胡倩楠，韓宇航，李晨

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

鱸魚(yú)具有生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，既能在淡水中養(yǎng)殖又能在海水中生存。鱸魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，備受消費(fèi)者喜愛(ài)，是許多國(guó)家重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，鱸魚(yú)含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，富含人體所需的必需氨基酸、維生素B、維生素D、DHA等，含有多種微量元素如鋅、鈣、鐵、磷等[2]。近年來(lái)，市場(chǎng)對(duì)鱸魚(yú)的需求每年都在增加。然而目前鱸魚(yú)以鮮銷(xiāo)為主，對(duì)鱸魚(yú)的加工目前只局限于較為初級(jí)的速凍品，產(chǎn)品形式比較單一，缺乏更精更深的加工，鱸魚(yú)多元化制品有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)[3]。

魚(yú)糜制品具有口感好、低固醇、高蛋白、低脂肪等優(yōu)點(diǎn)，受到消費(fèi)者青睞，市場(chǎng)前景廣闊。內(nèi)源酶活性對(duì)食品安全與品質(zhì)有重要影響，魚(yú)肉水分含量較高，所含內(nèi)源酶類(lèi)較多，不僅影響其凝膠能力，而且極其容易變質(zhì)腐敗[4]。目前通常采用添加劑來(lái)改善肉糜制品的凝膠特性，常用的添加劑有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）、水溶性凝膠、多糖類(lèi)、非肉類(lèi)蛋白質(zhì)等[5-7]。然而，減少非肉組分的添加是凝膠類(lèi)肉制品行業(yè)面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。由于肌原纖維蛋白是形成肉類(lèi)凝膠的主要大分子，內(nèi)源酶對(duì)蛋白分子的降解是魚(yú)肉凝膠劣化的重要原因，因此篩選合適的蛋白酶抑制劑是解決蛋白凝膠劣化提高肉糜品質(zhì)的一個(gè)有效途徑[8]。重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI）是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為7.9 kDa的小分子蛋白，特異抑制胰蛋白酶的活性，具有很好的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性[9]。近期研究表明，rBTI還可以延緩秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的健康壽命[10-11]，具有良好的應(yīng)用前景。目前用于食品領(lǐng)域的酶抑制劑均為小分子化合物，有關(guān)多肽或蛋白類(lèi)的酶抑制劑在食品科學(xué)的應(yīng)用研究尚屬空白。本研究綜合評(píng)價(jià)蛋白酶抑制劑對(duì)魚(yú)糜凝膠特性及穩(wěn)定機(jī)制的影響，將為其在肉制品的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與儀器

大腸桿菌（E.coli M15 pQE30-BTI）：山西大學(xué)生物技術(shù)研究所蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；胰蛋白酶（250 U/mg）、硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate，Kan）、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethy）methyl aminomethane，Tris]、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、Ni2+-NAT親和材料、咪唑、牛血清白蛋白、醋酸、鹽酸、二甲基亞砜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）所用試劑：生工生物工程（上海）股份有限公司；苯甲酰-DL-精氨酰-對(duì)硝基苯胺（N-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride，BAp－NA）、Folin-酚試劑：北京索萊寶科技有限公司。

新鮮鱸魚(yú)（大口黑鱸）：山西省太原市田合活鮮水產(chǎn)市場(chǎng)。

TU-1810紫外分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；G154DS高壓蒸汽滅菌鍋：上海輔澤商貿(mào)有限公司；THZ-C-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)；JY92-IIDN超聲破碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；BSA224S精密電子天平、PB-10精密pH計(jì)：德國(guó)Sartorius公司；BioLogicLP低壓液相層析系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；INFINITY 3026凝膠成像系統(tǒng)：法國(guó)Vilber Lourmat公司；TMS-PRO物質(zhì)分析儀：北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；FA-25高速組織勻漿機(jī)：上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；IMS-30全自動(dòng)雪花制冰機(jī)：常熟市圣海電器有限公司；NS800分光測(cè)色儀：深圳市三恩馳科技有限公司；JYS-A800絞肉機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 rBTI的制備與純化

