劉加林 賈永義 劉士力 鄭建波 遲美麗程 順 李 飛 尹紹武 顧志敏①

太湖魴鲌F2代GH基因結構、系統(tǒng)發(fā)育和表達特征*

劉加林1, 2賈永義1劉士力1鄭建波1遲美麗1程 順1李 飛1尹紹武2顧志敏1①

(1. 浙江省淡水水產研究所 農業(yè)農村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省淡水水產遺傳育種重點實驗室 湖州 313001; 2. 南京師范大學生命科學學院 南京 210023)

采用PCR及T-A克隆技術, 從基因組DNA成功克隆三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F2代含完整閱讀框的生長激素基因全序列, 經測序拼接獲得序列全長分別為6009、6042和6058bp, 轉錄單元長分別為2049、2014和2045bp。三種群體的GH基因序列均包括五個外顯子、四個內含子及5′側翼區(qū)和3′側翼區(qū); 編碼氨基酸序列均為633bp, 編碼210個氨基酸。對3個目14種魚類進行同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn), 太湖魴鲌F2代與其祖父母的遺傳距離相比親本較近。另取10尾太湖魴鲌F2代, 對其進行GH基因編碼區(qū)SNPs篩選, 共得到7處SNPs, 其中有3處位點的突變導致其氨基酸序列發(fā)生了明顯的變化; 對其蛋白質結構分析發(fā)現(xiàn), 突變后的氨基酸殘基導致蛋白質二級結構發(fā)生改變。我們將該10尾個體按體重分為小個體組和大個體組, 經組織表達分析發(fā)現(xiàn), 大個體組中的個體具有較高的轉錄水平, 進一步分析發(fā)現(xiàn)其氨基酸殘基有所不同。

太湖魴鲌; 屬間雜交; 生長激素; 克隆; SNPs; 表達分析

太湖魴鲌(♀×♂)是以經兩代群體選育和兩代異源雌核發(fā)育誘導的翹嘴鲌()為母本, 連續(xù)三代群體選育的三角魴()為父本, 通過遠緣雜交獲得的國家水產新品種(GS-02-001- 2017), 具有生長快、飼料轉化率高、體型適中、抗逆性強等特點, 適宜在全國可控水域推廣養(yǎng)殖。與大多雜種優(yōu)勢利用類似, 太湖魴鲌也是父母本雜交一代的經濟性狀優(yōu)勢利用, 其自交后代具有顯著的性狀分離現(xiàn)象(姜建湖等, 2019), 不適宜推廣養(yǎng)殖, 但在自交后代中不乏生長、體型、鱗片等顯著優(yōu)勢的個體, 可作為后代品種選育的優(yōu)良育種素材。

生長激素(growth hormone, GH)是能夠調節(jié)控制動物內分泌機制, 使進入機體內的營養(yǎng)物質按動物生長的需求朝著有益的方向進行再分配功能的各類激素的總稱, 可以調控信號傳導、肢體的發(fā)育以及細胞的定向分化等(嚴美姣等, 2010)。魚類的生長激素與催乳素(prolactin, PRL)和胎盤催乳素(placental lactogen, PL)屬于同一個基因家族(楊學明等, 2008), 是影響動物生長發(fā)育的主效基因(M?ller,2007)。楊學成等(1991)最早從大麻哈魚()腦垂體cDNA文庫中克隆得到全長為1.12kb的GH cDNA。隨著技術的不斷發(fā)展, 除了在禽畜物種上對GH基因的大量研究外(宋成義等, 2000; 王文君等, 2003), 對魚類GH基因也有大量報道。已有研究表明, 鯉魚()(Hong, 1993)、草魚()(Ho, 1991)、鯰魚()(Tang, 1993)等大多數(shù)魚類存在5個外顯子和4個內含子, 斜帶石斑魚()和翹嘴鱖()等少數(shù)魚類具有6個外顯子和5個內含子(Almuly, 2000; 魯雙慶等, 2008; Ma, 2012)。本團隊已對翹嘴鲌GH基因(劉士力等, 2019)及兩種生長激素受體(GHR)進行了分析(劉士力等, 2020), 均發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星位點且部分位點與生長性狀具有關聯(lián)性。在GH基因的5′端側翼區(qū)發(fā)現(xiàn)2個微衛(wèi)星位點, 且與體長、體質量等生長性狀具有關聯(lián)性; GHR1和GHR2中均發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星序列, 其中GHR2基因所發(fā)現(xiàn)的4個微衛(wèi)星位點均具有多態(tài)性, 且均與生長性狀相關。本研究通過克隆獲得三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F2代的GH基因全長序列, 分析其序列所具有的差異性; 并單獨對太湖魴鲌F2代GH基因進行SNPs的篩選以及組織表達分析, 探究基因結構的改變對基因表達帶來的影響。本研究結果將有助于闡明決定快速生長相關性狀的分子機制, 也將有助于對未來太湖魴鲌新品種標記輔助選擇育種提供良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗所用翹嘴鲌、三角魴、太湖魴鲌及太湖魴鲌F2代均來自于浙江省淡水水產研究所綜合試驗基地, 均剪取少量尾鰭于無水乙醇中–20°C保存, 用于后續(xù)DNA的提取; 從F2代群體中篩選出體重(BW)、體長(BL)和體高(BH)等性狀差異較大的10尾魚, 對每尾魚進行形態(tài)測量后分別剪取尾鰭用于DNA的提取, 并取適量的肌肉組織分成3份經樣品保護液(Sample Protector for DNA/RNA) 4°C過夜后于–80°C保存, 用于RNA的提取。

