黃 貴，王 磊，張曉膺

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院 a. 乳腺外科，b. 心胸外科，中國 常州 213003)

量子點(diǎn)具有光電性質(zhì)穩(wěn)定性良好、熒光量子產(chǎn)率較高、抗干擾性較強(qiáng)、比表面積大且易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于疾病診斷、藥物載體運(yùn)輸以及生物成像等生物醫(yī)藥學(xué)研究和光電器件的制備中[1，2]，但量子點(diǎn)的應(yīng)用一直受到其潛在毒性的限制。科學(xué)實(shí)驗(yàn)及工業(yè)生產(chǎn)中排放的量子點(diǎn)不可避免地進(jìn)入環(huán)境，也給生態(tài)環(huán)境及人體健康造成嚴(yán)重的威脅[3]。

考慮到量子點(diǎn)優(yōu)良的光學(xué)性能，其已成為生命科學(xué)研究及藥物開發(fā)中不可或缺的工具。研究者開始針對(duì)量子點(diǎn)的生物毒性進(jìn)行減毒處理，包括采用殼層結(jié)構(gòu)(ZnS或CdS)或更換非金屬核(碳量子點(diǎn)或ZnS)[4，5]。這些處理被認(rèn)為可以降低量子點(diǎn)中的重金屬釋放，但量子點(diǎn)自身納米效應(yīng)引發(fā)的毒性依然存在，并被認(rèn)為是量子點(diǎn)毒性的主要來源[6]。因此，篩選降低納米粒子毒性的配伍試劑成為一種新的嘗試辦法。

盡管量子點(diǎn)的毒性機(jī)理各異，但其毒性中伴隨的氧化應(yīng)激壓力升高現(xiàn)象獲得了較多研究者的認(rèn)可[7,8]。有鑒于此，篩選抗氧化試劑與量子點(diǎn)進(jìn)行配伍或進(jìn)行量子點(diǎn)修飾成為可能。我國是中藥的發(fā)源地，有大量的中草藥被發(fā)現(xiàn)并用于疾病治療中。這些中藥因來源于自然，具有良好的生物親和力，因此常被用于配伍藥方的研制中，用于增強(qiáng)效果與降低毒性[9]。這一類的藥物包括甘草、乳薊以及熊膽粉等，考慮到中藥成分的復(fù)雜性，研究者進(jìn)一步提純了其中的主要成分，包括甘草酸、熊去氧膽酸以及水飛薊賓等，研究其與其他藥物或毒素的聯(lián)合作用[10-12]。結(jié)果表明，這些成分具有優(yōu)良的抗氧化能力，并可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種肝臟及腎臟毒素的解毒作用。然而這些成分是否同樣能應(yīng)用于量子點(diǎn)解毒中仍未可知，同時(shí)其中涉及的相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

此外，不論是筆者還是其他研究團(tuán)隊(duì)均發(fā)現(xiàn)，ATP結(jié)合(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了量子點(diǎn)的外排過程，因此可能對(duì)其標(biāo)記及載體效果帶來較大影響[13,14]。同時(shí)腫瘤細(xì)胞易于通過高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白獲得耐藥性，從而降低基于量子點(diǎn)的腫瘤標(biāo)記或納米載藥效應(yīng)[15]。隨著對(duì)中藥成分研究的深入，其介導(dǎo)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制效應(yīng)逐漸被發(fā)現(xiàn)，例如，紫草素被發(fā)現(xiàn)可顯著抑制人卵巢癌細(xì)胞中的多藥耐藥蛋白(MDR1)，從而增加了紫杉醇的細(xì)胞毒性[16]。類似的結(jié)果也被發(fā)現(xiàn)于水飛薊賓[17]及熊去氧膽酸[18]中，從而提示我們可通過篩選合適的配伍中藥成分，同時(shí)獲得增強(qiáng)腫瘤治療效果及保護(hù)正常組織的功效。

