楊超 高嘉悅 許崇龍

摘要：腫瘤的易轉(zhuǎn)移性與死亡率密切相關(guān)，但目前對其轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制研究較少，主要是因?yàn)楫?dāng)前常用的腫瘤體外模型不能充分模擬超微環(huán)境下腫瘤微環(huán)境的三維和異質(zhì)性特征。隨著3D打印技術(shù)和生物材料的發(fā)展，采用3D打印技術(shù)模擬出的腫瘤體外模型已基本接近體內(nèi)腫瘤微環(huán)境。本文主要綜述3D生物打印的材料的方法，及其構(gòu)建異質(zhì)腫瘤微環(huán)境的體外模型應(yīng)用現(xiàn)狀，總結(jié)了3D生物打印技術(shù)在重建腫瘤微環(huán)境中的應(yīng)用和局限性，旨在為臨床制定抗癌策略提供參考。

關(guān)鍵詞：3D生物打印;體外模型;腫瘤微環(huán)境;腫瘤轉(zhuǎn)移

中圖分類號：R730? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.20.009

文章編號：1006-1959（2020）20-0030-04

Research on in Vitro Simulated Tumor Metastasis Model Based on 3D Bioprinting Technology

YANG Chao1，GAO Jia-yue2，XU Chong-long3

（1.Liaoning National Normal College，Shenyang 110032，Liaoning，China;

2.Military Medical Sciences，Beijing 100853，China;

3.Qizhi Technology Shenyang Co.，Ltd.，Shenyang 110032，Liaoning，China）

Abstract：Tumor metastasis is closely related to mortality， but there are currently few studies on the exact mechanism of its metastasis， mainly because the commonly used tumor in vitro models cannot fully simulate the three-dimensional and heterogeneous characteristics of the tumor microenvironment in the ultramicro environment. With the development of 3D printing technology and biomaterials， the tumor in vitro model simulated by 3D printing technology has basically approximated the tumor microenvironment in vivo. This article mainly reviews the methods of 3D bioprinting materials and the application status of in vitro models for the construction of heterogeneous tumor microenvironment. It also summarizes the application and limitations of 3D bioprinting technology in reconstructing the tumor microenvironment， aiming to formulate anti-cancer for the clinic strategy provides reference.

Key words：3D bioprinting;In vitro model;Tumor microenvironment;Tumor metastasis

目前，全球范圍內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率逐年升高，并直接導(dǎo)致死亡率升高，2019年全球約有1808萬新發(fā)病例和956萬死亡病例[1]。腫瘤引起較高死亡率的原因?yàn)槠淦鸩‰[匿、大部分患者就診時(shí)即確診為具有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤，與5年生存期下降直接相關(guān)[2]。盡管2D模型對腫瘤的發(fā)生及發(fā)展帶來了許多重要的發(fā)現(xiàn)，但人們越來越認(rèn)識到3D模型可以概括地模擬出腫瘤生物學(xué)的各個(gè)方面功能，幫助研究者更好地理解腫瘤細(xì)胞在疾病進(jìn)展過程中所處的生物、物理和生化環(huán)境，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞3D遷移、營養(yǎng)和代謝廢物擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)、新血管生成及血管內(nèi)外侵襲等[3，4]，更有助于闡明惡性腫瘤進(jìn)展的潛在機(jī)制，從而提高對治療靶點(diǎn)的識別。據(jù)統(tǒng)計(jì)，未來20年內(nèi)腫瘤發(fā)病率將從2019年的1808萬上升到超過2200萬，死亡率亦將隨之增加[5]，極大地增加了醫(yī)療負(fù)擔(dān)，因此腫瘤治療策略的更新迫在眉睫。本文主要就幾種當(dāng)前用于組織工程的3D打印技術(shù)在重建腫瘤微環(huán)境中的方法進(jìn)行綜述，旨在為抗癌新策略的發(fā)現(xiàn)提供幫助。

