★ 許星明 譚榮榮 王曉敏*（江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004）

灰色關(guān)聯(lián)分析模型是近年一種成熟系統(tǒng)建模方法，具有需要的樣本少，無典型的分布規(guī)律，計(jì)算量小等特點(diǎn)。其通過求因素的發(fā)展態(tài)勢(shì)和系統(tǒng)之間的關(guān)聯(lián)度來說明各個(gè)因素的變化對(duì)系統(tǒng)整體行為的影響程度［1］。該方法已在農(nóng)業(yè)、水利、材料科學(xué)、宏觀經(jīng)濟(jì)等多方面得到廣泛應(yīng)用［2-3］，但在生物系統(tǒng)尤其涉及調(diào)節(jié)機(jī)理的應(yīng)用研究卻非常少見。

丹梔逍遙散是中醫(yī)學(xué)調(diào)節(jié)情志的名方［4］，由當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、柴胡、丹皮、梔子、甘草等中藥組成，為針對(duì)臨床肝郁血虛，內(nèi)有郁熱證的糖尿病合并抑郁的病機(jī)特點(diǎn)所立之方，其主要功效為疏肝解郁、清熱［5］。

本課題組前期研究結(jié)果表明丹梔逍遙散能降低血糖、血脂、降低胰島素抵抗，能提高外周胰島素靶組織―肝組織胰島素信號(hào)通路的IRS-2mRNA和PI3-KmRNA 表達(dá)，但對(duì)肝組織的AktmRNA 表達(dá)影響不大［6-7］?？赡苁峭庵芤葝u素抵靶點(diǎn)的多樣性引起，但其互相關(guān)系未見報(bào)道。因此本研究運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)模型探討丹梔逍遙散對(duì)胰島外周抵抗靶部位肌肉和脂肪Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 六種基因?qū)μ悄虿〈笫笱怯绊憽?/p>

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體重200～250 g，購自湖南斯萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。室溫保持在20 ℃～25 ℃，濕度45 %～65 %，12 h 光照，12 h 黑暗。

1.2 藥物及配制 柴胡6 g、當(dāng)歸6 g、白芍6 g、茯苓6 g、白術(shù)6 g、丹皮3 g、梔子3 g、甘草3 g。購于江西省南昌市老百姓藥店，按人與動(dòng)物體表面積折算法折算大鼠等效劑量為5 g/（kg·d），用5 倍于藥材的冷水浸泡20 min，用武火煎至水沸，改用文火30 min，濾出藥液加冷水適量，煎至水沸，改用文煎煮20 min，濾渣，將兩次煎取藥液混勻濃縮成每毫升含生藥2 g 的藥液，冰箱0 ℃～ 4 ℃保存，每周新鮮配制。

1.3 試劑與儀器 膽固醇、膽酸鈉（生工生物工程（上海）有限公司）；水合氯醛（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；鹽酸二甲雙胍（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；羅氏活力血糖儀（Roche 公司）、羅氏活力血糖儀試紙（Roche 公司）。臺(tái)式低溫高速離心機(jī)CR15T（德國IKA）；SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器（金壇市順華儀器公司）；微型離心機(jī)D1008E（SCILOGEX），超低溫冰箱Eppendorf 410（美國Eppendorf 公司）；Aquelix 5 二級(jí)純水儀（美國Millipore），DU730 型核酸蛋白分析儀GeneAmpPCR System2400；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀Applied Biosystems StepOne； Fluor Chem M（凝 膠成像系統(tǒng)）（美國Protein Simple 公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立方法和給藥 SD 大鼠，給予高糖高脂乳劑灌胃（66.6 % 基礎(chǔ)料、20 % 豬油、20 %蔗糖、10 %豬油、2.5 %膽固醇、1 %膽酸鈉）1 mL/100（g·d），3 周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ30 mg/kg 體重（STZ 溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，所配濃度為10 mg/mL），72 h 后內(nèi)眥靜脈采血測定空腹血糖，篩選血糖＞11.1 mmol/L 大鼠40 只［8］?？瞻讓?duì)照組和模型組每日以2 mL 飲用水灌胃；丹梔逍遙散高劑量組10g/（kg·d）、低劑量組5 g/（kg·d）；二甲雙胍組，鹽酸二甲雙胍懸濁液20.8 mg/（kg·d），共8 周。

2.2 血糖 禁食12h 處死大鼠，取其血清測血糖（酶法）。

2.3 組織mRNA 的表達(dá)情況 取大鼠的肌肉組織和脂肪組織分別進(jìn)行RNA 的提取，然后RT-PCR法檢測Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 的表達(dá)情況，并通過AlphaView SA 軟件測量出灰度值。

2.4 灰色分析模型的構(gòu)建［9］

2.4.1 肌肉和脂肪相關(guān)基因的RNA 表達(dá)量進(jìn)行無量綱化處理 取大鼠肌肉和脂肪分別進(jìn)行RNA 的提取，然后RT-PCR 檢測Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 的 表 達(dá) 情 況，并 通 過AlphaView SA 軟件測量出灰度值，計(jì)算各自與內(nèi)參比值后，采用初值化法進(jìn)行無量綱化處理。以模型組為對(duì)照組，作為初值，根據(jù)X'i（k）=Xi 實(shí)際（k）/Xi模型（k）（i 為正常、二甲雙胍、高劑量、低劑量組，k 為基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp）得到無量綱化數(shù)組，見表1-2。

