于聰，毛建利，李艷，2，*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

黑果腺肋花楸（black chokeberry），俗稱不老莓，屬薔薇科腺肋花楸屬植物，多年生落葉灌木，樹形呈叢生狀，花期約7 d～10 d。8月末成熟，果皮較硬，果實(shí)黑紫色，酸澀，果汁為暗寶石紅色，果籽較小成芝麻狀，從開花到果實(shí)成熟約105 d～110 d[1-3]。黑果腺肋花楸耐寒性與抗旱性極強(qiáng)[4-6]。黑果腺肋花楸原產(chǎn)美國東部，19世紀(jì)作為觀賞植物傳入德國[7-8]，20世紀(jì)90年代初，我國遼寧省半干旱地區(qū)造林研究所從朝鮮引進(jìn)1個(gè)品種，1998年又從俄羅斯引進(jìn)1個(gè)品種，2001年從美國再次引進(jìn)6個(gè)品種[9-10]。之后，黑果腺肋花楸被推廣種植到我國內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江、河南、河北、山東、新疆等12個(gè)省[11-12]。

黑果腺肋花楸酒含有較多的單寧、花色苷、黃酮等酚類物質(zhì)，且在存貯過程中這些物質(zhì)很容易聚合析出及發(fā)生緩慢氧化，使黑果腺肋花楸酒出現(xiàn)渾濁沉淀[13-14]。在黑果腺肋花楸酒澄清過程中，由于自然沉降的速度很慢，因此花楸酒的穩(wěn)定性試驗(yàn)周期長[15]。得到澄清透明并能長期保持穩(wěn)定的黑果腺肋花楸酒，是生產(chǎn)的關(guān)鍵[16]。本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)選擇合適的澄清劑及用量，并進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黑果腺肋花楸酒的澄清條件，最終得到一款色澤呈現(xiàn)寶石紅，澄清透明，口感柔和的黑果腺肋花楸酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸選用河北省盧龍縣2018年產(chǎn)果實(shí)，采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，釀造干型果酒，工藝流程見圖1。

圖1 黑果腺肋花楸酒釀造工藝流程圖Fig.1 Black chokeberry wine of traditional brewing process flow chart

1.2 試驗(yàn)試劑

殼聚糖（食品級）：廣東惠發(fā)生物科技有限公司；明膠（食品級）：河南尚宏生物科技有限公司；拉曼德皂土、蛋清粉（均為食品級）：法國LAFFORT公司。

無水碳酸（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑廠；鹽酸、沒食子酸（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸鋰（分析純）：天津市博迪化工有限公司；鉬酸鈉（分析純）：天津市化學(xué)試劑西廠。

1.3 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：金壇市杰瑞爾電器有限公司；分析天平（AR1140）：深圳市時(shí)代之峰科技有限公司；PH數(shù)字酸度計(jì)（DELTA 320）、電子天平（PL203型）：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；電子萬用爐（DK-98-11）：天津市泰斯特儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-0AB）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-1）：上海勝啟儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（SP-756）：上海光譜儀器有限公司；電子天平（JJ1000）：常熟市雙杰測試儀器廠；超低溫保存箱（MDF-382E）：日本三洋電器集團(tuán)；酶標(biāo)儀（Multiskan）：Thermo Fisher Scientific 公司；pH211 型pH 儀（Microproces）：HANNA 公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 單因素試驗(yàn)

取貯存60 d后的發(fā)酵酒進(jìn)行澄清試驗(yàn)。以室溫（25℃左右）下，澄清48 h后果酒透光率[17-18]為指標(biāo)，澄清劑的選擇分組試驗(yàn)變量為：殼聚糖（10、20、40、80、100、200、400、600、800 mg/L）、皂土（5、10、30、50、80、100、300、500、1 000 mg/L）、明膠（0.5、1、4、8、10、20、40、80、100 mg/L）、蛋清粉（20、40、80、100、200、400、600、800、1 000 mg/L）。