將含pQE30-BTI質(zhì)粒的M15菌接種于LB液體培養(yǎng)基（含 50 μg/mL Kan 和 100 μg/mL Amp），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入誘導(dǎo)劑IPTG（終濃度為0.5 mmol/L），誘導(dǎo)4 h后，6 000 r/min離心收集菌體。用緩沖液（Tris-HCl pH 7.5，20 mmol/L）重懸菌體，超聲破碎菌體，在80℃水浴中加熱30 min后，12 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI）粗品。

rBTI的純化采用Ni2+親和層析柱，在液相層析系統(tǒng)上進(jìn)行。先用緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH7.5）平衡 Ni2+親和柱，將離心后的粗蛋白上樣于Ni2+親和柱，流速設(shè)定為1 mL/min，用平衡緩沖液充分洗脫未結(jié)合的雜蛋白后，分別用含80 mmol/L和300 mmol/L咪唑的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH7.5）洗脫親和柱。收集各洗脫峰并進(jìn)行抑制活性測(cè)定及SDS-PAGE分析。

1.2.2 rBTI抑制胰蛋白酶活性的測(cè)定

按照Erlanger等的方法[12]，在試管中加入3.2 mL測(cè)活緩沖液（pH 8.0，100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L CaCl2）、50 μL 胰蛋白酶溶液、100 μL rBTI，37 ℃溫浴5 min后，加入17 μL 底物BApNA（0.15 mol/L，溶劑為二甲基亞砜）啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴加熱10 min后加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為33%的醋酸終止反應(yīng)，在410 nm下測(cè)定由產(chǎn)物對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生的吸光值?？瞻捉M加樣順序?yàn)橄燃尤?.5 mL 33%的醋酸，后加rBTI。對(duì)照組以100 μL的測(cè)活緩沖液代替rBTI。胰蛋白酶活力單位定義為410 nm處吸光度值每分鐘內(nèi)增加0.001。抑制1單位胰酶所需抑制劑的量定義為一個(gè)抑制活力單位。

rBTI濃度測(cè)定按照J(rèn)agota的方法進(jìn)行[13]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液，用Folin-酚法測(cè)定蛋白濃度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程y=0.001x+0.004 2（R2=0.996 1），式中：x為蛋白濃度，mg/mL；y為 410 nm 處吸光度值。測(cè)定rBTI反應(yīng)后的吸光度值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其濃度。

1.2.3 鱸魚(yú)魚(yú)糜凝膠的制備

將購(gòu)買(mǎi)的新鮮鱸魚(yú)處死并進(jìn)行預(yù)處理，去除魚(yú)鱗、魚(yú)鰭和魚(yú)皮，剔除可見(jiàn)的骨頭。將已處理好的魚(yú)肉放在絞肉機(jī)中初步斬拌3 min，加入食鹽（2.5%）及rBTI，rBTI濃度梯度為 0 ‰、0.02 ‰、0.04 ‰、0.08 ‰、0.12‰。再次使用高速組織勻漿機(jī)（16 000 r/min）進(jìn)行斬拌后，將鱸魚(yú)魚(yú)糜灌裝于直徑為2.5 mm的聚乙烯醇管中，1 500 r/min離心20 min，采用二段式加熱法進(jìn)行處理，即將魚(yú)糜于40℃水浴保溫30 min后轉(zhuǎn)入90℃水浴加熱20 min。完成后使用冰水迅速冷卻形成魚(yú)糜凝膠，置于4℃保存[14]。

