李曉玲 孫鳳霞 朱 達(dá) 徐 萌 羅明理 王傲然

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院感染科 (北京, 100010)

膽汁淤積是由于各種原因造成膽汁形成、分泌和排泄障礙，膽汁流進(jìn)十二指腸受阻，進(jìn)而流入血液的一種病理狀態(tài)，臨床有瘙癢、乏力、尿色加深、黃疸等癥狀，早期可無明顯癥狀，僅表現(xiàn)為ALP和GGT水平升高，病情進(jìn)展后可出現(xiàn)高膽紅素血癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝衰竭甚至死亡[1]。核因子κB(NF-κB)、早期生長反應(yīng)因子(Egr-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)和維甲酸X受體α(RXRα)的差異表達(dá)和調(diào)控對(duì)于膽汁淤積的發(fā)病及治療起著至關(guān)重要的作用[2-5]。膽汁淤積歸屬于中醫(yī)學(xué)“黃疸”范疇，復(fù)方茵丹湯由茵陳蒿湯加減化裁而來，具有清熱化濕、涼血活血的功效。我們?cè)谇捌谕ㄟ^體外異硫氰酸-α-萘酯誘導(dǎo)急性肝內(nèi)膽汁淤積(AIC)大鼠動(dòng)物模型，復(fù)方茵丹湯能夠顯著降低AIC大鼠AST、ALT、GGT、ALP、TBA水平，通過調(diào)控ICAM-1、Egr-1和MRP2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平來減輕膽汁淤積[6-8]。本研究采用體外實(shí)驗(yàn)探討復(fù)方茵丹湯對(duì)NF-κB、ICAM-1、Egr-1基因沉默HepG2 細(xì)胞中MRP2及其核受體RXRα的基因和蛋白表達(dá)水平的影響，以期闡明復(fù)方茵丹湯治療膽汁淤積的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器 人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞購自北京市理化分析測試中心。MTT、1640培養(yǎng)基(No.11875093)購自Gibco公司；大鼠NF-κB、ICAM-1、Egr-1的siRNA基因套裝購自Invitrogen公司；Trizol試劑(DP405-02)購自北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒(RR047B)購自TaKaRa公司，NF-κB抗體(111035003)、ICAM-1抗體(115035003)、Egr-1抗體(REK0005)購自Jackson公司，MRP2抗體(PA5-23653)、RXRα抗體(PA5-29165)購自Thermo公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(ZB2306)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PageRuler Prestained Protein Ladder(SM0671)購自Fermentas公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒(300000-B)購自北京賽馳生物科技有限公司，eECL Western Blot Kit高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(CW0049)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。低溫高速離心機(jī)(日立，CF16RXⅡ)，DYY-6C型電泳儀，全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(Thermofisher)，BIO-RAD Mini-TRANS-BLOT CELL，DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳槽，TS-1 脫色搖床(太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，生物分子成像儀(日本富士LAS-4000 MINI)。

1.2 藥品 復(fù)方茵丹湯由茵陳30 g，大黃10 g，梔子、生地黃、白術(shù)、茯苓各15 g，赤芍12 g，牡丹皮9 g組成，方中藥物劑量為70 kg 成人一日用量；所有藥物均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房統(tǒng)一采購，由北京市衛(wèi)生局臨床藥學(xué)研究所煎制成生藥含量為2.448 g/ml的藥液。熊去氧膽酸膠囊(UDCA，商品名：優(yōu)思弗)，德國Losan Pharma GmbH公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前24 h換用無血清培養(yǎng)基過夜。

