)來穩(wěn)定子宮，抑制催產素的釋放和子宮肌肉的自發(fā)活動[10，15，19]。睪酮的主要功能是促進雄性動物生殖器官的發(fā)育，維持雄性動物第二性征和功能，促進精子的形成、發(fā)育成熟，并阻止生精細胞凋亡[14-15]。目前關于野生動物性激素的研究，主要是睪酮、孕酮和雌二醇。

2 類固醇激素的非損傷性測定及其在動物中的研究應用

2.1 類固醇激素的非損傷性測定

非損傷性取樣(Noninvasive sampling)通過收集唾液、尿液、糞便、毛發(fā)、脫落羽毛、卵殼和鱗片等樣品，無需捕捉，對動物正常生活干擾低的情況下來研究類固醇激素代謝物含量的變化及野生動物的行為[20-21]。在唾液中，糖皮質激素產生的變化可以在數分鐘甚至數秒鐘檢測到，非常適合監(jiān)測激素的短期變化[22]。相比之下，糞便和尿液可以反映數小時甚至數天激素的分泌狀況。但是如果樣品無法定期收集，可通過測量毛發(fā)樣本中激素水平，毛發(fā)緩慢增長意味著可測量數周甚至數月的激素含量，非常適合監(jiān)測激素的長期變化[23]。總之，各種方法有著各自的優(yōu)缺點，哪種方法監(jiān)測動物類固醇激素代謝物含量的變化，不僅取決于研究的便利性，而且還取決于與研究問題相關的其他考慮因素(表1)。

2.2 類固醇激素非損傷性測定的研究應用

2.2.1 唾液類固醇激素 相對于其它三種非損傷性采樣方法，收集唾液研究野生動物類固醇激素的變化受到多方面條件的限制，具有很強的挑戰(zhàn)性。關于唾液類固醇激素的研究主要在一些馴養(yǎng)動物以及圈養(yǎng)動物，通過檢測不同外界環(huán)境影響下的唾液類固醇激素的水平，以此說明機體精神和身體上受到的壓力。例如，可通過分析馬唾液皮質醇濃度評估馬對潛在壓力的反應，研究表明在馬術訓練中，幾乎每一個訓練項目，即應激源都與唾液皮質醇濃度的增加有關[33-35]。

同血液皮質醇一樣，馬的唾液皮質醇濃度很好地反映了皮質醇釋放的晝夜節(jié)律性[36]。即使在相同環(huán)境下，唾液皮質醇易受到動物生殖狀況以及個體性別的影響。例如，Aurich等[37]研究表明，在繁殖季節(jié)4月和5月，去勢馬的唾液皮質醇濃度分別為1.3和0.9 ng/mL，而種馬的皮質醇濃度顯著提高，分別達到2.1和2.6 ng/mL。對于圈養(yǎng)動物來說，唾液非常適合監(jiān)測動物短期類固醇激素的變化，有利于隨時了解動物的生存狀態(tài)，并對動物進行管理。例如，朱洪龍等[26]研究了斷奶仔豬在不同飼養(yǎng)和管理方式下的唾液皮質醇水平，以改善斷奶仔豬的福利。