作為一種常見的腫瘤，乳腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的氧化還原體系和抗氧化能力，且易于在藥物處理過程中獲得多藥耐藥作用，因此常被用于包括量子點(diǎn)在內(nèi)的多種納米粒子、藥物及化學(xué)試劑的毒性機(jī)制研究中[19-22]。因此，本文中以乳腺癌細(xì)胞系(SK-BR-3)為模型，首先研究量子點(diǎn)氧化應(yīng)激毒性的來源，其次檢測(cè)中草藥成分對(duì)巰基丙酸修飾碲化鎘(MPA-CdTe)量子點(diǎn)毒性的降低作用，并通過氧化應(yīng)激壓力水平、抗氧化酶及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因水平變化，解析其中可能的原理。其中，MPA-CdTe量子點(diǎn)為有較多文獻(xiàn)報(bào)道的典型易致毒性量子點(diǎn)[23]。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌(SK-BR-3)細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基來自Thermo fisher公司；從Sigma-Aldrich公司購買如下產(chǎn)品：巰基丙酸(MPA)，NaBH4，Te粉，CdCl2，噻唑藍(lán)(MTT)、5，5′-二硫代(雙硝基苯甲酸)(DTNB)，甘草酸，甘草酸二銨，水飛薊賓及熊去氧膽酸；胰酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸緩沖液(PBS)、RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒來自碧云天生物技術(shù)研究所；其余試劑為國產(chǎn)，分析純。

1.2 方法

1.2.1 量子點(diǎn)合成及表征 采用水熱法合成MPA-CdTe量子點(diǎn)[24]，即以Te粉、CdCl2及NaBH4為原料，以MPA為穩(wěn)定劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱至200 ℃，回流法制備量子點(diǎn)。所獲得量子點(diǎn)經(jīng)異丙醇沉淀收集后，烘干稱取質(zhì)量，并加入超純水配制為200 g·L-1的溶液。取溶液在紫外可見分光光度計(jì)(Cary 300，Agilent Technologies Inc.，美國)中檢測(cè)吸收光譜；在熒光光譜儀(Edinburgh FLS920，Edinburgh Instruments Ltd.，英國)中，以340 nm為激發(fā)波長，檢測(cè)熒光發(fā)射光譜。將量子點(diǎn)溶液滴于碳膜支撐的銅網(wǎng)上(商品)，紅外燈下烘干，利用透射電鏡(HT7700，Hitachi High-Tech，日本)進(jìn)行檢測(cè)，獲得量子點(diǎn)的大小以及粒徑分布信息。量子點(diǎn)溶液靜置48 h后，15 294×g離心，取上清用PinAAcle 900T原子吸收光譜儀(PerkinElmer，美國)進(jìn)行檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)其中游離Cd2+濃度為量子點(diǎn)濃度的1%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗(青霉素及鏈霉素均為10 g·L-1)的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長于37 ℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中，每隔24 h更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長至80%融合后，用EDTA-胰酶緩沖液(含2.5 g·L-1胰酶及1 g·L-1EDTA的PBS溶液)進(jìn)行消化傳代。

1.2.3 細(xì)胞處理 SK-BR-3細(xì)胞長至80%融合后，分別進(jìn)行量子點(diǎn)或量子點(diǎn)-中藥成分配伍處理。對(duì)于量子點(diǎn)單處理組，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，加入含MPA-CdTe量子點(diǎn)25，50，100，200，400 nmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基處理。為準(zhǔn)確反映量子點(diǎn)自身的毒性，同時(shí)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，分別向細(xì)胞中加入含CdCl2濃度為0.25，0.5，1，2，4 nmol·L-1的DMEM培養(yǎng)液。對(duì)于配伍處理組，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，置于含100 nmol·L-1的MPA-CdTe量子點(diǎn)及甘草酸(5，10，20 μmol·L-1)、熊去氧膽酸(25，50，100 μmol·L-1)或水飛薊賓(100，200，400 μmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)基中。上述處理48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。本文中甘草酸、熊去氧膽酸直接溶解于培養(yǎng)基中，水飛薊賓則首先溶解于二甲基亞砜，并在臨用前用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。二甲基亞砜終濃度不超過0.1%，中藥成分濃度參考文獻(xiàn)值[10-12]，并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明為不具有毒性的最大濃度。CdCl2濃度選擇為量子點(diǎn)濃度的1/100，因其為量子點(diǎn)溶液靜置48 h后釋放的游離Cd2+濃度。