以透光率為指標(biāo)，分別固定澄清溫度15℃、澄清時(shí)間40 h、復(fù)合澄清劑添加量為：殼聚糖+蛋清粉=200+125（mg/L+mg/L），研究澄清溫度：5、10、15、20、25 ℃，澄清時(shí)間：10、20、30、40、50、60、70、80、90 h，澄清劑（殼聚糖+蛋清粉）添加量：360+25、320+50、280+75、240+100、200+125、160+150、120+175、80+200、40+225（mg/L+mg/L）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法[19-22]優(yōu)化黑果腺肋花楸酒的澄清條件，以透光率為評價(jià)指標(biāo)，選擇復(fù)合澄清劑（殼聚糖+蛋清粉）添加量、澄清時(shí)間、澄清溫度3個(gè)因素，因素水平表見表1。

表1 黑果腺肋花楸酒響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Table of response surface test factors for black chokeberry wine

1.4.3 檢測方法

透光率：采用分光光度計(jì)法，即將澄清處理好的黑果腺肋花楸酒，以蒸餾水為參比，于波長680 nm處檢測其透光率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。重復(fù)性和準(zhǔn)確性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)均由Excel 2010計(jì)算得出；采用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 澄清劑對澄清效果的影響

殼聚糖、明膠、皂土和蛋清粉進(jìn)行澄清試驗(yàn)的結(jié)果分別見圖2～圖5。

圖2 殼聚糖添加量對透光率的影響Fig.2 Effect of chitosan addition on light transmittance

圖3 明膠添加量對透光率的影響Fig.3 Effect of gelatin addition on light transmittance

圖4 皂土添加量對透光率的影響Fig.4 Effect of bentonite addition on light transmittance

圖5 蛋清粉添加量對透光率的影響Fig.5 Effect of egg white powder addition on light transmittance

由圖2可看出，隨著殼聚糖添加量的增大，酒體的透光率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)殼聚糖添加量為200 mg/L時(shí)，透光率最大為52.66%，因?yàn)闅ぞ厶悄芘c酒體中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)、纖維素、果膠等物質(zhì)結(jié)合凝聚，使酒體達(dá)到澄清的效果。當(dāng)殼聚糖的添加量過量時(shí)不能發(fā)生聚合反應(yīng)，因而會(huì)增加酒體的渾濁度，從而降低澄清效果。圖3說明，隨著明膠添加量的增加，酒體的透光率增加，當(dāng)明膠添加量增加到20 mg/L時(shí)，透光率最大為48.83%，之后透光率降低。明膠澄清果酒的原理在于，明膠能與果酒中的酚類物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)，生成沉淀增加酒體的透明度。當(dāng)明膠過量時(shí)多余的明膠會(huì)增加酒體的濁度，降低酒體的透光率。由圖4可知，當(dāng)皂土添加量達(dá)到300 mg/L時(shí)酒體的透光率最大為49.88%。這是由于帶負(fù)電的皂土膠體細(xì)粒與酒中帶正電的蛋白質(zhì)等形成絮狀沉淀，使酒得以澄清；而隨著添加量的增加，透光率先增加后減小，過量添加不但對發(fā)酵酒沒有起到澄清作用，反而使酒液更加渾濁。圖5是蛋清粉添加量對透光率的影響，當(dāng)?shù)扒宸厶砑恿繛?0 mg/L時(shí)，酒體透光率最大為54.42%。蛋清粉的澄清原理是其本身為容量很大的絮狀體沉淀，下沉?xí)r將懸浮物很快一起沉淀。當(dāng)?shù)扒宸厶砑恿窟^大時(shí)會(huì)形成膠體，影響酒體的澄清度。

2.1.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

采用殼聚糖和蛋清粉組成復(fù)合澄清劑時(shí)，復(fù)合澄清劑的添加量、澄清溫度和澄清時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果分別見圖6～圖8。

圖6 殼聚糖和蛋清粉添加量對透光率的影響Fig.6 Effect of chitosan and egg white powder addition on light transmittance

由圖6可知，殼聚糖和蛋清粉組成的復(fù)合澄清劑（殼聚糖+蛋清粉）添加量為200+125（mg/L+mg/L）時(shí)，酒體的澄清度最好，透光率達(dá)到54.97%。殼聚糖和蛋清粉共同作用，使酒體中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)、纖維素、果膠、酚類物質(zhì)等大、小分子物質(zhì)均結(jié)合凝聚，使酒體達(dá)到澄清的效果。圖7顯示，澄清溫度較低時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)較緩慢，澄清效果不佳；澄清溫度較高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)過快，澄清劑不易與懸浮物結(jié)合或結(jié)合不緊密，使得澄清效果不好。當(dāng)澄清溫度為10℃時(shí)，透光率最好，澄清度最高。由圖8可看出，隨著澄清時(shí)間的延長透光率先增加后降低。這是由于澄清時(shí)間過短，澄清劑結(jié)合沉淀不徹底；達(dá)到一定時(shí)間后酒中懸浮顆粒纏繞于澄清劑并隨之沉降，但澄清時(shí)間過長引起澄清劑黏度過大，反而不利于澄清。所以，澄清時(shí)間選擇50 h。

