（韓山師范學院，廣東潮州521041）

橄欖[Canarium album（Lour.）Raeusch.]為橄欖科橄欖屬喬木植物，廣泛種植于我國福建、廣東、廣西、海南[1-5]。其果味甘酸，性平，具有清熱解毒，化痰止咳，生津止渴的作用。且橄欖營養(yǎng)豐富，果肉內(nèi)含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素C[6-7]等物質(zhì)，含鈣量也很高。此外，橄欖中單寧含量極高，單寧又稱鞣質(zhì)、單寧酸，是多元苯酚類衍生物，有多重功效，如抗病毒活性、收斂、抗腫瘤活性[8]，并能與自由基發(fā)生反應(yīng)[9-15]，具有很強的抗氧化能力等[15-19]。但是，橄欖澀味重，其澀味主要來自細胞中的單寧，果實中單寧含量越高，澀味越濃。因此，果實加工過程需要進行脫澀處理，盡量把果實中單寧去除。目前，植物單寧的提取一般選擇以甲醇、乙醇等有機溶劑為主，但是提取時間長，易造成單寧氧化量及副提取物量的增加，導(dǎo)致提取效率偏低。超聲波輔助提取技術(shù)則可利用超聲波增大介質(zhì)分子的運動速度、增大介質(zhì)的穿透力等效應(yīng)以提取生物有效成分[20-22]。本研究比較了不同提取溶劑的提取效率，結(jié)合超聲波輔助提取技術(shù)，以橄欖為例從多方面優(yōu)化單寧的提取工藝，目的在于提高單寧的提取效率，并將之應(yīng)用于食品脫澀工藝中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮橄欖果：于2019年4月采購于福建莆田，置于-20℃冰箱中冷藏備用[14]。

單寧酸：天津市大茂化學試劑廠；甲醇、乙醇、鄰二氮菲：廣州試劑廠；甘油、冰醋酸、乙二胺四乙酸二鈉、六合水三氯化鐵：西隴化工股份有限公司；無水乙酸鈉：天津市致遠化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

S22H超聲波清洗儀：致微廈門有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；XMTD203恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；H1850R臺式高效冷凍離心機：湖南湘怡實驗儀器開發(fā)有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；CS-700高速多功能打粉機：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 單寧標準曲線的制定

精密稱取單寧酸5 mg，用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，作為0.1 mg/mL單寧標準溶液。分別取0、200、400、600、800、1 000 μL 標準溶液于 25 mL 棕色容量瓶中，加入5mL蒸餾水和125 μL的0.1 mol/L FeCl3溶液，靜置20min，再加入5mL鄰二氮菲緩沖溶液[0.015mol/L鄰二氮菲∶NaAc緩沖溶液∶0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）=10∶5∶1（體積比）]定容，靜置 10 min，在510 nm處測定各濃度的吸光度[23-25]。以吸光度為縱坐標，單寧濃度為橫坐標繪制標準曲線，得Y=0.276X-0.001 8，R2=0.995 4。

1.3.2 單寧含量的測定

單寧含量測定采用鄰二氮菲分光光度法。用0.1 mol/L的FeCl3溶液與樣品液反應(yīng)，加入鄰二氮菲溶液反應(yīng)，在510 nm處檢測其吸光度，通過標準曲線計算橄欖單寧提取量。

1.3.3 溶劑提取效率的比較

將烘干至恒重的橄欖粉碎成80目的粉末。取0.50 g橄欖粉末，在提取溫度40℃、提取時間40 min、料液比1∶40（g/mL）、超聲波功率100 W下采用固定功率超聲波輔助提取單寧，比較水、甘油、甲醇、乙醇、甲醇-甘油、乙醇-甘油等不同提取溶劑對單寧提取率的影響。

1.3.4 正交試驗

在相關(guān)文獻檢索和初步試驗的基礎(chǔ)上，確定對提取率有較大影響的3個因素：提取溫度（A+）、提取時間（B+）、料液比（C+）為三因素。選用混合正交表L9（33），按正交設(shè)計法尋找最佳工藝條件[26]，正交因素水平表見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal experimental design

1.3.5 響應(yīng)面試驗

以正交試驗的最佳提取條件作為參考，考慮成本過高，調(diào)整料液比為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）。把單寧提取率作為響應(yīng)值，選取提取溫度、提取時間、料液比3個影響因素為自變量，采用三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化以上因素，水平及因素編碼如表2響應(yīng)面水平及因素編碼所示。