1.2.4 細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組及處理組的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，加入600 μL MTT溶液(1 g·L-1，配制于PBS中)，37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育3 h，之后以1 mL含0.1%鹽酸的異丙醇萃取，所得溶液測(cè)570 nm下的吸光度。

1.2.5 GSH檢測(cè) 培養(yǎng)中的細(xì)胞經(jīng)處理后，采用PBS洗滌并加入500 μL TritonX-100溶液(1%溶解于PBS中)，30 min后收集裂解液，12 000 r·min-1離心去沉淀，取10 μL上清液并加入200 μL含1 g·L-1DTNB的PBS緩沖液，30 min后檢測(cè)412 nm處的吸光度，GSH含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行計(jì)算，并表征為對(duì)照組的百分比。

1.2.6 SOD檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)處理后，采用PBS洗滌并經(jīng)500 μL TritonX-100溶液裂解后，取10 μL裂解液用氮藍(lán)四唑法試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，另取10 μL裂解液用BCA總蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白含量。SOD酶活依據(jù)氮藍(lán)四唑生成藍(lán)甲臜(560 nm)的抑制率來計(jì)算，經(jīng)總蛋白校準(zhǔn)后，表征為對(duì)照組的百分比。

1.2.7 MDA檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)處理后，采用PBS洗滌并經(jīng)500 μL TritonX-100溶液裂解后，取100 μL裂解液，采用脂質(zhì)氧化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。MDA水平表征為MDA-硫代巴比妥酸復(fù)合物(535 nm)的形成速度。經(jīng)總蛋白校準(zhǔn)后，表征為對(duì)照組的百分比。

1.2.8 RT-PCR檢測(cè) 細(xì)胞總RNA用Thermofisher 公司提供的離心柱型RNA 提取試劑盒制備，RNA濃度采用紫外吸光光度法(260 nm)測(cè)定[25]。第一鏈cDNA的合成及進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增試劑盒均來自上海生工，過程均按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)中所用的引物，包括β-肌動(dòng)蛋白(ACTIN)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、多藥耐藥蛋白(MDR1)及多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP1)，采用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)[26]并總結(jié)于表1，擴(kuò)增儀器為7900HT Fast 熒光定量PCR儀，條件為95 ℃10 min，40個(gè)循環(huán)(94 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃10 s)，之后72 ℃3 min進(jìn)行延伸，RNA表達(dá)水平檢測(cè)方法為2-ΔΔCT，參考基因?yàn)棣?ACTIN。

表1 實(shí)驗(yàn)中采用的基因引物

1.2.9 Zeta電位及水合直徑檢測(cè) 量子點(diǎn)母液用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至400 nmol·L-1，分別向其中加入20 μmol·L-1甘草酸、100 μmol·L-1熊去氧膽酸或400 μmol·L-1水飛薊賓混合，48 h后，采用馬爾文粒度儀(Zetasizer Nano ZS 90，Malvern Panlytical，英國)進(jìn)行混合液中量子點(diǎn)的Zeta電位與水合直徑檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)中所涉及結(jié)果均為3批次不同樣品結(jié)果的平均值。數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行。組間數(shù)據(jù)差異基于方差分析進(jìn)行，兩組數(shù)據(jù)之間的對(duì)比則應(yīng)用LSD法。P<0.05代表差異具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 量子點(diǎn)理化性質(zhì)表征