1腫瘤微環(huán)境

細(xì)胞微環(huán)境是包圍所有真核細(xì)胞的一種普遍存在的結(jié)構(gòu)特征，其由多種分子組成，在細(xì)胞信號和組織結(jié)構(gòu)中起著不可或缺的作用。對于腫瘤細(xì)胞來說，腫瘤微環(huán)境不是靜態(tài)的，其不僅具有腫瘤組織特異性，并且顯著影響腫瘤細(xì)胞行為，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲行為等[6]。腫瘤細(xì)胞受微環(huán)境的特征影響轉(zhuǎn)移的進(jìn)程，包括腫瘤的機(jī)械刺激、細(xì)胞因子細(xì)胞-基質(zhì)之間相互作用、基質(zhì)中氧以及營養(yǎng)物質(zhì)濃度、代謝廢物和細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)特征[7]。腫瘤細(xì)胞通過與內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌信號傳導(dǎo)來分泌血管內(nèi)皮生長因子和其他促血管生成因子，通過已存在的及新生的血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[8]。腫瘤細(xì)胞滲入血管后，循環(huán)腫瘤細(xì)胞會以某種方式滲入其他類型的組織，以建立腫瘤細(xì)胞的繼發(fā)性集落。因此，抑制新血管生成是體外研究腫瘤轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散的關(guān)鍵。

體外腫瘤模型需要模擬出實(shí)際腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵特征，由于腫瘤擴(kuò)散（相關(guān)因素：細(xì)胞因子、營養(yǎng)素和代謝廢物）和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移（影響因素：腫瘤內(nèi)外侵襲、炎癥細(xì)胞募集）均是動(dòng)態(tài)進(jìn)行的，所以任何轉(zhuǎn)移的體外模型都應(yīng)該是3D的。目前，動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)之間取得的一致性結(jié)果較低，平均僅8%，一致性仍是具有挑戰(zhàn)性的難題[9]，3D體外腫瘤模型將通過概括與疾病類型和階段相匹配的適當(dāng)腫瘤細(xì)胞/基質(zhì)組成和特性，從而精確模擬患者體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，提供準(zhǔn)確的機(jī)制研究以及個(gè)性化抗癌治療藥物篩選的工具。

2 3D 生物打印

3D打印輔以計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)技術(shù)不需要物理模具即可創(chuàng)建內(nèi)部架構(gòu)，因此可作為轉(zhuǎn)換工具，并具有較低的成本、更高的靈活性和效率，可以在微米級甚至納米級上創(chuàng)建復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)。3D 打印已經(jīng)成為一項(xiàng)革命性技術(shù)，其起源可追溯到1984年Charles W. Hull的專利申請[10]，其描述了一種用于通過可光聚合流體的二維截面的重復(fù)圖形化和疊加來構(gòu)建三維物體的系統(tǒng)。3D 打印應(yīng)用程序現(xiàn)在涵蓋了廣泛的領(lǐng)域，包括藝術(shù)、商業(yè)產(chǎn)品設(shè)計(jì)、大規(guī)模工業(yè)制造和建筑，以及最近應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和生物應(yīng)用程序等。

3D 打印技術(shù)是增材制造技術(shù)的一個(gè)子集，增材制造是通過將材料接合到3D模式中而形成物體的過程[11]。通常是通過2D的截面被增量地堆疊起來，形成一個(gè)3D圖案結(jié)構(gòu)。在過去的十年中，3D生物打印應(yīng)用包括工程植入式組織支架[12]以及用于研究腫瘤干細(xì)胞、共培養(yǎng)組織模型和腫瘤微環(huán)境的體外組織支架[13]。對于所有的生物打印應(yīng)用，其目標(biāo)是控制細(xì)胞和生物材料進(jìn)入組織樣結(jié)構(gòu)的模式。生物相容性是3D生物打印設(shè)計(jì)中最重要的考慮因素，這意味著材料、添加材料的方法以及材料的粘附機(jī)制（如熱冷卻和交聯(lián)）必須對細(xì)胞無毒、無害。許多研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)研發(fā)出了完全經(jīng)人工組裝的體外腫瘤3D模型，因此，將其轉(zhuǎn)化為更具可重復(fù)性的增材生物制造平臺的時(shí)機(jī)已經(jīng)成熟[14]。用于3D打印生物材料和細(xì)胞的主要技術(shù)有三種：噴墨生物打印技術(shù)、擠壓生物打印技術(shù)和光輔助生物打印技術(shù)。