1.2 GH基因的克隆及SNPs篩選

本課題組已獲得翹嘴鲌GH基因序列全長(劉士力等, 2017), NCBI登錄號為KX925976。利用已獲得的三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F2代轉錄組中GH的mRNA序列進行Blast, 發(fā)現(xiàn)均與翹嘴鲌和團頭魴()(登錄號: AF463498)推測的mRNA序列相似度極高, 根據其保守區(qū)域和已知序列設計7對特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系及反應程序均按照劉加林等(2019)方法進行實施, PCR產物克隆后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

從F2代群體中挑選出10尾體型具有明顯差異的個體, 通過克隆及測序獲得每尾魚的GH基因全序列, 對該10條序列進行對比, 篩選出編碼區(qū)SNPs。

表1 GH基因克隆PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences used for GH gene cloning

1.3 GH基因的生物學分析

所獲得的DNA片段和已知的mRNA序列拼接及對比按照劉加林等(2019)等的方法進行, 以確定三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F2代GH基因正確性。GH基因的mRNA及編碼的氨基酸序列按照劉士力等(2016)等的方法進行分析。微衛(wèi)星和小衛(wèi)星的查找分別通過SSRhunter 1.3和在線軟件Repfind進行。利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法(neighbor-jioning method)將翹嘴鲌、三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F2代同鱸形目(Perciformes)、鯉形目(Cypriniformes)、鲇形目(Siluriformes)在內的共14種魚類進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

利用在線軟件分別對10尾F2代個體GH基因蛋白質結構進行預測; ExPASy和NCBI 中Conserved Domains (CD-Search)程序對有無跨膜結構及保守的蛋白質結構域進行預測; SignalP和PredictProtein對信號肽及蛋白質二級結構進行預測。

1.4 GH基因的定量表達分析

將RNA進行提取與檢測以及反轉錄合成cDNA, 具體方法按照說明書進行。根據本實驗中已經得到的F2代GH基因的開放閱讀框cDNA序列, 設計合成一對跨內含子的正反向特異熒光定量引物GH, 并且以內參基因EFα1作為對照(表1)。實時定量操作具體步驟按照劉士力等(2019)的方法進行, 目標基因轉錄本的相對表達量用qRT(Roche)軟件按照Livak等(2001)描述的方法計算, 使用Excel繪制直方圖。為了保證實驗結果的可靠性, 每個樣品, 實驗組和對照組的反應都進行了三次重復。

2 結果與分析

2.1 太湖魴鲌與親本及太湖魴鲌F2代GH基因序列全長分析

采用長片段PCR及T-A克隆技術, 從基因組DNA成功克隆三角魴、太湖魴鲌(翹嘴鲌♀×三角魴♂)和太湖魴鲌F2代含完整閱讀框的生長激素基因全序列。本課題組已成功克隆出翹嘴鲌GH基因全長序列, 為5966bp, 轉錄單元長1648bp。經測序拼接獲得三角魴、太湖魴鲌和太湖魴鲌F2代序列全長分別為6009、6042和6058bp; 轉錄單元長分別為2049、2014和2045bp。四種群體GH基因序列均包括五個外顯子、四個內含子及5′側翼區(qū)和3′側翼區(qū); 編碼氨基酸序列均為633bp, 編碼210個氨基酸。其序列組成及長度見表2。

