徐 俊 戚 璐 程良斌 張譽丹 許 杰 樓汪洲洋

湖北中醫(yī)藥大學(xué)2018級博士研究生班 (湖北 武漢， 430065)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種主要累及肝內(nèi)小膽管,造成膽汁淤積,引起肝臟炎癥反應(yīng)的自身免疫性肝病[1]。病情發(fā)展，逐漸步入肝纖維化、肝硬化，最終導(dǎo)致肝臟衰竭[2]。其病因尚不明確，目前研究認(rèn)為與分子細(xì)胞免疫學(xué)、家族遺傳易感性及膽汁酸的合成、分泌、轉(zhuǎn)運障礙等相關(guān)[3]。PBC治療的重點是抑制異常免疫反應(yīng)，減輕淤積膽汁的毒性作用。目前臨床尚缺乏特異性高、療效好、副作用小的治療藥物[4]。中醫(yī)藥在治療PBC等膽汁淤積性肝病(黃疸病)方面有著悠久的歷史，具有特色優(yōu)勢。青黛為爵床科Acanthaceae植物馬藍(lán)、蓼科Polygonaceae植物蓼藍(lán)、十字花科Brassicaceae植物菘藍(lán)的葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末、團(tuán)塊或顆粒[5]。具有清熱解毒、涼血消斑，瀉火定驚等作用[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性的特點，與中醫(yī)辨證論治的整體思想不謀而合。為了進(jìn)一步詮釋中藥青黛活性成分和作用靶點、闡明防治PBC作用機制、發(fā)現(xiàn)中藥組效關(guān)系、優(yōu)化復(fù)方和尋找新藥，筆者以青黛為對象，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建青黛“成分-靶點-通路-機制-PBC”網(wǎng)絡(luò)，闡述青黛防治PBC多成分、多靶點和多通路的特點，為拓寬青黛臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)；人類孟德爾遺傳(OMIM)數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)；Pubmed數(shù)據(jù)庫(http://pubmed.cn)；TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)； UltraEdit軟件；Cytoscape3.7.1 軟件；string數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)；Bioconductor數(shù)據(jù)庫(http://http://bioconductor.org)；R軟件；Perl軟件。

1.2 方法

1.2.1 青黛化學(xué)成分收集 TCMSP數(shù)據(jù)庫可以用于有效成分鑒定、藥物靶點篩選和化合物靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建[7]?；跀?shù)據(jù)庫樣本數(shù)據(jù)復(fù)雜性與TCMSP用戶指南，以口服生物利用度(OB)≥30%[8]，藥物相似性(DL)≥0.18[9]為篩選條件，檢索出青黛的有效化合物和關(guān)鍵靶點信息。

1.2.2 PBC靶蛋白的收集及前處理 打開GeneCards數(shù)據(jù)庫，keywords中輸入primary biliary cirrhosis進(jìn)行檢索，所得信息輸出為Excel；打開OMIM數(shù)據(jù)庫，在Advanced Search一欄中選GeneMap，再檢索primary biliary cirrhosis，待搜索完畢，download為Excel格式

1.2.3 青黛-PBC靶蛋白交集的整理 整理出青黛的潛在靶蛋白與PBC相關(guān)靶蛋白，分別形成drug.txt和disease.txt兩個文件，在R軟件中安裝“VennDiagram”數(shù)據(jù)包，用UltraEdit軟件編寫整理出靶蛋白交集的腳本，在R中運行，輸出靶蛋白交集，為drug.disease.txt，并構(gòu)成Venn圖。

1.2.4 青黛“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI network)的構(gòu)建與評估 根據(jù)中藥成分、靶點之間的關(guān)系，建立活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，采用 Cytoscape 3.7.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，并在R中用barplot函數(shù)繪制核心蛋白靶點的柱狀圖。根據(jù)1.2.3中得到的drug.disease.txt，檢索string數(shù)據(jù)庫，在Multiple proteins右邊輸入所有靶蛋白，在Organism下方選擇Homo sapiens進(jìn)行搜索，隱去孤立的蛋白靶點，以minimum required interaction score=0.4為評判標(biāo)準(zhǔn)，從而得到青黛防治PBC關(guān)鍵靶點之間的相互作用關(guān)系。

1.2.5 對關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析 根據(jù)1.2.3中得到的drug.disease.txt，在Bioconductor中找到“DOSE”、“clusterProfiler”、“pathview”3個安裝包，在R中運行安裝。之后用UltraEdit編輯運行GO和KEGG的腳本，在R中運行，得到GO分析散點圖和數(shù)據(jù)結(jié)果，得到KEGG的柱狀圖、通路圖和相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 青黛的化學(xué)成分檢索情況 見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到青黛化合物29個。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，篩選得到青黛活性化學(xué)成分9種。

表1 青黛的主要化學(xué)成分

2.2 青黛-PBC靶點交集 見圖1。檢索青黛相關(guān)靶點共208個，排除重復(fù)靶點和與9種有效成分無關(guān)靶點后，得到48個。經(jīng)GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索，與PBC相關(guān)靶點共有2050個,經(jīng)OMIM檢索，與PBC相關(guān)靶點有27個。兩個數(shù)據(jù)庫靶點匯合，排除重復(fù)靶點，共得到2069個靶點。通過在線Venn圖得到藥物和疾病共同的靶點32個，即青黛防治PBC的關(guān)鍵靶點。