表1 各組肌肉中相關(guān)基因RNA的無量綱化數(shù)值

表2 各組脂肪中相關(guān)基因RNA的無量綱化數(shù)值

2.4.2 計(jì)算絕對(duì)差值 逐個(gè)計(jì)算每個(gè)被評(píng)價(jià)對(duì)象指標(biāo)序列（比較序列）與參考序列對(duì)應(yīng)元素的絕對(duì)差值，即|X模型（k）-Xi（k）|（i 為正常、二甲雙胍、高劑量、低劑量組，k 為基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp），得到絕對(duì)差值，見表3-4。

表3 各組肌肉相關(guān)目的基因的絕對(duì)差值

表4 各組脂肪相關(guān)目的基因的絕對(duì)差值

2.4.3 找出最大最小絕對(duì)差值 肌肉中最大絕對(duì)差值為0.56、最小絕對(duì)差值為0.03；脂肪中最大絕對(duì)差值為0.54 最小絕對(duì)差值為0.01。

2.4.4 計(jì)算各組關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度 根據(jù)公式分別計(jì)算每個(gè)比較序列與參考序列對(duì)應(yīng)元素的關(guān)聯(lián)系數(shù)，見表5-6。

（其中X（K）為模型組的無量綱化序列，i為正常、二甲雙胍、高劑量、低劑量組，k 為基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp，min為最小絕對(duì)差值，max 為最大絕對(duì)差值，ρ 為分辨系數(shù)在［0，1］之間，在這取0.5［10］。）

對(duì)各評(píng)價(jià)對(duì)象（比較序列）分別計(jì)算其個(gè)指標(biāo)與參考序列對(duì)應(yīng)元素的關(guān)聯(lián)系數(shù)的均值，以反映各評(píng)價(jià)對(duì)象與參考序列的關(guān)聯(lián)關(guān)系，并稱其為關(guān)聯(lián)度。

根據(jù)公式得

表5 各組肌肉中的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度

表6 各組脂肪的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度

3 結(jié)果

3.1 各組的血糖值比較 給藥前，高脂飼料聯(lián)合低劑量STZ 造模的各組大鼠血糖明顯升高，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異（P＜0.05）。給藥后，與模型組比較，丹梔逍遙散低、高劑量組，陽性對(duì)照組對(duì)大鼠的血糖下降明顯，有顯著性差異（P＜0.05），見表7。

表7 各組的血糖變化的比較（）組別 n 給藥前（ummol/L） 給藥后（ummol/L）空白對(duì)照 8 5.5±0.7 4.8±0.7模型 7 21.0±6.1** 16.6±5.4二甲雙胍 8 20.5±7.6** 10.1±4.7#高劑量 8 19.6±6.2** 12.8±5.1#低劑量 7 20.1±8.4** 12.4±5.2#與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.2 肌肉組織相關(guān)靶基因?qū)ρ堑挠绊懞完P(guān)聯(lián)度 模型組為對(duì)照，肌肉組織中各組靶基因表達(dá)對(duì)血糖的影響：空白對(duì)照組0.67，二甲雙胍組0.70，高劑量組0.66，低劑量組0.73。肌肉組織中相關(guān)靶基因?qū)ρ堑年P(guān)聯(lián)度，其中Bax、Caspase-9、Erk基因?qū)ρ堑挠绊懕容^明顯。

3.3 脂肪組織各組靶基因表達(dá)對(duì)血糖的影響和關(guān)聯(lián)度 空白對(duì)照組0.64，二甲雙胍組0.70，高劑量組0.69，低劑量組0.65。相關(guān)靶基因?qū)ρ堑年P(guān)聯(lián)度，其中Bax、Caspase-9、Erk 基因?qū)ρ堑挠绊懕容^明顯。

3.4 肌肉組織和脂肪組織的相關(guān)靶基因?qū)ρ怯绊懙年P(guān)聯(lián)度 具有一致性。

4 討論

灰色關(guān)聯(lián)理論是1982 年由鄧聚龍創(chuàng)立的一門學(xué)說，將信息不完全作為灰的基本定義即：信息不完全的系統(tǒng)就為灰色系統(tǒng)。信息不完全一般是指的是：系統(tǒng)之間的關(guān)系不完全明確、單個(gè)系統(tǒng)中各因素關(guān)系不完全明確、系統(tǒng)結(jié)構(gòu)不完全知道、系統(tǒng)的作用原理不完全清楚。本研究中，各個(gè)基因之間對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響調(diào)控不明確，肌肉和脂肪兩個(gè)系統(tǒng)之間對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響調(diào)控不明確，完全符合灰色系統(tǒng)的定義，因此本研究采用了灰色關(guān)聯(lián)理論分析相關(guān)基因?qū)μ悄虿〈笫笱堑恼{(diào)控影響，并得出了一致性的結(jié)論：外周抵抗靶部位肌肉和脂肪組織中的Bax、Caspase-9、Erk 對(duì)糖尿病大鼠血糖的調(diào)控影響大，且對(duì)血糖影響的關(guān)聯(lián)度具有一致性。其中Bax、Caspase-9 屬于凋亡基因，而ERK 是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶屬于信號(hào)通路蛋白。我們推測是否ERK 基因所在的信號(hào)通路，對(duì)凋亡基因起到調(diào)控作用，抑制胰島細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)胰島素的分泌，減低糖尿病大鼠的血糖。不過他們之間是否有聯(lián)系，及如何進(jìn)行聯(lián)系的，還需要進(jìn)一步深入研究。