太湖魴鲌和親本及太湖魴鲌F2代GH全基因序列的各自A、T、C、G的堿基含量近乎一致, 其中翹嘴鲌和三角魴的AT總含量均為65.0%, 太湖魴鲌和太湖魴鲌F2代的AT總含量均為64.8%, 該四種群體均顯示出了一致的AT偏好性。由此可知, 太湖魴鲌F2代的GH基因序列全長雖然稍大于其親本及祖父母本, 但其AT、CG的總含量與該三種群體無明顯差異, 說明太湖魴鲌F2代在堿基組成方面具有穩(wěn)定遺傳性。

表2 四種群體GH基因的序列長度(bp)

Tab.2 Sequence lengths of GH genes in four populations (bp)

2.2 太湖魴鲌與親本及太湖魴鲌F2代GH基因序列與氨基酸序列對比分析

四種群體中太湖魴鲌F2代GH基因序列最長, 比翹嘴鲌、三角魴及太湖魴鲌分別長59、49和16bp。該差異的產生主要是由于各序列5′側翼區(qū)、內含子及3′側翼區(qū)長度存在不同程度的差異, 在所有外顯子處序列的長度均無差異。以下圖例中翹嘴鲌、三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F2代分別以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ表示。

5′側翼區(qū), 太湖魴鲌F2代與三角魴在同一位置存在(AAT)7的微衛(wèi)星序列, 而太湖魴鲌與翹嘴鲌一致, 在相同位置均存在(AAT)8的微衛(wèi)星序列(圖1); 3′側翼區(qū), 太湖魴鲌F2代與太湖魴鲌和三角魴微衛(wèi)星序列相同, 在相同位置存在(TTC)6T(TAA)6的微衛(wèi)星序列, 而翹嘴鲌存在(TTC)5T(TAA)8的微衛(wèi)星序列(圖1)。

圖1 5′及3′側翼區(qū)微衛(wèi)星序列比較

注; 陰影加粗部分為微衛(wèi)星序列, 下劃線處表示差異堿基及間隔堿基“T”

第一內含子, 存在8bp以上的差異位點有2處, 8bp以下的差異位點有6處, 太湖魴鲌F2代在該部分與太湖魴鲌的相似度為100%, 且兩者在第一內含子處主要遺傳于三角魴; 第二內含子, 共有16處差異位點, 太湖魴鲌序列在其中10處只來自于父本三角魴, 2處來只自于母本翹嘴鲌, 有4處均不來源于親本, 可能是由于堿基的突變導致。在太湖魴鲌發(fā)生突變的其中1處位點及未發(fā)生突變的12處差異位點中, 太湖魴鲌F2代在該13處位點均與其一致(圖2); 第三內含子, 太湖魴鲌F2代在全部16處差異位點中發(fā)生突變或缺失, 與太湖魴鲌、翹嘴鲌和三角魴均不一致(圖2); 第四內含子, 太湖魴鲌F2代有3處位點均發(fā)生了堿基的突變或缺失, 有2處分別來源于太湖魴鲌和三角魴。由此可判斷, 在第一、二內含子中, 太湖魴鲌F2代主要遺傳于太湖魴鲌及三角魴, 遺傳較為穩(wěn)定; 在第三、四內含子中, 太湖魴鲌F2代遺傳不穩(wěn)定, 發(fā)現(xiàn)了多個位點堿基的突變或缺失。另外, 在四種群體的內含子中均未發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列。

四種群體的GH基因DNA序列均含完整閱讀框及起始密碼子、終止密碼子。根據圖3可以看出, 在第4、5外顯子中共有3處差異性位點, 自交F2代在第4外顯子區(qū)有1處位點完全變異, 該位點位于密碼子第3位堿基, 但并未改變其編碼的氨基酸; 另外太湖魴鲌在第5外顯子區(qū)有2處差異位點, 該兩處位點均位于密碼子第二位堿基, 導致其編碼的氨基酸發(fā)生了改變, 太湖魴鲌F2代及其祖父母在該2處編碼的氨基酸分別為谷氨酸、天冬氨酸, 而太湖魴鲌均為甘氨酸。