表2 響應(yīng)面水平及因素編碼Table 2 Response surface level and factor coding

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，應(yīng)用Design Expert 8.06軟件對試驗所得結(jié)果進行回歸擬合分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取效率的比較

在提取溫度40℃、提取時間40 min、料液比1 ∶40（g/mL）、超聲波功率 100 W 的基礎(chǔ)上[18-21]，考察了水、甘油、甲醇、乙醇、甲醇∶甘油=7∶3（體積比）、乙醇∶甘油=7∶3（體積比）作為提取溶劑的提取效率。提取溶劑對單寧提取率的影響見圖1。

圖1 提取溶劑對單寧提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on tannin extraction rate

由圖1可知，各溶劑的效率大小為：甲醇+甘油＞甘油＞乙醇+甘油＞甲醇＞水＞乙醇。甘油的添加有效提高有機溶劑對單寧的提取率；添加甘油后，甲醇的提取率從24.93%提升至70.31%，乙醇的從5.8%提升至28.66%。

甘油作為有機溶劑，具有價格低廉、安全無毒和對單寧具有較大溶解度的特點，理論上是一種有潛質(zhì)的溶劑。但試驗結(jié)果表明，單獨使用甘油的效果并不佳，可能是由于甘油的黏稠性質(zhì)導(dǎo)致其無法較好地提取樣品中的單寧。而甲醇與甘油的混合溶劑，顯著提高單寧的提取率。原因可能是甲醇成液體狀穿透性強，能將單寧帶出樣品，溶解于甘油中。

2.2 甘油添加比例的提取效率比較

為進一步明確甘油添加量對提取率的影響，提取溶劑分別為：甲醇與甘油體積比分別為 8∶2、7∶3、6∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8（體積比），其它條件與 2.1 一致。甲醇與甘油不同比例對單寧提取率的影響見圖2。

圖2 甲醇與甘油不同比例對單寧提取率的影響Fig.2 Effect of different ratios of methanol and glycerol on tannin extraction rate

由圖2可知，增加甘油含量會提升提取率，直到60%甘油具有最高的提取率，為87.89%；隨后，甘油比例繼續(xù)增大時，提取率會逐漸降低。因此，優(yōu)化結(jié)果為甲醇∶甘油=4∶6（體積比）時提取率最高，適合選為橄欖單寧的提取劑。

2.3 正交試驗優(yōu)選最優(yōu)條件

以2.2為基礎(chǔ)，溶劑選用甲醇∶甘油=4∶6（體積比），超聲波功率100 W，探究溫度、時間、料液比等因素對單寧提取效率的影響。其中，基于單寧受熱易分解的特點，提取溫度選擇20、40、60℃；考慮成本因素，提取時間選擇40、60、80 min，提取料液比選擇1∶20、1 ∶40、1 ∶80（g/mL）。

2.3.1 正交試驗結(jié)果

以正交試驗（表1）的條件設(shè)計試驗，每組重復(fù)3次，計算出各條件下的單寧提取率，并對數(shù)據(jù)進行處理，正交試驗的結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在甲醇∶甘油=4∶6（體積比）、功率為100 W、溫度為20℃、時間為80 min、料液比為 1 ∶80（g/mL）的提取條件下，橄欖單寧的提取率最高約為93.26%。

表3 正交試驗的結(jié)果Table 3 The results of the orthogonal experimental

續(xù)表3 正交試驗的結(jié)果Continue table 3 The results of the orthogonal experimental

由表3可知，各因素對橄欖單寧提取率影響程度的主次順序為B+（時間）＞A+（溫度）＞C+（料液比），最佳方案為A+1B+3C+2。方差分析結(jié)果如表4。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results

2.3.2 正交試驗結(jié)果的驗證

為驗證上述正交試驗的結(jié)果，選取正交結(jié)果最優(yōu)條件A+1B+3C+3，k值最優(yōu)結(jié)果A+1B+3C+2進行驗證試驗，通過3次重復(fù)試驗，正交最優(yōu)條件得出平均單寧提取率為94.08%，高于k值結(jié)果，故在后續(xù)試驗中選A+1B+3C+3做進一步優(yōu)化。驗證試驗結(jié)果與正交試驗結(jié)果相差0.82%。誤差在可允許范圍內(nèi)，正交試驗重復(fù)率高，數(shù)據(jù)真實可信。

2.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)選最優(yōu)條件

2.4.1 響應(yīng)面結(jié)果分析

以響應(yīng)面（表2）的條件設(shè)計試驗，每組重復(fù)3次，計算出各條件下的單寧提取率，并對數(shù)據(jù)進行處理，橄欖單寧提取中心組合試驗方案及結(jié)果見表5。