2.2.2 尿液類固醇激素 一般來說，從自由生活的物種中收集尿液極其困難，除了一些熊科動物及樹棲靈長目類動物。劉德成等[38]研究表明，雌性黑熊(Ursusthibetanus)在發(fā)情前后尿液中雌二醇含量均有一定程度的波動，發(fā)情期雌二醇含量為(0.053±0.037 ng/mg Cr)，與發(fā)情后期雌二醇(0.012±0.012 ng/mg Cr)以及發(fā)情間期均值(0.014±0.010 ng/mg Cr)相比差異極顯著，與發(fā)情前期(0.026±0.023 ng/mg Cr)相比差異顯著，發(fā)情前期與發(fā)情后期差異顯著。對于同一物種，鄭程莉等[39]測量了6頭圈養(yǎng)雌性黑熊在妊娠中后期連續(xù)2個月尿液孕酮含量的變化，以指導妊娠期黑熊的圈養(yǎng)。其中試驗組3頭圈養(yǎng)繁殖母熊孕酮最高達39.54 ng/mL，最低值為2.45 ng/mL，在11月可達10 ng/mL以上，而對照組3頭取膽母熊孕酮含量最高值32.62 ng/mL，最低值0.05 ng/mL，孕酮含量在11月和12月均在10 ng/mL以下。相比于繁殖母熊，3頭取膽母熊孕酮顯著低于試驗組，且呈現無規(guī)律的變化。這些研究對于了解種群中個體發(fā)育期間的變化、生殖、營養(yǎng)狀況、福利和保護等都起重要的指示作用。

對于一些樹棲靈長目類動物的研究，潘昌濱[40]通過分析白掌長臂猿(Hylobateslarvestitus)和戴帽長臂猿(Hylobatespileatus)尿中的類固醇激素濃度，建立激素濃度折線圖計算其生殖周期，通過尿中孕酮折線圖分析出它們的妊娠期都為195 d，而通過尿中雌二醇葡糖苷酸濃度圖得出其妊娠期分別為192 d和197 d。Jaeggi等[41]研究表明，紅尾猴在群間交配(IGEs)過程中，早期收集的樣本皮質醇的變化更為明顯，后期收集的樣本睪酮的變化更為明顯。這些研究對于評估不同靈長目類動物的行為、生殖、社交和適應性等都起到重要的指導性作用。關于尿液類固醇激素保存的研究，陳浩春等[42]發(fā)現即使對同一物種，不同類型的尿液類固醇激素保存時效性也不同。例如，在4 ℃時，雄性川金絲猴尿液睪酮、雌性尿液睪酮、孕酮的保存時效為7 d左右，雌性尿液雌二醇的保存時效在3 d以內。由此可見，尿液的保存方法也是前期研究中需重視的一部分，對于后期的結果分析起到決定性的作用。

2.2.3 糞便類固醇激素 糞便非損傷性方法已廣泛應用于動物激素與行為相關性、壓力與動物福利、繁殖生理、生態(tài)生理、行為生態(tài)學、保護生物學以及生物醫(yī)學等相關方面的研究中[5]。在20世紀70年代末開始使用非侵入性測量糞便類固醇代謝物的方法來評估鳥類[43]的內分泌狀況，隨后被用于越來越多的物種，包括哺乳動物(虎[44-45]、靈長目類動物[46-47]、大熊貓[48]、犀牛[49]、熊[50])、鳥類[51-52]、爬行動物[53]等。因此在過去的20多年里，糞便中類固醇激素代謝物的研究已是一種廣泛接受的技術。

Dantzer[54]等強調了內在的因素(如性、生殖狀況、年齡、最近的經歷)和生態(tài)因素(如捕食、食物供應、降雪)，以及它們自身或與人為干擾的相互作用，都會影響生理應激反應。在一定程度上，自由生活的動物體內糖皮質激素的增加能提高其生存和繁殖能力。Newell-Fugate等[55]發(fā)現雄性野狗和雌性野狗糞便中雄激素和雌激素呈現季節(jié)性的變化，糞便中的雄激素在初夏(246.4±14.5 ng/g)顯著高于初冬(218.6±13.4 ng/g)，在夏季和冬季，雌性野狗季節(jié)性地交配。Scarlata等[56]可通過研究瀕危侏儒兔(NetherlandDwarf)不同的繁殖季節(jié)中糞便類固醇激素的分泌狀況，以制定合適的管理策略來監(jiān)測動物福利和增加繁殖。Abaigar等[57]表明，盡管物種是特異性的，但是季節(jié)是影響不同哺乳動物類固醇激素變化的主要因素，干旱季節(jié)導致激素代謝物濃度顯著升高，而潮濕季節(jié)使激素代謝物濃度顯著降低?？梢?，溫血動物生活在季節(jié)性變化的環(huán)境中面臨著保持高體溫和食物可利用性的能源危機挑戰(zhàn)中，其機體在生命周期中發(fā)生一系列的生理和代謝變化，以適應生存環(huán)境的改變。