3 3D生物打印的材料及方法

3.1生物材料的選擇? 生物材料的選擇是開發(fā)模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的體外微環(huán)境模型的首要考慮因素之一。細(xì)胞與生物材料的相容性和聚合機(jī)制也影響生物材料的選擇，3D生物打印方法的相容性進(jìn)一步限制了可使用的生物材料的類型。目前已經(jīng)開發(fā)了多種生物材料，包括為天然（膠原蛋白，明膠，透明質(zhì)酸等），合成（聚乙二醇、聚異丙基丙烯酰胺等）及天然/合成混合材料，其均可用于通過3D生物打印制造3D體外支架。細(xì)胞侵襲及遷移是所有多細(xì)胞生物的一個(gè)正常過程，體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型越接近體內(nèi)微環(huán)境，越可以準(zhǔn)確地模擬出腫瘤細(xì)胞的行為，但是合成基質(zhì)的機(jī)械性能可以極大地改變腫瘤細(xì)胞行為，包括腫瘤干細(xì)胞分化、侵襲及遷移[15]。 為了使3D打印平臺打印出的體外微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞具有生物相容性，已對非生物材料中應(yīng)用的打印系統(tǒng)和技術(shù)進(jìn)行了修改，合成或改進(jìn)天然材料的剛度可以通過控制聚合反應(yīng)的條件來調(diào)節(jié)，使生物相容性材料最大程度地降低對細(xì)胞活力的任何潛在危害。

3.2基于噴墨和擠壓成型的3D生物打印? 生物打印系統(tǒng)的早期發(fā)展是通過噴墨打印機(jī)來打印細(xì)胞組件，這些組件可以在器官中模擬各自的結(jié)構(gòu)，這是通過修改市售的噴墨打印機(jī)來實(shí)現(xiàn)的，這些噴墨打印機(jī)經(jīng)過改良，可以輸出蛋白質(zhì)或細(xì)胞溶液，而不是墨水[16]。在過去的十年中，噴墨打印系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展使其能夠?qū)τ啥喾N細(xì)胞類型組成的復(fù)雜且多元化的3D組織構(gòu)造進(jìn)行生物打印[17]。

在擠壓和噴墨3D打印中，將生物材料、細(xì)胞和可溶性因子組成的生物墨水選擇性地模壓到表面形成3D支架。使用單一的生物墨水進(jìn)行打印即可以生成具有建筑特色的結(jié)構(gòu)，例如空心通道。擴(kuò)展到兩種或更多種生物墨水聯(lián)用可以在空間上對生物基質(zhì)材料和細(xì)胞進(jìn)行圖案化，從而可以創(chuàng)建具有結(jié)構(gòu)特征性的體外模型。在典型材料擠壓成型技術(shù)的3D打印中，通過擠壓的方式迫使材料以受控的連續(xù)流方式通過噴嘴，將少量生物墨水沉積到平臺上。該物料分配系統(tǒng)可以在x和y方向上自由移動(dòng)，以2D模式將生物墨水物料沉積到支撐平臺上，該平臺同樣還可以在z方向上移動(dòng)，以設(shè)定的順序添加到2D模式基礎(chǔ)上，通過堆積的方式形成3D支架。基于此類擠壓的3D生物打印已被用于制造類似血管的結(jié)構(gòu)。

基于擠壓成型的生物打印系統(tǒng)也得到了廣泛的開發(fā)，以產(chǎn)生具有細(xì)胞樣的生物結(jié)構(gòu)。在首次將噴墨生物打印系統(tǒng)用于細(xì)胞應(yīng)用之后，開發(fā)了一種帶有凝膠沉積工具的機(jī)器人實(shí)現(xiàn)自由成形加工平臺，以逐層沉積預(yù)種子海藻酸鈉-水凝膠，以生產(chǎn)具有任意幾何形狀的三維預(yù)種子活體植入物。目前基于噴墨和擠壓成型的生物打印已經(jīng)用于創(chuàng)建仿生耳朵、肝臟、軟骨和神經(jīng)組織構(gòu)造[18]。

噴墨和擠壓成型的3D生物打印技術(shù)在簡單性、靈活性和低成本方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。但是，這兩種方法也有局限性。首先，由于剪切應(yīng)力和用于輸送生物墨水的噴嘴的孔口直徑小，存在細(xì)胞損傷和死亡以及細(xì)胞沉降和聚集。而且，打印分辨率受到噴嘴的物理?xiàng)l件限制，通常超過50 mm。此外，印刷結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)完整性是另一個(gè)障礙，尤其是在具有液滴和線條的界面上，由于生物材料的限制，特征的打印分辨率僅為200 μm[11，19]。

3.3基于光輔助的3D生物打印? 除了基于噴墨和擠壓成型的3D生物打印外，光輔助生物打印平臺也越來越多地用于細(xì)胞打印和組織工程應(yīng)用。這些主要涉及生物材料的光聚合反應(yīng)，并可以打印出具有良好細(xì)胞生存力的各種細(xì)胞類型。光輔助3D生物打印系統(tǒng)分為兩個(gè)子組：基于DLP的3D生物打印和基于激光的3D生物打印。