2.3 4個群體與其他魚類GH基因同源性分析及系統(tǒng)進化樹構建

利用MEGA 7.0軟件, 對本實驗所獲得的太湖魴鲌與親本及太湖魴鲌F2代, 從GenBank數(shù)據庫中獲得的包括鱸形目、鯉形目、鲇形目在內的共14種魚類GH編碼區(qū)核苷酸序列, 以構建NJ系統(tǒng)進化樹。圖4表明, 整個進化樹共分為3個分支, F2代與鯉形目魚類遺傳距離相對最近, 其次為鲇形目, 以100%的置信度形成完整的一支, 鱸形目中的褐石斑魚單獨組成一支, 另外三種魚類以87%的置信度組成另一支, 由此組成魚類GH基因的系統(tǒng)進化樹。該進化樹與同源性分析結果具有最大的一致性, 證明了對F2代進行深度遺傳挖掘的重要性。

注; 下劃線處陰影加粗部分為差異堿基

圖3 外顯子及推導氨基酸序列分析比較

Fig.3 Comparison of exons and derived amino acid sequences

注; 下劃線處陰影加粗部分為差異堿基

圖4 4個群體與其他魚類系統(tǒng)進化樹

2.4 太湖魴鲌F2代GH基因SNPs的篩選及基因結構

經太湖魴鲌自交后的F2代個體之間具有較為明顯的性狀分離現(xiàn)象(圖5), 翹嘴鲌與三角魴的各種形態(tài)特征組合在F2代中得到了較為全面的遺傳, BW、BL和BH等性狀在F2代群體中的差異較為顯著。對10尾太湖魴鲌F2代個體(編號分別為S1—S10)的GH基因外顯子序列對比發(fā)現(xiàn), 第一外顯子中并未發(fā)現(xiàn)突變位點; 在第二外顯子中發(fā)現(xiàn)兩個突變位點, 即在86nt以1︰9的比例存在G/A轉換、135nt以1︰9的比例存在A/G轉換, 值得注意的是, 135nt突變堿基改變了氨基酸序列, 由天門冬氨酸(D)轉變?yōu)樘扉T冬酰胺(N); 第三外顯子存在一個突變位點, 在104nt以1︰9的比例存在T/C轉換, 致使蘇氨酸(T)轉變?yōu)楫惲涟彼?I); 第四外顯子在90nt發(fā)現(xiàn)一個突變位點, 以3︰7的比例存在A/G轉換, 未改變其氨基酸序列; 第五外顯子突變位點最多, 為3個, 分別在19nt以1︰9的比例存在T/C轉換, 在238nt以4︰6的比例存在A/C轉換, 在247nt以4︰6的比例存在T/G轉換, 其中19nt突變堿基改變了氨基酸序列, 即脯氨酸(P)轉變?yōu)榻z氨酸(S)。差異氨基酸序列見圖6。

根據序列長度及位點的變化情況, 制作了太湖魴鲌F2代基因結構的變異圖(圖7)。由圖可知, 經自交后的F2代個體在GH基因編碼區(qū)序列長度和核苷酸發(fā)生了顯著的變化, 從序列長度來看, 只有3個個體與其親本相近, 其余7個個體序列長度均遺傳于祖父母本, 這與2.3所描述結果具有一致性; 從編碼區(qū)核苷酸角度出發(fā), F2代發(fā)生突變的7處位點與其祖父母本在同一區(qū)域同一位置均發(fā)生變異, 因此太湖魴鲌通過自交GH基因結構產生了顯著性變化, 下一步對其進行蛋白質結構分析及組織表達分析, 探究基因結構的變異對蛋白質結構及組織表達所帶來的影響。