即使同一物種不同年齡、性別和任何生活史階段等都可能導致激素代謝物濃度的差異。例如，Seraphin等[58]發(fā)現年齡對雄性黑猩猩的糖皮質激素和雄激素的產生有顯著影響。Valenzuela-Molina等[59]發(fā)現懷孕的雌性藍鯨平均糞便孕酮代謝物濃度為1292.6415.6 ng高于未孕和哺乳期的雌性藍鯨(分別為14.03.7 ng和23.05.4 ng)。畢溫磊[1]發(fā)現不同年齡和性別的大熊貓個體間，呈現年齡越小則變化越明顯，說明環(huán)境變化可能是引起其皮質醇變化的原因之一，即年齡越小這種環(huán)境引起的應激性越明顯。

此外，一定程度上，動物的棲息地受到干擾影響其覓食和生殖，增加了動物的生理應激反應，這些累積效應可能成為限制動物生產力的因素。例如，郭彥嬌[13]發(fā)現觀賞籠內朱鹮(Nipponianippon)糞便中皮質酮水平與當日游客量存在顯著相關性(r=0.853)，說明游客量影響了朱鹮的應激性。王菊霞[60]研究表明不同天敵的糞便氣味對高原鼠兔糞便中的皮質酮、皮質醇和孕酮濃度均有不同程度的影響，其中，不同天敵的糞便氣味對皮質酮的含量呈現顯著的二次函數關系(R2≥0.756)，皮質醇含量隨著處理時間的延長呈顯著的正相關(R2≥0.4959)，孕酮濃度隨著處理時間的增加而下降，二者間表現出顯著的負相關關系(R2≥0.6913)。

2.2.4 毛發(fā)類固醇激素 相較于其他三種類固醇激素的研究，毛發(fā)皮質醇激素的研究起步較晚，最早研究毛發(fā)皮質醇激素的是Koren等[61]在野生蹄兔上的研究，相對于國外來說，毛發(fā)皮質醇激素在國內野生動物上的研究相對來說比較欠缺。在動物上的研究有獼猴[62]以及嚙齒類動物[63]，其重點主要是在方法驗證上。大多數野生動物和家養(yǎng)動物的研究只測量了毛發(fā)中的皮質醇，而對其他類固醇激素，如睪酮，雌二醇，孕酮等指標的測定幾乎沒有，而這些指標的測定可提供動物生殖生態(tài)學的相關信息。

盡管國外關于毛發(fā)皮質醇激素的研究相對來說比較多，但目前為止，毛發(fā)皮質醇激素的研究仍處于不成熟的階段，許多可變因素的影響有待于進一步研究。最有爭議的是毛發(fā)皮質醇激素濃度是否隨著毛發(fā)的生長而變化，Kirschbaum等[64]研究表明，在長度為18 cm的毛發(fā)，從頭皮到發(fā)梢的位置，每3 cm為一個片段，從一個片段到下一個片段，平均皮質醇水平下降30%～40%，毛發(fā)皮質醇濃度顯著降低。而同樣的研究在恒河猴中，近端(111.9±10.6 pg/mg)和遠端(108.6±10.4 pg/mg)的皮質醇濃度差異不顯著[65]。此外，自然發(fā)色對皮質醇濃度的影響也最有爭議性，Bennett等[66]研究表明黑狗比非黑狗的毛發(fā)皮質醇濃度低，發(fā)現毛發(fā)顏色和皮質醇濃度之間有一定的關系(r=0.47，P=0.001)。而同樣的研究，深色毛發(fā)比淺色毛發(fā)熊的皮質醇含量高[67]。因此，黑色素是否對毛發(fā)皮質醇激素是否有影響有待進一步研究。

