康曉俊，史瑞基，李文欣，李寒，張雪梅，湯軼偉，顧玉紅，*，李思琦

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北保定071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000）

樹(shù)莓（Rubus idaeus Linn.）是薔薇科（Rusaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）植物[1]，又名覆盆子、馬林、托盤(pán)等，被人們稱(chēng)為“黃金水果”、“植物界的阿司匹林”[2]。根據(jù)植株的生長(zhǎng)特點(diǎn)和果實(shí)的顏色，將樹(shù)莓分為黃樹(shù)莓、紅樹(shù)莓、黑樹(shù)莓和紫樹(shù)莓這4大類(lèi)[3]。黃樹(shù)莓的成熟果較甜，可溶性糖含量明顯高于紅樹(shù)莓（“費(fèi)爾杜德”、“哈瑞太茲”、“紅玉”等）成熟果[4]。黃樹(shù)莓果實(shí)中揮發(fā)性香氣成分萜烯及醇酮類(lèi)物質(zhì)含量顯著高于“海倫”紅樹(shù)莓[5]，具有潛在的香水、香料等產(chǎn)品開(kāi)發(fā)前景。此外，隨著人們對(duì)抗氧化延緩衰老食品的需求，鮮食果實(shí)的抗氧化性研究倍受關(guān)注。在植物體內(nèi)，自由基會(huì)引起細(xì)胞的氧化衰老，為此，植物體內(nèi)存在抗氧化衰老的清除自由基的系統(tǒng)，包括抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)，其中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）與過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）構(gòu)成保護(hù)酶系統(tǒng)，通過(guò)SOD催化H+和O2-·（超氧陰離子自由基）生成H2O2（過(guò)氧化氫）與O2，H2O2被CAT或者POD催化生成O2與H2O，從而減輕或降低活性氧自由基對(duì)細(xì)胞的傷害[6-7]；自由基是引發(fā)慢性疾病的重要因素，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）是一類(lèi)較為穩(wěn)定的自由基，對(duì)DPPH自由基的清除率常被作為評(píng)估抗氧化能力的重要指標(biāo)[8]，在一定程度上能體現(xiàn)抗氧化物質(zhì)總酚的抗氧化能力[9]，而總酚含量與抗氧化能力顯著相關(guān)[10-12]。前人闡明了不同發(fā)育時(shí)期的紅樹(shù)莓[13-14]、桑葚[15-16]、刺梨[17]、巴西櫻桃[18]、桃[19]等的抗氧化酶活性變化規(guī)律，對(duì)這些植物的開(kāi)發(fā)利用有理論指導(dǎo)價(jià)值，而關(guān)于黃樹(shù)莓果實(shí)從青果到黃紅果不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的抗氧化性尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)為試材，對(duì)抗氧化酶活性、總酚含量及其對(duì)DPPH自由基的清除率進(jìn)行研究，旨在闡明不同發(fā)育時(shí)期黃樹(shù)莓果實(shí)的抗氧化特性，以期為進(jìn)一步根據(jù)黃樹(shù)莓果實(shí)的抗氧化特點(diǎn)進(jìn)行適時(shí)采收及研發(fā)抗氧化衰老的產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為“橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)，采自河北省廊坊市永清縣樹(shù)莓基地，采摘4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)，依次為青果、白果、黃果、黃紅果，經(jīng)過(guò)液氮速凍，轉(zhuǎn)至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo scientific ST 8R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)賽默飛世爾有限公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；OHAUS CP114電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)抗氧化酶活性的測(cè)定方法

參照李文欣等[13]的方法測(cè)定黃樹(shù)莓果實(shí)的抗氧化酶活性。稱(chēng)取青果、白果、黃果、黃紅果各0.3 g（3次重復(fù)），放入低溫預(yù)冷的研缽中，用移液器快速加1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液（4℃存放）入研缽中，快速研磨至勻漿狀態(tài)，迅速轉(zhuǎn)移至低溫預(yù)冷的離心管中，快速加入1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液（4℃存放）淋洗研缽并迅速轉(zhuǎn)移至低溫預(yù)冷的離心管中，重復(fù)淋洗一次，配平，將離心管在12 000 r/min和4℃的條件下離心30 min，離心結(jié)束后，輕輕倒出上清液，量取上清液體積，放到4℃條件下待用。運(yùn)用分光光度計(jì)測(cè)定CAT、POD及SOD活性，所用方法依次為過(guò)氧化氫法（一個(gè)CAT活性單位以每分鐘吸光度值變化0.1來(lái)表示）、愈創(chuàng)木酚法（一個(gè)POD活性單位以每分鐘吸光度值變化0.1來(lái)表示）、氮藍(lán)四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光還原法（一個(gè)酶活力單位是以抑制NBT光還原的50%的酶液量來(lái)表示）。