基于DLP的3D生物打印機(jī)是應(yīng)用動(dòng)態(tài)光學(xué)投影立體光刻（DOPsL）平臺-利用由大約一百萬個(gè)微鏡組成的數(shù)字微鏡器件芯片，并通過調(diào)制紫外光投射指定的光學(xué)圖案到光聚合物溶液。該打印機(jī)的分辨率取決于每個(gè)微鏡發(fā)出的光束的焦距，該焦距為微米級。與噴基于噴墨和擠壓成型的3D生物打印相比，DLP打印機(jī)通過將光學(xué)圖案的整個(gè)平面投影到光敏聚合物溶液上來并行3D打印，從而顯著減少了制造所需的時(shí)間[20]。通過不斷刷新的光學(xué)圖形投影，并隨著打印對象移動(dòng)界面，可以打印出光滑的3D物體，并且通過消除界面?zhèn)斡?，可以大大提高打印?D對象的機(jī)械完整性。由于這些優(yōu)點(diǎn)，DOPsL系統(tǒng)已被用來創(chuàng)建各種復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)，比如脈管系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)和神經(jīng)元導(dǎo)管[21]。

基于激光的3D生物打印的原理為其中激光束通過高倍物鏡聚焦，在樣品玻片上引發(fā)聚合或材料轉(zhuǎn)移[22]。并結(jié)合樣品臺的三維運(yùn)動(dòng)，可以在亞微米分辨率下制備出復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)，如用成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞替代的全細(xì)胞化的皮膚。

盡管光輔助3D生物打印具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如良好的生物相容性，高分辨率和高效率，但仍然存在一些需要解決的問題。首先，光輔助印刷的材料選擇僅限于光敏聚合物，這會限制許多生物材料的使用，并且需要進(jìn)行其他的化學(xué)修飾才能使材料光聚合。另外，由于沒有噴嘴（用于噴墨打印機(jī)和擠出打印機(jī)）將材料輸送到所需的制造區(qū)域，通常將光敏聚合物填充到整個(gè)容器中，在該容器中打印該3D對象，從而增加了浪費(fèi)材料和增加成本的擔(dān)憂。

4 3D生物打印在重建腫瘤微環(huán)境中的應(yīng)用

如前所述，3D生物打印具有強(qiáng)大的改善體外模型的能力。3D打印應(yīng)用使生物學(xué)家能夠快速制作定制設(shè)計(jì)的3D支架原型，以在異質(zhì)微環(huán)境中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞。而且人們逐漸地意識到，腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性是推進(jìn)體外癌癥建模發(fā)展的關(guān)鍵。此外，細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械和化學(xué)成分的作用以及癌細(xì)胞和鄰近基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用為疾病進(jìn)展和治療靶點(diǎn)提供了新的視角[23]。3D生物打印可以在不同程度上解決所有這些問題，基于光輔助的3D生物打印可以繪制機(jī)械剛度的梯度圖，可以用來檢測細(xì)胞外基質(zhì)對癌細(xì)胞局部侵襲的機(jī)械作用?；趪娔蛿D壓成型的3D生物打印可以構(gòu)建具有微米級分辨率的3D支架，而多光子發(fā)射技術(shù)將該范圍擴(kuò)展到納米級特征圖案化。多材料聯(lián)合3D打印技術(shù)的發(fā)展，通過將細(xì)胞外基質(zhì)樣的生物材料、可溶性信號因子和細(xì)胞組成等多個(gè)生物墨水進(jìn)行構(gòu)圖，此能力用來復(fù)制腫瘤微環(huán)境。這些生物墨水可用于形成可溶性或束縛生物活性分子的梯度，形成具有可控空間排列的細(xì)胞共培養(yǎng)模型以及具有復(fù)雜細(xì)胞外微環(huán)境組成的3D支架。