經(jīng)TEM檢測(cè)，所得量子點(diǎn)為單分散納米粒子，平均粒徑為(5.35±0.94) nm(圖1A)。為進(jìn)一步表征合成的量子點(diǎn)，筆者對(duì)其吸收及熒光發(fā)射光譜(380～700 nm)進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果顯示量子點(diǎn)在所測(cè)范圍內(nèi)具有較長的吸收光譜及良好的熒光發(fā)射光譜。最大發(fā)射波長可確定在560 nm(圖1B)，為綠色熒光。該量子點(diǎn)可用于后續(xù)毒性研究中。

(A)量子點(diǎn)透射電鏡圖，表征量子點(diǎn)直徑；(B)量子點(diǎn)溶液紫外/可見吸收(虛線)及熒光發(fā)射光譜(實(shí)線)，激發(fā)波長為340 nm。

2.2 量子點(diǎn)引起的毒性及氧化應(yīng)激壓力檢測(cè)

經(jīng)量子點(diǎn)處理后，SK-BR-3細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性(圖2)，且半數(shù)致死量可確定在100 nmol·L-1附近。進(jìn)一步對(duì)其引起的氧化應(yīng)激壓力檢測(cè)可知，細(xì)胞中的GSH水平及SOD酶活均隨量子點(diǎn)濃度的升高而降低，而MDA水平則隨量子點(diǎn)的處理而逐漸上升。例如，經(jīng)25 nmol·L-1量子點(diǎn)處理后，細(xì)胞GSH水平、SOD酶活及MDA分別為對(duì)照組的(86.32±3.33)%，(86.79±7.85)%及(111.20±14.06)%，即變化不大。但當(dāng)量子點(diǎn)濃度增長為100 nmol·L-1后，上述參數(shù)變?yōu)?43.31±7.70)%，(59.18±12.00)%及(179.39±42.18)%?？梢娏孔狱c(diǎn)的細(xì)胞毒性伴隨著氧化應(yīng)激壓力的產(chǎn)生。更重要的是，同等游離濃度的Cd2+尚未產(chǎn)生顯著的毒性，不論是細(xì)胞活率，或者GSH，SOD及MDA水平均未發(fā)生顯著變化，因此本實(shí)驗(yàn)中所用的MPA-CdTe量子點(diǎn)毒性主要來自于自身。

圖2 量子點(diǎn)(A)及CdCl2(B)處理SK-BR-3細(xì)胞48 h后引發(fā)的毒性及氧化應(yīng)激損傷

2.3 中藥成分對(duì)量子點(diǎn)毒性影響

通過與量子點(diǎn)共處理細(xì)胞，3種中藥成分表現(xiàn)出不同的效果(圖3)。其中甘草酸與水飛薊賓表現(xiàn)出濃度依賴性的減毒作用，而熊去氧膽酸則無明顯效果。其中，量子點(diǎn)采用半數(shù)致死量附近的100 nmol·L-1作為對(duì)照，其造成的細(xì)胞活率為(49.69±1.93)%。經(jīng)10 μmol·L-1甘草酸共處理后，細(xì)胞活率升高為(74.20±3.81)%(P<0.01)，而20 μmol·L-1甘草酸共處理進(jìn)一步將細(xì)胞活率提升至(85.47±1.31)%(P<0.001)。水飛薊賓共處理組明顯的細(xì)胞活率提升出現(xiàn)于最大濃度，即400 μmol·L-1處，細(xì)胞活率為(66.89±5.22)%(P<0.01)。熊去氧膽酸共處理組細(xì)胞活率并未有明顯的改變。

甘草酸(GA，5，10，20 μmol·L-1)、熊去氧膽酸(UDA，25，50，100 μmol·L-1)及水飛薊賓(SLB，100，200，400 μmol·L-1)與100 nmol·L-1量子點(diǎn)共處理SK-BR-3細(xì)胞48 h后的細(xì)胞活率。**P<0.01，***P<0.001，對(duì)比于量子點(diǎn)單處理組。圖3 中藥成分與量子點(diǎn)共處理后細(xì)胞活率的升高情況 Fig. 3 Increase of cell viability after co-treatment of traditional Chinese medicine ingredients with quantum dots