1.3.2 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)總酚含量及DPPH自由基清除率的測(cè)定方法

1）參考李文欣等[13]的方法進(jìn)行總酚的提取及測(cè)定。使用提取液為25%的鹽酸-乙醇溶液，在70℃條件下回流提取0.5 h，過(guò)濾至刻度試管，4℃條件保存?zhèn)溆?。配?0、10、20、30、40 mg/L 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入0.1 mL福林酚試劑、1 mL各濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，25℃下暗反應(yīng)5 min，再加入1 mol/L Na2CO30.2 mL，用蒸餾水定容至3 mL，混勻后50℃水浴0.5 h，運(yùn)用分光光度計(jì)在760 nm下測(cè)其OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2）樣品總酚含量的測(cè)定：稱(chēng)取樣品0.2 g，待測(cè)液同樣按上述方法進(jìn)行測(cè)定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的方程求得總酚含量。

3）DPPH自由基清除率的測(cè)定參照Ikram Ilahi等[8]的方法稍有改動(dòng)，根據(jù)總酚含量測(cè)定方法得到總酚待測(cè)液，稱(chēng)取2 mg DPPH粉末，用無(wú)水乙醇定容至200 mL容量瓶，配制成0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液，4℃保存。取2 mL 0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液和1 mL無(wú)水乙醇，混勻后運(yùn)用分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)得吸光值A(chǔ)0，取2.9 mL無(wú)水乙醇和0.1 mL總酚待測(cè)液，混勻后在517 nm下測(cè)得吸光值A(chǔ)1，取2 mL 0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液、0.9 mL無(wú)水乙醇和0.1 mL總酚提取液，混勻后在517 nm下測(cè)得A2。清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件制作柱形圖；使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，選擇單因素的Duncan新復(fù)極差法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析；使用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期抗氧化酶活性的研究

2.1.1 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期超氧化物歧化酶活性的變化

“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的超氧化物歧化酶活性如圖1所示。

由圖1可知，“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的SOD活性在4.00 U/（g·min）FW～35.58 U/（g·min）FW之間，整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。黃紅果的SOD活性最高，為35.58 U/（g·min）FW，極顯著（p＜0.01）高于其他3個(gè)時(shí)期；其他3個(gè)時(shí)期差異均為極顯著，其中青果的SOD活性最低，為4.00 U/（g·min）FW。

2.1.2 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期過(guò)氧化氫酶活性的變化

“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的過(guò)氧化氫酶活性如圖2所示。

圖1 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)超氧化物歧化酶的活性Fig.1 The activity of superoxide dismutase in fruit of'orange miracle'yellow raspberry at different developmental stages

圖2 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的過(guò)氧化氫酶的活性Fig.2 Catalase activity of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages

由圖2可知，“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的CAT活性在3.17 U/（g·min）FW～11.69 U/（g·min）FW之間，整體呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)。其中白果的CAT活性最高，為11.69 U/（g·min）FW，極顯著（p＜0.01）高于其他3個(gè)時(shí)期，其他3個(gè)時(shí)期之間無(wú)顯著性差別。

2.1.3 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)過(guò)氧化物酶活性的影響

“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的過(guò)氧化物酶活性如圖3所示。

由圖3可知，“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的POD活性在2.27 U/（g·min）FW～20.51 U/（g·min）FW之間，整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。青果的POD活性最高，為20.51 U/（min·g）FW，極顯著（p＜0.01）高于其他3個(gè)時(shí)期；白果與黃果存在顯著性差異（p＜0.05）；黃紅果的POD含量最低，為2.27 U/（min·g）FW，極顯著（p＜0.01）低于其他3個(gè)時(shí)期。

圖3 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的過(guò)氧化物酶的活性Fig.3 Peroxidase activity of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages

2.2 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚含量的影響

“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚含量如圖4所示。

圖4 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚含量Fig.4 The total phenolic content of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages

由圖4可知，“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚含量在16.56 mg/g FW～29.30 mg/g FW之間，整體呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)。青果的總酚含量最高，為 29.30 mg/g FW，極顯著（p＜0.01）高于其他 3個(gè)時(shí)期；黃紅果的總酚含量?jī)H次于青果，與其他3個(gè)時(shí)期差異極顯著（p＜0.01）；白果與黃果無(wú)顯著性差異。

2.3 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚提取液清除DPPH自由基能力的研究

“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚提取液清除DPPH自由基能力如圖5所示。

由圖5可知，“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚提取液清除DPPH自由基能力在10.21%～50.37%之間，整體呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)。青果的總酚提取液對(duì)DPPH自由基的清除率最高，為50.37%，極顯著（p＜0.01）高于其他3個(gè)時(shí)期；白果與黃紅果之間無(wú)顯著性差別；黃果的總酚提取液清除DPPH自由基能力最低，為10.21%，極顯著（p＜0.01）低于其他3個(gè)時(shí)期。

圖5 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚提取液清除DPPH自由基能力Fig.5 The ability of total phenolic extracts from‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages to scavenge DPPH free radicals

3 討論與結(jié)論

植物對(duì)于活性氧有兩套防御系統(tǒng)，分別為保護(hù)酶系統(tǒng)（SOD、CAT、POD等）以及天然的非酶自由基清除劑（酚類(lèi)、胡蘿卜素、維生素C等）[20]。本課題組前期研究表明“海爾特茲”紅樹(shù)莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的SOD活性、CAT活性、POD活性最高的時(shí)期依次為深紅果36.99 U/（g·min）FW，黃果41.12 U/（g·min）FW，青果9.83 U/（g·min）FW[13]；本研究中“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中，黃紅果的SOD活性最高，為35.58 U/（g·min）FW，白果的CAT活性最高，為11.69 U/（g·min）FW，青果的POD活性最高，為20.51 U/（g·min）FW；綜上所述，“海爾特茲”紅樹(shù)莓和“橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)成熟過(guò)程中抗氧化酶活性的變化趨勢(shì)一致，即SOD活性連續(xù)上升、CAT活性先上升后下降、POD活性持續(xù)下降；POD、CAT、SOD依次在果實(shí)發(fā)育初期、中期、后期的抗氧化能力最強(qiáng)；成熟果中較高的SOD活性增強(qiáng)了果實(shí)的抗氧化能力，降低了自由基對(duì)果實(shí)的傷害，同時(shí)提升了鮮食果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，因此，在黃紅果時(shí)期采摘可獲得SOD酶活性高、抗氧化能力強(qiáng)的黃樹(shù)莓果實(shí)。此外，本研究表明“橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)從青果到黃紅果的發(fā)育過(guò)程中，總酚含量及其清除DPPH自由基的能力整體都呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，青果的總酚含量及清除DPPH自由基的能力均為最高，因此在青果時(shí)期采摘可獲得酚類(lèi)物質(zhì)含量高且抗氧化能力強(qiáng)的黃樹(shù)莓果實(shí)；Giovana Bonat Celli等[18]研究表明在巴西櫻桃紅色品種的果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，青果時(shí)期的總酚含量與清除DPPH自由基的能力均為最高；朱明濤等[19]研究表明桃果實(shí)中總酚含量和清除DPPH自由基的能力隨著果實(shí)的發(fā)育呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)；即黃樹(shù)莓、巴西櫻桃紅色、桃在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中均為青果（幼果）的總酚含量與清除DPPH自由基的能力最高，說(shuō)明幼果通過(guò)酚類(lèi)物質(zhì)清除自由基起到抗氧化的作用，這為人類(lèi)開(kāi)發(fā)利用幼果酚類(lèi)物質(zhì)的藥用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，抗氧化酶與抗氧化物質(zhì)總酚是“橙色奇跡”黃樹(shù)莓自身的兩套不同的抗氧化機(jī)制，果實(shí)在不同的發(fā)育時(shí)期通過(guò)不同的抗氧化機(jī)制達(dá)到抗氧化目的，人們可根據(jù)需求確定采收期，本文可為“橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)抗氧化食品的研發(fā)以及適時(shí)采收提供一定的理論依據(jù)。