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        “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中抗氧化特性的研究

        2020-11-24 06:25:46康曉俊史瑞基李文欣李寒張雪梅湯軼偉顧玉紅李思琦
        食品研究與開(kāi)發(fā) 2020年21期

        康曉俊,史瑞基,李文欣,李寒,張雪梅,湯軼偉,顧玉紅,*,李思琦

        (1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定071000;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,河北保定071000;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定071000)

        樹(shù)莓(Rubus idaeus Linn.)是薔薇科(Rusaceae)懸鉤子屬(Rubus L.)植物[1],又名覆盆子、馬林、托盤(pán)等,被人們稱(chēng)為“黃金水果”、“植物界的阿司匹林”[2]。根據(jù)植株的生長(zhǎng)特點(diǎn)和果實(shí)的顏色,將樹(shù)莓分為黃樹(shù)莓、紅樹(shù)莓、黑樹(shù)莓和紫樹(shù)莓這4大類(lèi)[3]。黃樹(shù)莓的成熟果較甜,可溶性糖含量明顯高于紅樹(shù)莓(“費(fèi)爾杜德”、“哈瑞太茲”、“紅玉”等)成熟果[4]。黃樹(shù)莓果實(shí)中揮發(fā)性香氣成分萜烯及醇酮類(lèi)物質(zhì)含量顯著高于“海倫”紅樹(shù)莓[5],具有潛在的香水、香料等產(chǎn)品開(kāi)發(fā)前景。此外,隨著人們對(duì)抗氧化延緩衰老食品的需求,鮮食果實(shí)的抗氧化性研究倍受關(guān)注。在植物體內(nèi),自由基會(huì)引起細(xì)胞的氧化衰老,為此,植物體內(nèi)存在抗氧化衰老的清除自由基的系統(tǒng),包括抗氧化酶和抗氧化物質(zhì),其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)與過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)構(gòu)成保護(hù)酶系統(tǒng),通過(guò)SOD催化H+和O2-·(超氧陰離子自由基)生成H2O2(過(guò)氧化氫)與O2,H2O2被CAT或者POD催化生成O2與H2O,從而減輕或降低活性氧自由基對(duì)細(xì)胞的傷害[6-7];自由基是引發(fā)慢性疾病的重要因素,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)是一類(lèi)較為穩(wěn)定的自由基,對(duì)DPPH自由基的清除率常被作為評(píng)估抗氧化能力的重要指標(biāo)[8],在一定程度上能體現(xiàn)抗氧化物質(zhì)總酚的抗氧化能力[9],而總酚含量與抗氧化能力顯著相關(guān)[10-12]。前人闡明了不同發(fā)育時(shí)期的紅樹(shù)莓[13-14]、桑葚[15-16]、刺梨[17]、巴西櫻桃[18]、桃[19]等的抗氧化酶活性變化規(guī)律,對(duì)這些植物的開(kāi)發(fā)利用有理論指導(dǎo)價(jià)值,而關(guān)于黃樹(shù)莓果實(shí)從青果到黃紅果不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的抗氧化性尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)為試材,對(duì)抗氧化酶活性、總酚含量及其對(duì)DPPH自由基的清除率進(jìn)行研究,旨在闡明不同發(fā)育時(shí)期黃樹(shù)莓果實(shí)的抗氧化特性,以期為進(jìn)一步根據(jù)黃樹(shù)莓果實(shí)的抗氧化特點(diǎn)進(jìn)行適時(shí)采收及研發(fā)抗氧化衰老的產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        供試材料為“橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí),采自河北省廊坊市永清縣樹(shù)莓基地,采摘4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí),依次為青果、白果、黃果、黃紅果,經(jīng)過(guò)液氮速凍,轉(zhuǎn)至-80℃超低溫冰箱保存。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Thermo scientific ST 8R高速冷凍離心機(jī):德國(guó)賽默飛世爾有限公司;TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;OHAUS CP114電子天平:奧豪斯儀器(上海)有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市杰瑞爾電器有限公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)抗氧化酶活性的測(cè)定方法