圖5 F2代群體性狀分離圖

圖6 差異氨基酸序列對比

注; 下劃線處陰影加粗部分為差異氨基酸

圖7 GH基因結構示意圖

注; 黃色、紅色、綠色、藍色分別代表堿基A、G、T、C

2.5 蛋白質結構預測分析

經蛋白質結構預測發(fā)現(xiàn), 10尾F2代GH基因均無跨膜結構, 且在成熟肽序列中均包含一個信號肽, 全部由22個氨基酸組成; 用NCBI的Conserved Domains (CD-Search)程序分析蛋白質結構域表明, 均具有1個保守的蛋白結構域, 且都位于第28—209位氨基酸處。由于S1、S3和S8個體分別在第49、85和150位氨基酸處發(fā)生了突變, 且突變位置均位于蛋白結構域, 可信度(E-value)較氨基酸序列未突變個體(6.54e–72)發(fā)生了變化, 其中S3(7.65e–71)的E-value增加, 而S1和S8降低(均為4.48e–71)。蛋白質二級結構預測表明, 突變個體S1、S3和S8二級結構分別含52.86%、53.81%和52.38%的螺旋(helix), 43.81%、42.38%和44.76%的環(huán)(loop), 3.33%、3.81%和2.86%的鏈(strand), 而未突變個體二級結構含52.86%的螺旋、43.33%的環(huán)(loop)和3.81%的鏈。由于氨基酸殘基的變化導致蛋白質二級結構發(fā)生了改變。

2.6 太湖魴鲌F2代GH基因定量表達分析

實時定量分析結果表明, GH mRNA在所檢測的10個個體中均有表達, 在S1中的轉錄水平最高, 按表達量大小其次為S2、S3、S10、S9, 在S4—S8中的表達量較低。我們將10個個體按體重分為兩組(小個體組: S3, S4, S7, S9, S10; 大個體組: S1, S2, S5, S6, S8), 小個體組體重平均值512.16g, 表達量0.238; 大個體組平均值825.08, 表達量1.087, 結果表明體重大的表達量高(圖8)。

3 討論

GH基因是魚類腦垂體中分泌的促進生長的單一亞基的蛋白激素(楊學明等, 2008), 它參與魚的生長代謝, 能夠加速蛋白質合成和脂類降解(Sakamoto, 2006; Sciara, 2006), 溫海深等(2002)報道了鯉魚生長激素(cGH)RIA對鯉科魚類的測定具有良好的效果。本實驗中, 太湖魴鲌及其親本和太湖魴鲌F2代GH基因序列均包括五個外顯子、四個內含子及5′側翼區(qū)和3′側翼區(qū), 其中外顯子長度均具有一致性, F2代在第四外顯子中發(fā)生了G/A突變, 但未改變其編碼的氨基酸序列。相較于外顯子, 內含子存在相對較大的差異。F2代內含子長度分別與翹嘴鲌、三角魴和太湖魴鲌具有9、4和31bp的差異, 且通過序列對比發(fā)現(xiàn), F2代的第一、二內含子遺傳較為穩(wěn)定, 主要來源于太湖魴鲌及三角魴, 第三、四內含子具有較多的堿基突變或缺失, 具有不穩(wěn)定遺傳。值得注意的是, 在5′側翼區(qū), 太湖魴鲌F2代與祖父本三角魴在同一位置存在(AAT)7的微衛(wèi)星序列, 而太湖魴鲌與母本翹嘴鲌在相同位置均存在(AAT)8的微衛(wèi)星序列; 在3′側翼區(qū), 太湖魴鲌F2代、太湖魴鲌與父本三角魴一致, 在相同位置存在(TTC)6T(TAA)6的微衛(wèi)星序列, 而母本翹嘴鲌存在(TTC)5T(TAA)8的微衛(wèi)星序列。預測太湖魴鲌F2代GH基因位于兩端的微衛(wèi)星位點具有多態(tài)性, 與生長相關性狀之間的關聯(lián)性較強。

圖8 F2代大、小個體組中GH mRNA的表達

本研究對3個目14種魚類進行同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn), 兩者結果具有最高的一致性, 符合常規(guī)生物學上物種親緣關系的遠近程度, F2代與祖父母的遺傳距離稍近于親本。由于第五外顯子出現(xiàn)了兩處堿基突變, F2代在保守的蛋白結構域與親本具有兩處氨基酸殘基的差異(分別處于176nt和205nt), 同時也在氨基酸序列176nt發(fā)現(xiàn)一處與鰱魚之間的差異位點, 且僅有一處; F2代在信號肽和保守蛋白區(qū)域均發(fā)現(xiàn)一處與草魚具有差異性的氨基酸殘基, 發(fā)生了由纈氨酸-甘氨酸、精氨酸-甘氨酸的變化; 在與鱸形目和鲇形目的比較中, F2代與其氨基酸序列的差異主要集中在保守蛋白區(qū)域109nt至184nt之間, 相似性較低, 特別是與河川沙塘鱧僅有43.60%的相似度。該結果對F2代進行深度遺傳挖掘具有重要意義。