2.4 中草藥成分對(duì)量子點(diǎn)氧化應(yīng)激壓力的減小作用

為檢測(cè)中草藥成分對(duì)量子點(diǎn)的減毒作用來源，筆者針對(duì)兩者共處理后細(xì)胞的氧化應(yīng)激壓力水平進(jìn)行了檢測(cè)(圖4)。結(jié)果表明，甘草酸和水飛薊賓能夠濃度依賴性地降低細(xì)胞中的氧化應(yīng)激壓力，但熊去氧膽酸效果則較弱。例如，經(jīng)100 nmol·L-1量子點(diǎn)處理48 h后，SK-BR-3細(xì)胞中的GSH水平為對(duì)照組的(43.31±7.70)%，但20 μmol·L-1甘草酸共處理可使細(xì)胞GSH水平至對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?P<0.001)。對(duì)應(yīng)的，400 μmol·L-1水飛薊賓共處理后細(xì)胞GSH水平為對(duì)照組的(73.14±11.85)%(P<0.01)。熊去氧膽酸100 μmol·L-1共處理后細(xì)胞GSH水平依然保持在(56.89±9.29)%，雖然較量子點(diǎn)單處理組有一定上升，但無顯著性差異(P>0.05)。

甘草酸(GA，5，10，20 μmol·L-1)、熊去氧膽酸(UDA，25，50，100 μmol·L-1)及水飛薊賓(SLB，100，200，400 μmol·L-1)與100 nmol·L-1量子點(diǎn)共處理SK-BR-3細(xì)胞48 h后的GSH水平(A)、SOD活性(B)及MDA水平(C)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001對(duì)比于量子點(diǎn)單處理組。

2.5 抗氧化酶的基因表達(dá)變化

為進(jìn)一步闡釋甘草酸及水飛薊賓這兩種中草藥成分緩解量子點(diǎn)毒性的內(nèi)在機(jī)理，筆者進(jìn)一步對(duì)量子點(diǎn)單處理組及量子點(diǎn)和中草藥成分共處理組的兩種關(guān)鍵抗氧化酶GST及SOD的基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)(圖5)。結(jié)果表明，100 nmol·L-1的量子點(diǎn)處理可顯著降低乳腺癌細(xì)胞中的GST及SOD基因表達(dá)水平，分別至對(duì)照組的0.40±0.25及0.78±0.23倍(P<0.05)。這些酶的基因表達(dá)水平可在GA及SLB處理后恢復(fù)，并最高可被誘導(dǎo)至對(duì)照組的6.34±0.37倍及6.84±0.58倍(20 μmol·L-1GA處理組，P<0.001)。

甘草酸(GA，10，20 μmol·L-1)及水飛薊賓(SLB，200，400 μmol·L-1)與100 nmol·L-1量子點(diǎn)共處理SK-BR-3細(xì)胞48 h后的GST與SOD酶的基因表達(dá)水平。*P<0.05，***P<0.001對(duì)比于未處理對(duì)照組；#P<0.05，###P<0.001對(duì)比于量子點(diǎn)單處理組。

2.6 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)變化

本文還探索了中草藥成分與量子點(diǎn)對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響。如圖6所示，100 nmol·L-1量子點(diǎn)可顯著誘導(dǎo)MDR1與MRP1的基因表達(dá)，使其表達(dá)量分別為對(duì)照組的6.03±1.48倍及5.46±1.69倍(P<0.001)即為可促進(jìn)多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。但這種促進(jìn)作用被甘草酸及水飛薊賓降低，最低可分別至對(duì)照組的3.03±1.18倍及3.75±1.02倍(P<0.001)。

2.7 中草藥成分與量子點(diǎn)的直接相互作用研究

為避免中草藥成分與量子點(diǎn)之間的直接作用對(duì)其毒性產(chǎn)生影響，筆者對(duì)兩者混合48 h后的量子點(diǎn)Zeta電位與水合直徑進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，中草藥成分的存在并未影響量子點(diǎn)的表面電荷與水合直徑(表2，P>0.05)，即中草藥成分與量子點(diǎn)并未發(fā)生明顯的相互作用。