毛發(fā)皮質醇濃度在許多物種上與采樣部位有關，突出顯示了毛發(fā)取樣位置標準的重要性。例如，Ashley等[68]通過采集馴鹿身上3個位置的毛發(fā)，其結果表明肩部和臀部毛中的皮質醇濃度顯著高于頸部。而Terwissen等[69]發(fā)現，山貓毛發(fā)皮質醇在年齡和性別之間沒有變化，但在腳和腿部不同區(qū)域的變化比個體之間的變化更大。這些研究進一步說明從陷阱或巢穴中隨機收集毛發(fā)存在一定的問題。

目前，毛發(fā)皮質醇已經廣泛用于檢測野生動物皮質醇水平的非侵入性測量，并從多方面評估動物對不同壓力的響應狀況，如人為干擾、季節(jié)性、性別、年齡等影響因素。Roth等[70]通過研究幾周和幾個月內人類的相互作用對狗皮質醇水平的影響，反映狗在長期活動過程中受到的壓力。Comin等[71]研究表明奶牛由冬季室內到夏季放牧條件下，在夏季開始放牧7 d的毛發(fā)皮質醇濃度為(2.1±0.10 pg/mg)，放牧40 d毛發(fā)皮質醇濃度為(2.9±0.17 pg/mg)，毛發(fā)皮質醇的上升可以說明動物對環(huán)境變化的內分泌反應。Bechsh?ft等[72]研究表明，雌性北極熊的毛發(fā)皮質醇平均濃度高于雄性(雌性11.0 pg/mg，雄性7.3 pg/mg)，但皮質醇濃度與年齡或采樣年份之間沒有顯著相關性。Faustini等[73]研究表明，馬駒在30日齡時平均毛發(fā)皮質醇濃度一般為35.17 pg/mg，顯著低于出生時期平均毛發(fā)皮質醇濃度60.37 pg/mg。

3 展 望

目前，國內外對類固醇激素水平的研究主要利用動物糞便，在一定程度具有便利性，但糞便中的類固醇激素是類固醇激素代謝物，而且不同物種滯后時間不同，這樣使得不同研究結果沒有對比性。對于圈養(yǎng)動物或一些樹棲靈長目動物來說，利用唾液或尿液來研究類固醇激素的水平有一定的優(yōu)勢，但對于野生動物而言存在諸多限制。與其他非侵入性測量法相比，毛發(fā)樣品中類固醇激素在毛發(fā)中保持完整，有助于分析。此外，毛發(fā)樣品可以在室溫下放置幾個月甚至幾年不降解，它不僅適合監(jiān)測動物受到的長期壓力，而且可以有效了解動物的生理病理過程，并隨時對動物進行健康管理。

通過以上類固醇激素非損傷測定的研究應用可以得出，相較于野生珍稀動物，對家養(yǎng)動物的研究甚少。家畜的養(yǎng)殖朝著規(guī)?；⒓s化的舍飼養(yǎng)殖方向發(fā)展，雖然這種養(yǎng)殖方式具有不受限于天氣條件、易于管理、減少對生態(tài)環(huán)境破壞的優(yōu)點，但是舍飼家畜在生存過程中不僅要面對一系列的被動處境，包括食物短缺、水源匱乏、環(huán)境條件等，還要克服爭奪食物、競爭生存空間、運輸等的壓力。因此養(yǎng)殖中動物福利越來越受到人們的關注。對不同的家畜選擇合適的非損傷性測定方法，通過持續(xù)監(jiān)測不同環(huán)境、不同生殖階段以及不同性別家畜機體類固醇激素的變化，對不同生活階段的家畜提供健康合理的管理措施，將在推動動物福利的過程中獲取良好的生產效益。