表5 橄欖單寧提取中心組合試驗方案及結(jié)果Table 5 Combination test scheme and results of tannin extraction center of acanthopanax dfficinalis

續(xù)表5 橄欖單寧提取中心組合試驗方案及結(jié)果Continue table 5 Combination test scheme and results of tannin extraction center of acanthopanax dfficinalis

2.4.2 回歸模型方差結(jié)果及分析

回歸方程分析表見表6。

表6 回歸方程分析表Table 6 Regression equation analysis table

由表6可知，該模型方程P=0.003 4＜0.05，遠小于0.01，表現(xiàn)為“差異極顯著”，表明回歸模型達到極顯著水平。模型的相關(guān)系數(shù)R2=92.54%，大于0.8，說明模型擬合度良好，體現(xiàn)了響應(yīng)值得率實際值與預(yù)測值之間的擬合度較大，反應(yīng)真實試驗值。失擬項P=0.089 6＞0.05，表現(xiàn)為“不顯著”，可得出該模型合適，失擬項對于存在的純誤差不顯著，可忽略。變異系數(shù)C.V.=2.68%，遠小于10，說明試驗具有較高的重復(fù)性。綜上所訴，試驗誤差小，重復(fù)性強，方法可靠，因此該模型可進一步分析單寧最佳提取工藝條件。

2.4.3 響應(yīng)面交互因素分析

各因素交互作用的響應(yīng)面曲面圖見圖3～圖5。

圖3 提取時間與提取溫度的交互作用Fig.3 Interaction between extraction time and extraction temperature

圖4 提取溫度與料液比的交互作用Fig.4 Interaction between extraction temperature and the ratio of material to liquid

圖5 提取時間與料液比的交互作用Fig.5 Interaction between extraction time and feed ratio

觀察交互作用的響應(yīng)面曲面坡度陡峭程度，若坡度陡峭，表明響應(yīng)值受變量交互作用的影響大；分別將提取時間、提取溫度、料液比其中兩個影響因素固定為零水平，組合得出另外兩個影響因素的交互作用。并結(jié)合表6可知，AB交互作用P=0.004 1，表示為“影響極顯著”，表明提取溫度與提取時間兩因素之間的交互作用對橄欖單寧提取率影響極大。AC交互作用P=0.294 2。BC交互作用P=0.979 4，表明提取時間與料液比之間的交互作用對橄欖單寧提取率影響較小。由F值可得出，各影響因素的主次順序為：提取時間（B）＞提取溫度（A）＞料液比（C），與正交試驗所得結(jié)果吻合。

2.4.4 最佳提取工藝的優(yōu)化及驗證分析

在正交試驗最優(yōu)結(jié)果（A+1B+3C+3）的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面軟件優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為：在超聲波功率為100 W的條件下，提取溫度為15.08℃，提取時間為98.65 min，料液比為 1 ∶22.49（g/mL），單寧提取率的理論值為97.52%。為了驗證結(jié)果的真實性、可靠性與實際操作的方便性，將實際提取工藝參數(shù)調(diào)整為提取溫度為 15℃，提取時間為 99 min，料液比為 1∶22.5（g/mL）。以此為提取條件，進行3次平行重復(fù)試驗，得出實際單寧的平均提取率為95.99%與理論值97.52%相差1.53%，誤差在5%以內(nèi)，說明此模型可靠性較高。

3 結(jié)論

以甲醇和甘油作為提取溶劑，采用超聲波輔助法提取橄欖粉末中單寧，經(jīng)正交試驗結(jié)果顯示提取時間＞提取溫度＞料液比。因此，最優(yōu)條件為：甲醇∶甘油=4∶6（體積比）、提取功率100 W、提取溫度20℃、提取時間80 min、料液比1∶80（g/mL），在此條件下提取率可以達到（93.26±0.45）%。同時，考慮環(huán)保及成本問題，建議以提取溫度為40℃、提取時間為80 min、提取料液比為1∶20作為最優(yōu)條件。

進一步運用響應(yīng)面軟件Design Expert 8.06優(yōu)化工藝條件，得出橄欖粉末中單寧提取的最佳工藝條件為：超聲波功率為100 W，提取溫度為15℃，提取時間為99 min，料液比為1∶22.5（g/mL），單寧提取率為95.99%。本試驗研究表明使用甲醇和甘油作為提取溶劑，對單寧的提取率及重復(fù)率效果顯著，可為橄欖的產(chǎn)品開發(fā)提供一定的依據(jù)。