Fig. 5 Gene expressions of anti-oxidative enzymes of cells treated with Chinese herbal ingredients and quantum dots甘草酸(GA，10，20 μmol·L-1)及水飛薊賓(SLB，200，400 μmol·L-1)與100 nmol·L-1量子點(diǎn)共處理SK-BR-3細(xì)胞48 h后的MDR1與MRP的基因表達(dá)水平。***P<0.001對(duì)比于未處理組； ##P<0.01，###P<0.001對(duì)比于未處理對(duì)照組。

表2 中草藥成分與量子點(diǎn)相互作用后的Zeta-電位和水合直徑

3 討論

盡管具有良好的光學(xué)特性，基于量子點(diǎn)開發(fā)的載體藥物及熒光探針依然無法進(jìn)入臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，這主要是因?yàn)槠錆撛诘纳锒拘訹27]。在傳統(tǒng)研究中，量子點(diǎn)釋放的游離Cd2+被認(rèn)為是量子點(diǎn)毒性的主要來源[28,29]。為此，研究者構(gòu)建了CdS或ZnS殼層結(jié)構(gòu)來減少Cd2+釋放，或通過更換核心結(jié)構(gòu)，如開發(fā)AgS及ZnS乃至碳量子點(diǎn)[30,31]。遺憾的是，這些努力并不能完全消除量子點(diǎn)本身的毒性，如碳量子點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)仍會(huì)抑制小球藻的生長[32]。這是因?yàn)榱孔狱c(diǎn)毒性來源可能來自于自身的納米效應(yīng)[33]。然而，不論游離Cd2+還是量子點(diǎn)自身的納米效應(yīng)，均被發(fā)現(xiàn)通過誘導(dǎo)過氧化壓力引發(fā)細(xì)胞及器官毒性[34,35]。因此，本文以具有較多毒性報(bào)道的MPA-CdTe 量子點(diǎn)為代表[36]，以文獻(xiàn)報(bào)道中具有較強(qiáng)抗氧化能力的甘草酸、水飛薊賓及熊去氧膽酸為中藥成分代表[37-39]，研究中藥成分對(duì)量子點(diǎn)的解毒作用，以期推出用于量子點(diǎn)應(yīng)用配伍及毒性治療法的方案。

應(yīng)用MPA-CdTe 量子點(diǎn)，筆者發(fā)現(xiàn)其對(duì)SK-BR-3細(xì)胞造成了濃度依賴性的毒性，表現(xiàn)為細(xì)胞活率的下降及氧化應(yīng)激壓力的上升(圖2A)。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的量子點(diǎn)毒性機(jī)理一致，并揭示過氧化損傷為量子點(diǎn)毒性的重要來源[36]。通過與同等濃度的游離Cd2+作用效果對(duì)比可知，該量子點(diǎn)的毒性主要來源于自身，因其釋放的Cd2+尚不足以引發(fā)細(xì)胞的任何變化(圖2B)。事實(shí)上，這也與文獻(xiàn)之前報(bào)道的結(jié)果一致，即量子點(diǎn)毒性往往大于其可能釋放的重金屬離子[40]。因此提示針對(duì)量子點(diǎn)的毒性研究應(yīng)更多地關(guān)注其自身的納米效應(yīng)。