1.3.2 復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率測定 細(xì)胞按常規(guī)消化終止后用生長培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，按100 μl/孔鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后分別更換為含不同濃度復(fù)方茵丹湯(20%、10%、5%、2.5%、1.25%)培養(yǎng)基采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，藥物作用24 h后棄掉細(xì)胞原培養(yǎng)基，加入含10 μl MTT溶液的1640培養(yǎng)基100 μl，37℃孵育4 h后棄掉MTT反應(yīng)液，用10% SDS 充分溶解結(jié)晶，讀取570 nm吸光值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。選擇增殖抑制率小于10%的藥物濃度作為最大無毒濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞分組與給藥 細(xì)胞按常規(guī)消化終止后用生長培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，按10 ml/皿鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿(直徑100 mm)，并分為空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞)、復(fù)方茵丹湯組、UDCA組、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+復(fù)方茵丹湯組。待細(xì)胞生長密度達(dá)到60%～70%時(shí)，用2%低血清培養(yǎng)液饑餓處理12 h，空白對(duì)照組細(xì)胞加入終濃度為0.1% 的二甲基亞砜(DMSO)，復(fù)方茵丹湯組細(xì)胞加入含2%復(fù)方茵丹湯的培養(yǎng)基，UDCA組細(xì)胞加入終濃度為100 mol/L(含DMSO 0.1%) 的UDCA，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞加入siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1，轉(zhuǎn)染+復(fù)方茵丹湯組細(xì)胞加入siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1和含2%復(fù)方茵丹湯的培養(yǎng)基。

1.3.4 Real-time PCR檢測復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα基因的影響 按Trizol試劑說明書方法提取HepG2細(xì)胞總RNA，按Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光定量PCR檢測按 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃、50℃、72℃ 30s，72℃延伸7min，30個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western blot檢測復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα蛋白的影響 參照文獻(xiàn)[9]提取細(xì)胞總蛋白和核蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。每個(gè)樣本上樣總量為20 μg，蛋白質(zhì)預(yù)染Marker上樣量為7 μl。核蛋白30 μl、總蛋白50 μl用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5% 脫脂奶粉溶液(TBST)室溫振搖封閉2 h，然后加入NF-κB一抗(1∶300)、ICAM-1一抗(1∶2 000)、Egr-1一抗(1∶1 000)、MRP2一抗(1∶500)、RXRα一抗(1∶2 000)、GAPDH一抗(1∶800)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入相應(yīng)二抗(1∶1 000)室溫振搖反應(yīng)1 h，TBST洗膜5 min×4次。加入化學(xué)發(fā)光試劑，經(jīng)顯影、定影后，膠片進(jìn)行掃描，用Quantity One圖像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的凈光密度值。

1.3.6 Real-time PCR和Western blot檢測復(fù)方茵丹湯對(duì)siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中MRP2和RXRα基因和蛋白水平的影響 siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1引物購自Invitrogen公司，序列見表2。按照1.3.5和1.3.6方法檢測siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中MRP2和RXRα基因及蛋白表達(dá)水平檢測。

表2 siRNA序列信息

2 結(jié)果

2.1 不同濃度復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞的生長抑制作用 20%復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞的生長抑制率為(71.62±0.04)%，10%復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞的生長抑制率為(73.64±0.04)%，5%復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞的生長抑制率為(15.50±0.06)%，2.5%復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞的生長抑制率為(3.80±0.05)%，1.25%復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞的生長抑制率為(3.18±0.04)%，因此選擇2%復(fù)方茵丹湯進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα基因和蛋白水平的影響 與空白對(duì)照組比較，復(fù)方茵丹湯組和UDCA組NF-κB、ICAM-1、Egr-1基因和蛋白水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)，MRP2和RXRα基因和蛋白水平明顯升高(P<0.01，P<0.05)，復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα表達(dá)的誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于UDCA組(P<0.01，P<0.05)。見表3、表4和圖1。

表3 各組HepG2細(xì)胞基因相對(duì)表達(dá)量變化

表4 各組HepG2細(xì)胞蛋白相對(duì)表達(dá)量變化

空白對(duì)照組 復(fù)方茵丹湯組 UDCA組圖1 復(fù)方茵丹湯影響HepG2細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3 復(fù)方茵丹湯對(duì)siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中MRP2和RXRα基因和蛋白水平的影響