陳雪峰(2010)等采用了無需特殊儀器的Tetra- primers ARMS與PCR-RFLP法對吉富羅非魚IGF2基因進行了SNPs的檢測, 共得到11處SNP位點, 8處位于內含子中, 3處位于外顯子中, 且得到內含子SNPs的突變率高于外顯子的結論。本文通過篩選得到體型具有顯著差異的太湖魴鲌F2代共10尾, 對其GH基因外顯子序列進行分析。結果顯示, 在第二、三、四和五外顯子中共得到7處SNP位點, 其中位于第二、三和五外顯子中的3處突變位點使氨基酸殘基發(fā)生變異, 導致S1、S3和S8個體發(fā)生了序列變化。根據其變化情況, 我們對GH基因蛋白質結構進行預測, 結果發(fā)現(xiàn)變異后的氨基酸殘基改變了蛋白質二級結構, 使突變個體及未突變個體間產生不同的helix、loop和strand的組成占比。我們將10個F2代個體按體重分為小個體組和大個體組, 分析發(fā)現(xiàn), GH mRNA在大個體組中的轉錄水平較高, 主要是由于在大個體組中S1發(fā)生了氨基酸殘基的變化(天冬氨酸—天冬酰胺), 導致其產生了最高的轉錄水平, 使大個體組整體轉錄水平升高, 該結果可為以后的分子輔助標記育種研究提供理論基礎。本研究所取魚類均為同一時期, 且所取組織相同, 所得結論具有一定得參考意義和理論價值。

4 結論

本研究利用分子生物學技術, 克隆獲得三角魴、太湖魴鲌、太湖魴鲌F2代的GH基因全長序列, 從分子角度分析其遺傳差異性; 單獨對太湖魴鲌F2代GH基因進行SNPs的篩選以及對GH基因蛋白質結構進行了預測, 并進行了組織表達分析, 結果表明太湖魴鲌自交后引起的氨基酸殘基的改變導致蛋白質二級結構發(fā)生改變及基因表達產生顯著變化。

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STRUCTURE, PHYLOGENY AND TISSUE DISTRIBUTION OF GH IN♀×♂

LIU Jia-Lin1, 2, JIA Yong-Yi1, LIU Shi-Li1, ZHENG Jian-Bo1, CHI Mei-Li1, CHENG Shun1, LI Fei1, YIN Shao-Wu2, GU Zhi-Min1

(1. Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture of Ministry of Agriculture and Rural Development / Key Laboratory of Freshwater Aquatic Animal Genetic and Breeding of Zhejiang Province, Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China; 2. School of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China)

Using polymerase chain reaction (PCR) and T-A cloning technology, we successfully obtained complete sequences of growth hormone (GH) gene with complete open reading frames from complete genomic DNA from three fish populations,♀ ×♂ (×), and the F2of×. The total length of the sequence was 6009, 6042, and 6058bp, respectively, and the length of the transcription unit was 2049, 2014, and 2045bp, respectively. The GH gene sequence of the three populations includes five exons, four introns, 5′UTR (untranslated region) and 3′UTR. All of them encoded 633bp amino acid sequence and 210 amino acids. The homology and phylogeny analysis on 14 fish species from 3 orders showed that the genetic distance between the F2and its grandparents was closer than that of their parents. Seven SNPs (single nucleotide polymorphism) were obtained from 10 individuals of the F2, from which three mutations were observed causing significant changes in amino acid sequence. The analysis of protein structure showed that the mutated amino acid residue resulted in the change of protein secondary structure. We divided the 10 individuals into small and large body groups according to their body weight. Through tissue expression analysis, we found that the individuals in the large group had higher transcription level, and further analysis found that their amino acid residues were different.

♀×♂; intergeneric cross; growth hormone; cloning; SNPs; expression analysis

* 浙江省重點研發(fā)計劃項目, 2016C02055-1號。劉加林, 碩士研究生, E-mail: 1961954694@qq.com

顧志敏, 研究員, E-mail: guzhimin2006@163.com

2020-01-06,

2020-05-24

Q789; S965

10.11693/hyhz20200100006