進(jìn)一步地，量子點(diǎn)毒性可能被甘草酸、熊去氧膽酸及水飛薊賓等中藥成分緩解(圖3)。報(bào)道發(fā)現(xiàn)[41-43]，甘草酸、熊去氧膽酸及水飛薊賓均具有較強(qiáng)的還原性，可降低配伍藥物引發(fā)的過氧化壓力，進(jìn)而起到解毒的作用。然而筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅有甘草酸表達(dá)出了較強(qiáng)的解毒效果，水飛薊賓效果相對(duì)較弱，熊去氧膽酸則未見效果。這可能與不同試劑的還原性大小相關(guān)，即不同草藥成分對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激壓力的降低能力不同，并通過本實(shí)驗(yàn)中GSH，SOD及MDA的檢測(cè)得到了證明(圖4)。更重要的是，其他納米粒子，包括納米金、納米銀、二氧化鈦以及二氧化硅等納米粒子均被發(fā)現(xiàn)引發(fā)了顯著的細(xì)胞過氧化損傷[44]，并被認(rèn)為是納米粒子共同的致毒性機(jī)理。因此本文結(jié)果表明，還原性中藥成分不僅能夠用于量子點(diǎn)毒性防治，也可用于其他納米材料毒性的治療中。

本文的研究結(jié)果表明，甘草酸和水飛薊賓的處理還導(dǎo)致了抗氧化酶GST和SOD的表達(dá)水平上升(圖5)。過去的文獻(xiàn)表明，GST及SOD是機(jī)體及細(xì)胞實(shí)現(xiàn)消除過氧化壓力，實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)的主要蛋白[45]。其中，GST可通過催化GSH與重金屬等外源物的結(jié)合反應(yīng)，防止過氧化自由基的產(chǎn)生，起到解毒作用。SOD則是生物體內(nèi)的抗氧化金屬酶，能催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用。已有眾多的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，GST及SOD均可在細(xì)胞或機(jī)體受到輕度過氧化損傷時(shí)上升表達(dá)，從而起到自我保護(hù)的作用[46,47]。然而，當(dāng)外源物濃度超過細(xì)胞承受極限時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷并出現(xiàn)GSH，GST及SOD水平的急劇下降(圖2)。因此，甘草酸與水飛薊賓的加入不僅實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞過氧化損傷的修復(fù)，也有利于提升細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，具有良好的保健效果。

此外，本文的一個(gè)有趣發(fā)現(xiàn)在于甘草酸與水飛薊賓對(duì)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制作用(圖6)。這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符，表明中草藥成分有作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的潛力。長期的研究表明，包括MDR1及MRP1在內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可在藥物處理后上調(diào)，通過消耗ATP實(shí)現(xiàn)對(duì)多種藥物的外排作用，也即多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。盡管迄今為止，已經(jīng)過3代的抑制劑篩選，依然無法發(fā)現(xiàn)能夠真正用于臨床的多藥耐藥抑制劑[15,48]。這其中，生物安全性問題即為限制抑制劑使用的重要因素之一。有鑒于此，甘草酸、水飛薊賓等中草藥成分的高生物安全性可使其成為優(yōu)良的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，從而作為腫瘤治療中的有效配伍成分。

考慮到中草藥成分仍可通過與量子點(diǎn)結(jié)合改變其理化性質(zhì)，進(jìn)而降低其毒性。本文檢測(cè)了培養(yǎng)基中量子點(diǎn)與各中草藥成分混合后的水合粒徑及表面電荷，結(jié)果表明其并無明顯變化(表1)。與此同時(shí)，考慮到本文中所用MPA-COOH-QDs表面為負(fù)電荷，該類型量子點(diǎn)廣泛報(bào)道的吸附對(duì)象為正電荷金屬或其他正電荷底物，且作用機(jī)理為靜電吸附[49,50]。而甘草酸、水飛薊賓及熊去氧膽酸均為負(fù)電荷成分，因此其與量子點(diǎn)相互作用的可能性較小。因此，中草藥成分的確通過影響細(xì)胞氧化應(yīng)激通路，進(jìn)而改變了量子點(diǎn)毒性，并可通過調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能抑制多藥耐藥現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，MPA-CdTe量子點(diǎn)過氧化毒性主要來源于自身，而不是其釋放的游離Cd2+。甘草酸及水飛薊賓能夠顯著降低量子點(diǎn)的過氧化毒性、提高細(xì)胞抗氧化能力及抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥作用，從而可以作為量子點(diǎn)應(yīng)用中配伍藥物，在降低細(xì)胞毒性的同時(shí)提高藥物作用效果。