        參照李文欣等[13]的方法測(cè)定黃樹(shù)莓果實(shí)的抗氧化酶活性。稱(chēng)取青果、白果、黃果、黃紅果各0.3 g(3次重復(fù)),放入低溫預(yù)冷的研缽中,用移液器快速加1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液(4℃存放)入研缽中,快速研磨至勻漿狀態(tài),迅速轉(zhuǎn)移至低溫預(yù)冷的離心管中,快速加入1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液(4℃存放)淋洗研缽并迅速轉(zhuǎn)移至低溫預(yù)冷的離心管中,重復(fù)淋洗一次,配平,將離心管在12 000 r/min和4℃的條件下離心30 min,離心結(jié)束后,輕輕倒出上清液,量取上清液體積,放到4℃條件下待用。運(yùn)用分光光度計(jì)測(cè)定CAT、POD及SOD活性,所用方法依次為過(guò)氧化氫法(一個(gè)CAT活性單位以每分鐘吸光度值變化0.1來(lái)表示)、愈創(chuàng)木酚法(一個(gè)POD活性單位以每分鐘吸光度值變化0.1來(lái)表示)、氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium,NBT)光還原法(一個(gè)酶活力單位是以抑制NBT光還原的50%的酶液量來(lái)表示)。

        1.3.2 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)總酚含量及DPPH自由基清除率的測(cè)定方法

        1)參考李文欣等[13]的方法進(jìn)行總酚的提取及測(cè)定。使用提取液為25%的鹽酸-乙醇溶液,在70℃條件下回流提取0.5 h,過(guò)濾至刻度試管,4℃條件保存?zhèn)溆?。配?0、10、20、30、40 mg/L 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別加入0.1 mL福林酚試劑、1 mL各濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,25℃下暗反應(yīng)5 min,再加入1 mol/L Na2CO30.2 mL,用蒸餾水定容至3 mL,混勻后50℃水浴0.5 h,運(yùn)用分光光度計(jì)在760 nm下測(cè)其OD值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

        2)樣品總酚含量的測(cè)定:稱(chēng)取樣品0.2 g,待測(cè)液同樣按上述方法進(jìn)行測(cè)定,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的方程求得總酚含量。

        3)DPPH自由基清除率的測(cè)定參照Ikram Ilahi等[8]的方法稍有改動(dòng),根據(jù)總酚含量測(cè)定方法得到總酚待測(cè)液,稱(chēng)取2 mg DPPH粉末,用無(wú)水乙醇定容至200 mL容量瓶,配制成0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液,4℃保存。取2 mL 0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液和1 mL無(wú)水乙醇,混勻后運(yùn)用分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)得吸光值A(chǔ)0,取2.9 mL無(wú)水乙醇和0.1 mL總酚待測(cè)液,混勻后在517 nm下測(cè)得吸光值A(chǔ)1,取2 mL 0.01 mg/L DPPH-乙醇溶液、0.9 mL無(wú)水乙醇和0.1 mL總酚提取液,混勻后在517 nm下測(cè)得A2。清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        使用Excel軟件制作柱形圖;使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),選擇單因素的Duncan新復(fù)極差法,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析;使用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期抗氧化酶活性的研究

        2.1.1 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期超氧化物歧化酶活性的變化

        “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的超氧化物歧化酶活性如圖1所示。

        由圖1可知,“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的SOD活性在4.00 U/(g·min)FW~35.58 U/(g·min)FW之間,整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。黃紅果的SOD活性最高,為35.58 U/(g·min)FW,極顯著(p<0.01)高于其他3個(gè)時(shí)期;其他3個(gè)時(shí)期差異均為極顯著,其中青果的SOD活性最低,為4.00 U/(g·min)FW。

        2.1.2 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期過(guò)氧化氫酶活性的變化

        “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的過(guò)氧化氫酶活性如圖2所示。

        圖1 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)超氧化物歧化酶的活性Fig.1 The activity of superoxide dismutase in fruit of'orange miracle'yellow raspberry at different developmental stages

        圖2 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的過(guò)氧化氫酶的活性Fig.2 Catalase activity of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages

        由圖2可知,“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的CAT活性在3.17 U/(g·min)FW~11.69 U/(g·min)FW之間,整體呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)。其中白果的CAT活性最高,為11.69 U/(g·min)FW,極顯著(p<0.01)高于其他3個(gè)時(shí)期,其他3個(gè)時(shí)期之間無(wú)顯著性差別。

        2.1.3 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)過(guò)氧化物酶活性的影響

        “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的過(guò)氧化物酶活性如圖3所示。

        由圖3可知,“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的POD活性在2.27 U/(g·min)FW~20.51 U/(g·min)FW之間,整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。青果的POD活性最高,為20.51 U/(min·g)FW,極顯著(p<0.01)高于其他3個(gè)時(shí)期;白果與黃果存在顯著性差異(p<0.05);黃紅果的POD含量最低,為2.27 U/(min·g)FW,極顯著(p<0.01)低于其他3個(gè)時(shí)期。

        圖3 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的過(guò)氧化物酶的活性Fig.3 Peroxidase activity of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages

        2.2 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚含量的影響

        “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚含量如圖4所示。

        圖4 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚含量Fig.4 The total phenolic content of‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages

        由圖4可知,“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚含量在16.56 mg/g FW~29.30 mg/g FW之間,整體呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)。青果的總酚含量最高,為 29.30 mg/g FW,極顯著(p<0.01)高于其他 3個(gè)時(shí)期;黃紅果的總酚含量?jī)H次于青果,與其他3個(gè)時(shí)期差異極顯著(p<0.01);白果與黃果無(wú)顯著性差異。

        2.3 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚提取液清除DPPH自由基能力的研究

        “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚提取液清除DPPH自由基能力如圖5所示。

        由圖5可知,“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚提取液清除DPPH自由基能力在10.21%~50.37%之間,整體呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)。青果的總酚提取液對(duì)DPPH自由基的清除率最高,為50.37%,極顯著(p<0.01)高于其他3個(gè)時(shí)期;白果與黃紅果之間無(wú)顯著性差別;黃果的總酚提取液清除DPPH自由基能力最低,為10.21%,極顯著(p<0.01)低于其他3個(gè)時(shí)期。

        圖5 “橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的總酚提取液清除DPPH自由基能力Fig.5 The ability of total phenolic extracts from‘orange miracle’yellow raspberry fruit at different developmental stages to scavenge DPPH free radicals

        3 討論與結(jié)論

        植物對(duì)于活性氧有兩套防御系統(tǒng),分別為保護(hù)酶系統(tǒng)(SOD、CAT、POD等)以及天然的非酶自由基清除劑(酚類(lèi)、胡蘿卜素、維生素C等)[20]。本課題組前期研究表明“海爾特茲”紅樹(shù)莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的SOD活性、CAT活性、POD活性最高的時(shí)期依次為深紅果36.99 U/(g·min)FW,黃果41.12 U/(g·min)FW,青果9.83 U/(g·min)FW[13];本研究中“橙色奇跡”黃樹(shù)莓不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中,黃紅果的SOD活性最高,為35.58 U/(g·min)FW,白果的CAT活性最高,為11.69 U/(g·min)FW,青果的POD活性最高,為20.51 U/(g·min)FW;綜上所述,“海爾特茲”紅樹(shù)莓和“橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)成熟過(guò)程中抗氧化酶活性的變化趨勢(shì)一致,即SOD活性連續(xù)上升、CAT活性先上升后下降、POD活性持續(xù)下降;POD、CAT、SOD依次在果實(shí)發(fā)育初期、中期、后期的抗氧化能力最強(qiáng);成熟果中較高的SOD活性增強(qiáng)了果實(shí)的抗氧化能力,降低了自由基對(duì)果實(shí)的傷害,同時(shí)提升了鮮食果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值,因此,在黃紅果時(shí)期采摘可獲得SOD酶活性高、抗氧化能力強(qiáng)的黃樹(shù)莓果實(shí)。此外,本研究表明“橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)從青果到黃紅果的發(fā)育過(guò)程中,總酚含量及其清除DPPH自由基的能力整體都呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì),青果的總酚含量及清除DPPH自由基的能力均為最高,因此在青果時(shí)期采摘可獲得酚類(lèi)物質(zhì)含量高且抗氧化能力強(qiáng)的黃樹(shù)莓果實(shí);Giovana Bonat Celli等[18]研究表明在巴西櫻桃紅色品種的果實(shí)發(fā)育過(guò)程中,青果時(shí)期的總酚含量與清除DPPH自由基的能力均為最高;朱明濤等[19]研究表明桃果實(shí)中總酚含量和清除DPPH自由基的能力隨著果實(shí)的發(fā)育呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì);即黃樹(shù)莓、巴西櫻桃紅色、桃在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中均為青果(幼果)的總酚含量與清除DPPH自由基的能力最高,說(shuō)明幼果通過(guò)酚類(lèi)物質(zhì)清除自由基起到抗氧化的作用,這為人類(lèi)開(kāi)發(fā)利用幼果酚類(lèi)物質(zhì)的藥用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

        綜上所述,抗氧化酶與抗氧化物質(zhì)總酚是“橙色奇跡”黃樹(shù)莓自身的兩套不同的抗氧化機(jī)制,果實(shí)在不同的發(fā)育時(shí)期通過(guò)不同的抗氧化機(jī)制達(dá)到抗氧化目的,人們可根據(jù)需求確定采收期,本文可為“橙色奇跡”黃樹(shù)莓果實(shí)抗氧化食品的研發(fā)以及適時(shí)采收提供一定的理論依據(jù)。

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