圖1 青黛-PBC靶點交集Venn圖

2.3 青黛“成分-靶蛋白-通路”網(wǎng)絡(luò)與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)建立

2.3.1 化合物-靶蛋白網(wǎng)絡(luò) 見插頁圖2。運用Cytoscape3.7.1將青黛及其主要化學(xué)成分、關(guān)鍵靶蛋白與疾病關(guān)系可視化。如插頁圖2所示，紅色為疾病(PBC)，綠色為青黛中藥名，黃色為青黛主要化學(xué)成分，藍(lán)色為關(guān)鍵靶點。

2.3.2 PPI網(wǎng)絡(luò) 見圖3。查詢String數(shù)據(jù)庫，將32個關(guān)鍵靶點蛋白進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，其中JUN、CASP3、PTGS20、GELA等靶點與較多的其他靶點相關(guān)聯(lián)，為核心靶點。

圖3 青黛防治PBC靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO分析結(jié)果 見插頁圖4。GO主要是進(jìn)行靶蛋白功能分析。通過運算，與關(guān)鍵靶蛋白相關(guān)功能共有69種。根據(jù)相關(guān)性分析，青黛防治PBC主要是通過影響機體的核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性等而發(fā)揮作用。如插頁圖4所示，點狀圖顏色越紅，點越大，相關(guān)性越高。

2.5 KEGG分析結(jié)果 見插頁圖5。通過關(guān)鍵蛋白在Bioconductor數(shù)據(jù)庫中，找到與之相關(guān)通路109條，根據(jù)通路中所含關(guān)鍵靶蛋白數(shù)目和相關(guān)性評分，排名前20條通路為青黛防治PBC的關(guān)鍵通路，如插頁圖5所示，柱狀圖顏色越紅，說明相關(guān)性越高。青黛防治PBC涉及IL-17信號通路、小細(xì)胞肺癌、乙型肝炎、弓形蟲病、人巨細(xì)胞病毒感染、甲型流感、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、Epstein-Barr病毒感染、Chagas病(美國錐蟲病)、人免疫缺陷病毒I感染、丙型肝炎、TNF信號通路、肺結(jié)核、凋亡、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、Th17細(xì)胞分化、凋亡-多物種、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路。其中IL-17信號通路為重要通路。

3 討論

目前PBC發(fā)病機制尚未明確，臨床治療存在一定難度。熊去氧膽酸(UDCA)是唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療PBC的藥物[10]，早期應(yīng)用可改善PBC患者的生化指標(biāo)，長期服用可延緩疾病進(jìn)展，并可減少肝硬化的發(fā)生，提高患者生存率[11]。但對于UDCA治療是否可以延緩組織病理學(xué)進(jìn)展尚有爭議[12]，并出現(xiàn)了UDCA應(yīng)答不佳和治療不耐受的情況[13]。基于中醫(yī)理論和臨床實踐，PBC病情進(jìn)展的中醫(yī)病機可概括為氣滯→痰凝→血瘀→水停[14]。青黛具有清熱解毒，清肝瀉火，涼血止血功效，又有消痰散腫之長，契合PBC病機?，F(xiàn)代藥理研究證實青黛具有保肝、抗腫瘤、抗菌及類激素樣作用[15]。

IL-17是Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子，參與炎性、腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[16，17]。在機體出現(xiàn)感染或創(chuàng)傷的早期，Th17可以有效介導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化效應(yīng)，參與阻止機體感染加重與組織壞死[18]。IL-17能抵抗多種病原體的感染，誘導(dǎo)分泌相關(guān)細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，IL-17還可通過放大共刺激分子如細(xì)胞黏附分子的誘導(dǎo)作用，協(xié)同刺激T細(xì)胞的活化，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中起橋梁作用[19，20]。研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)中、小膽管上皮細(xì)胞能表達(dá)IL-17受體，可與IL-17結(jié)合誘導(dǎo)膽管細(xì)胞分泌纖維化細(xì)胞因子IL-lβ、IL-6、IL-23等，促進(jìn)肝臟慢性纖維化，在PBC患者肝硬化的發(fā)生機制中起著重要的作用[21]。也有研究表明，在PBC患者膽管上皮細(xì)胞表達(dá)IL-17受體，與IL-17結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生更多炎癥因子，如 IL-6、IL-1β 和 IL-23[22，23];Th17、Treg及相應(yīng)細(xì)胞因子的異常參與自身免疫耐受的打破，導(dǎo)致肝臟內(nèi)的膽管上皮細(xì)胞破壞。同時，相關(guān)研究也證實了在 PBC 患者中，Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和 IL-23 明顯增加[24]，并且容易出現(xiàn)Th17 分化和反向Treg分化[25]。

此次研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對青黛藥效成分進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測和通路分析，通過建立藥效成分-靶點通路網(wǎng)絡(luò)圖，多角度探索青黛防治PBC潛在的作用機制，發(fā)現(xiàn)青黛中10h-吲哚[3,2-b]喹啉衍生物、糖苷等8個藥效成分可能通過抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少炎癥反應(yīng)等機制發(fā)揮抗PBC作用，為其后續(xù)臨床試驗療效評價指標(biāo)的篩選提供依據(jù)和方向。同時，對于文獻(xiàn)中證明有治療PBC作用的部分化合物，此次研究并未篩選得到，說明實驗方法還存在一些局限性，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果仍需要后續(xù)實驗的驗證與支持，并不斷完善。