在體外環(huán)境中建立模型的確切特征上必須是離散的，這些細(xì)節(jié)也有助于指示或推薦3D生物打印方法，幫助人們實(shí)現(xiàn)所需的組織結(jié)構(gòu)。通過為特定的研究定義最簡單的3D模型系統(tǒng)，通過標(biāo)準(zhǔn)的假設(shè)驅(qū)動(dòng)的研究將很容易發(fā)現(xiàn)癌癥細(xì)胞的關(guān)鍵環(huán)境成因或調(diào)節(jié)因子?？紤]到快速成型和控制支架生物活性信號特性的潛力，3D生物打印可用于實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。每一個(gè)變量都可以在高周轉(zhuǎn)時(shí)間下進(jìn)行操作和測試，以確定個(gè)體或組合對癌癥細(xì)胞行為的影響。3D生物打印可重現(xiàn)中等到高通量的復(fù)雜體外模型，從而提高了篩選有助于轉(zhuǎn)移性疾病發(fā)展的腫瘤微環(huán)境方面的能力。在腫瘤為轉(zhuǎn)移性疾病的背景下，已知癌細(xì)胞會隨著時(shí)間的推移明顯改變行為，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞侵入血液或淋巴管以及在繼發(fā)性腫瘤部位進(jìn)行定植和增殖。3D打印模型可以對變量進(jìn)行4D操作，這非常重要，因?yàn)榘┌Y是隨時(shí)間和空間發(fā)展的疾病。3D打印模型可以控制4D模型，例如模式化的機(jī)械硬化或軟化，生長因子從周圍基質(zhì)的定時(shí)和局部釋放以及受控的灌注曲線向脈管系統(tǒng)的控制。所以，3D打印模型通過其模擬體內(nèi)自然微環(huán)境的能力，并可以進(jìn)一步促進(jìn)人們了解腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

目前盡管腫瘤治療常用的化學(xué)治療與放射治療有一定的療效，但目前很多研究表明化學(xué)治療可能會誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生突變釋放，以及在細(xì)胞微環(huán)境中釋放具有轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞外囊泡來促進(jìn)耐藥性和轉(zhuǎn)移行[24，25]。所以對于腫瘤治療策略及新藥篩選，在腫瘤干細(xì)胞影響的侵襲及遷移腫瘤模型中，篩選出可控制腫瘤微環(huán)境得新型抗癌藥可能會有效治愈和縮小腫瘤[26]。而這一切的基礎(chǔ)為先用3D生物打印模擬出最接近體內(nèi)環(huán)境的腫瘤微環(huán)境，并制定成功的可持續(xù)發(fā)展的抗癌策略。

總之，3D生物打印具有動(dòng)態(tài)模擬體內(nèi)自然微環(huán)境的能力，3D打印模型可以進(jìn)一步促進(jìn)人們了解腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，可輔助體外篩選新型抗癌藥;同時(shí)，個(gè)體化3D打印模型可輔助制定抗癌治療策略。

5機(jī)遇與挑戰(zhàn)

3D生物打印技術(shù)來確定腫瘤微環(huán)境及轉(zhuǎn)移能力仍然存在局限性。首先，體外模型的主要困難之一是通常很難將體外細(xì)胞行為與體內(nèi)細(xì)胞行為聯(lián)系起來，這也是所有體外檢測方法中的一個(gè)主要問題，3D生物打印確實(shí)提供了一種能力，能夠較快速地提供多種具有變異性的支架。而且，為了更好地控制微體系結(jié)構(gòu)的異質(zhì)分布，對于大多數(shù)現(xiàn)有的生物打印機(jī)，需要將分辨率提高到亞細(xì)胞或分子水平（納米級）。另外，由于生物材料充當(dāng)與細(xì)胞的直接接觸界面，需要擴(kuò)展生物打印機(jī)與多種生物材料的生物相容性[27]。此外，缺乏商業(yè)合作資源使得非專業(yè)工程師難以采用3D生物打印來制作體外模型，非專業(yè)人士將來采用3D生物打印還會因難以學(xué)會并應(yīng)用程序的標(biāo)準(zhǔn)化打印機(jī)而受到阻礙，加大了使用的限制。所以成功地將3D生物打印技術(shù)應(yīng)用于主流臨床工作需要工程師和癌癥生物學(xué)家之間的跨學(xué)科研究。

6總結(jié)

3D生物打印技術(shù)已經(jīng)為組織工程帶來了驚人的成果，可能同樣會改變對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的理解。3D生物打印技術(shù)能夠大大提高構(gòu)建復(fù)雜且可重現(xiàn)的體外腫瘤模型的能力，從而使腫瘤生物學(xué)家可以闡明目前尚不清楚的腫瘤微環(huán)境如何影響轉(zhuǎn)移性疾病中的關(guān)鍵步驟?？傊?，對腫瘤微環(huán)境進(jìn)行3D生物打印仍然需要來自多個(gè)領(lǐng)域的合作的努力，包括制造學(xué)、材料科學(xué)、生物學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)來應(yīng)對機(jī)遇與挑戰(zhàn)。

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收稿日期：2020-07-02;修回日期：2020-07-16

編輯/成森