圖7 澄清溫度對透光率的影響Fig.7 Effect of clarification temperature on light transmittance

圖8 澄清時(shí)間對透光率的影響Fig.8 Effect of clarification time on light transmittance

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design Expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。以復(fù)合澄清劑添加量、澄清時(shí)間、澄清溫度為自變量，分別用A、B、C三個(gè)字母表示，以透光率為響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型和試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface optimization experimental design and results

續(xù)表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Response surface optimization experimental design and results

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

使用Design Expert 7.0軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

通過軟件分析，得到澄清劑添加量（A）、澄清時(shí)間（B）、澄清溫度（C）3個(gè)自變量非線性回歸的二次多項(xiàng)式擬合的預(yù)測模型方程：

R1=55.11-1.49A+1.23B+1.03C+0.59AB+0.072AC+0.44BC-4.11A2-1.10B2-2.07C2，該方程的決定系數(shù)R2=0.923 3，變異系數(shù)（C.V.）=2.52%，說明建立的模型能解釋響應(yīng)值變化的92.33%，模型的擬合程度較好，模型P值0.003 8，小于0.01，模型回歸方程極顯著；失擬項(xiàng)P值0.152 1，大于0.05，失擬項(xiàng)不顯著，因此模型的選擇是合適的。回歸方程為測定黑果腺肋花楸酒的透光率提供了一個(gè)合適的模型。

由表3各因素的F值可以反映各因素對試驗(yàn)指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對響應(yīng)值的影響越大。如表 3 所示，F(xiàn)A=10.46，F(xiàn)B=7.16，F(xiàn)C=5.03，故可知各因素對黑果腺肋花楸酒透光率的影響主次順序?yàn)椋簭?fù)合澄清劑添加量＞澄清時(shí)間＞澄清溫度。由表3還可以看出，方程的一次項(xiàng)A（復(fù)合澄清劑添加量）和B（澄清時(shí)間）對響應(yīng)值的影響顯著，C（澄清溫度）對響應(yīng)值的影響不顯著，二次項(xiàng)A2對響應(yīng)值的影響均為極顯著，C2為顯著，A、B、C之間交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著。

2.2.3 澄清條件對澄清效果的影響

澄清條件對澄清效果的影響見圖9。

圖9 澄清條件對透光率影響的響應(yīng)面立體圖Fig.9 Response surface stereogram of clarification conditions on light transmittance

運(yùn)用Design Expert 7.0軟件對顯著因素水平進(jìn)行優(yōu)化，并且對該模型進(jìn)行規(guī)范性分析，分析該模型具有最大值。進(jìn)一步分析可知，由該模型優(yōu)化得到復(fù)合澄清劑澄清果酒的最優(yōu)工藝為：復(fù)合澄清劑（殼聚糖+蛋清粉）質(zhì)量為 189.05+131.87（mg/L+mg/L），澄清時(shí)間67.49h，澄清溫度11.54℃，果酒透光率為55.73%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮實(shí)際操作，設(shè)定復(fù)合澄清劑（殼聚糖+蛋清粉）添加量為 190.00+130.00（mg/L+mg/L），澄清時(shí)間67 h，澄清溫度11.5℃，按上述條件進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，平均透光率為55.65%，絕對誤差為0.08，相對誤差0.0014，故通過該響應(yīng)面優(yōu)化后得出的回歸方程具有實(shí)際意義。

3 結(jié)論

本文利用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了黑果腺肋花楸酒的澄清條件。結(jié)果表明殼聚糖和蛋清粉的復(fù)合使用時(shí)澄清效果最好，最佳的澄清條件：殼聚糖+蛋清粉添加量為190.00+130.00（mg/L+mg/L），澄清時(shí)間為67 h，澄清溫度為11.5℃，透光率能達(dá)到55.65%；色澤呈現(xiàn)寶石紅，澄清透明，口感柔和。