見表5、表6和圖2。

表5 復(fù)方茵丹湯對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα對(duì)表達(dá)量的影響

表6 復(fù)方茵丹湯對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

圖3 復(fù)方茵丹湯影響siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

ICAM-1是存在于細(xì)胞表面的一類具有復(fù)雜功能的糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞間的相互黏附、參與眾多的生理、病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，膽汁淤積時(shí)，野生小鼠的靜脈竇、門靜脈和肝細(xì)胞可以觀察到ICAM-1表達(dá)的增加[10]，其發(fā)生機(jī)制可能是膽紅素和膽鹽通過活化Kupffer細(xì)胞，活化的Kupffer細(xì)胞進(jìn)一步釋放IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)，最終誘導(dǎo)ICAM-1表達(dá)上調(diào)[11]。NF-κB和Egr-1是一種對(duì)膽汁淤積的炎癥和損傷有重要意義的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于體內(nèi)，參與多種靶基因的表達(dá)調(diào)控，如細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子、生長因子、某些急性期反應(yīng)蛋白以及參與免疫識(shí)別的受體和抗原遞呈的蛋白質(zhì)等，大多數(shù)均參與宿主的免疫和炎癥反應(yīng)[12]，是早期炎性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究顯示NF-κB和Egr-1是膽管結(jié)扎所致梗阻性膽汁淤積過程中肝細(xì)胞損傷的重要啟動(dòng)因子[13]，膽管結(jié)扎致膽汁淤積后,膽汁酸濃度升高,通過激活表皮生長因子受體(EGFR)而上調(diào)肝細(xì)胞中NF-κB和Egr-1，NF-κB和Egr-1通過直接或間接作用增加促炎介質(zhì)ICAM-1的表達(dá)，從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在肝臟聚集、活化而損害肝細(xì)胞。肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞攝取和分泌膽汁成分的功能，依賴細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子中，參與膽紅素排泄的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要為MRP2[14]。研究表明，MRP2在肝細(xì)胞膜的毛細(xì)膽管面上表達(dá)水平最高，其生理功能是將葡萄糖醛酸結(jié)合型膽紅素及其他雙親性雙價(jià)陰離子主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外[15]。RXRα是肝細(xì)胞細(xì)胞核激素受體(NHR)超家族中的重要一員，作為一種可被配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在全身各處均有表達(dá)，RXRα參與了調(diào)控膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。膽汁淤積時(shí)，RXRα作為配體與其他多種核受體結(jié)合形成異二聚體，間接調(diào)控膽汁酸的排泄[16]。RXRα可以與其伙伴核受體FXR、CAR等結(jié)合形成異源二聚體，參與MRP2 mRNA轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控[17]。研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、Egr-1及其靶基因炎癥因子ICAM-1共同參與了肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2及其核受體RXRα基因的表達(dá)調(diào)控[18]。

HepG2細(xì)胞是一種極性化細(xì)胞，易于培養(yǎng)，可縮短實(shí)驗(yàn)周期，體外實(shí)驗(yàn)中常選用其代替原代細(xì)胞[5]，因此，本研究選用HepG2細(xì)胞系利用siRNA轉(zhuǎn)染沉默NF-κB、ICAM-1、Egr-1的技術(shù)，觀察復(fù)方茵丹湯對(duì)HepG2細(xì)胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1的沉默與否，其下游的靶基因MRP2和核受體RXRα的表達(dá)，及其編碼的靶蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方茵丹湯能顯著降低siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1和siRNA-Egr-1轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1基因和蛋白的表達(dá)水平，提高siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1和siRNA-Egr-1轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2和核受體RXRα mRNA和蛋白水平的表達(dá)。復(fù)方茵丹湯可在細(xì)胞水平上調(diào)肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP2及其核受體RXRα mRNA和蛋白水平的表達(dá)，NF-κB、ICAM-1、Egr-1參與了這一調(diào)控過程。復(fù)方茵丹湯是否還通過其他途徑減輕膽汁淤積仍有待深層次的研究。