1.2.4 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠蒸煮損失率的影響

將斬拌好的魚(yú)糜放置在離心管中1 500 r/min離心20 min，記離心后魚(yú)糜和聚乙烯醇管的總質(zhì)量為m，同1.2.3采用二段式水浴加熱，制成魚(yú)糜凝膠，在4℃下隔夜放置。取出后在室溫25℃下平衡4 h，將管重記為m1，將魚(yú)糜凝膠表面水分擦去，記其質(zhì)量為m2，按照公式（1）計(jì)算蒸煮損失率[15]。

式中：m為魚(yú)肉肉糜與聚乙烯醇管總質(zhì)量，g；m1為管重，g；m2為肉糜凝膠質(zhì)量，g。

1.2.5 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠白度的影響

參照Benjakul等[15]的方法將魚(yú)肉肉糜凝膠切成厚度為1.5 cm的小塊，使用分光測(cè)色儀對(duì)魚(yú)肉肉糜凝膠進(jìn)行白度分析。用黑白板對(duì)分光測(cè)色儀進(jìn)行校對(duì)后，測(cè)量魚(yú)肉肉糜凝膠的L*（亮度）值、a*（紅色/綠色）值和b*（黃色/藍(lán)色）值。每個(gè)試驗(yàn)組取3塊切割后的凝膠進(jìn)行測(cè)量，取平均值，按照公式（2）計(jì)算樣品白度值[16]。

式中：L*為亮度值；a*為紅色/綠色值；b*為黃色/藍(lán)色值。

1.2.6 rBTI對(duì)魚(yú)肉肉糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

將魚(yú)糜凝膠分切成邊長(zhǎng)為1.5 cm的正方體，用TMS-PRO食品物性分析儀對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.6.1 采用針型探頭測(cè)定樣品的穿刺力及黏附性

起始力：0.1N；穿刺速度：15mm/s；穿刺距離：5mm；回程速度：30 mm/s；回程距離：8 mm。

1.2.6.2 采用球型探頭測(cè)定凝膠硬度

起始力：0.1N；穿刺速度：15mm/s；穿刺距離：5mm；回程速度：30 mm/s；回程距離：8 mm。

1.2.7 rBTI對(duì)魚(yú)肉肉糜凝膠三氯乙酸-溶解肽的影響

參考Hartree等的方法測(cè)定凝膠三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-溶解肽含量[17]。取 1.1 g魚(yú)肉肉糜凝膠，加入10 mL剛配制好的三氯乙酸溶液（50 g/L），使用高速組織勻漿機(jī)22 000 r/min勻漿5 min后于4℃靜置1 h以溶解可溶性多肽，8 000 r/min離心20 min后，取上清液用Folin-酚法進(jìn)行多肽含量測(cè)定。

1.2.8 rBTI對(duì)魚(yú)肉肉糜凝膠蛋白的影響

參考Marino等的方法制備肉糜凝膠蛋白樣品[18]。取3.0 g魚(yú)糜凝膠，加入27 mL SDS溶液（50 g/L，85℃）。使用勻漿機(jī)以16 000 r/min的速度勻漿2 min，在85℃下浸提蛋白1 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。采用10%的分離膠和4%濃縮膠，濃縮膠和分離膠電壓分別為80 V與100 V。電泳停止后，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min，換脫色液，直至分離膠背景清晰后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 17.0進(jìn)行方法分析和顯著性檢驗(yàn)，多重比較采用Duncan檢驗(yàn)，P＜0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 rBTI的制備與純化

rBTI帶有His×6標(biāo)簽，可以用Ni2+親和柱純化，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 rBTI親和層析純化圖譜Fig.1 Affinity chromatography of rBTI

按照1.2.2方法對(duì)各蛋白峰抑制活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)蛋白峰1和2無(wú)抑制活性，而蛋白峰3抑制活性很強(qiáng)，對(duì)胰蛋白酶的抑制率達(dá)80%，表明穿透峰1和80 mmol/L咪唑洗脫下的均為雜蛋白，300 mmol/L咪唑洗脫下的為目的蛋白。對(duì)純化后的rBTI進(jìn)行了SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 rBTI的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE pattern of rBTI

在SDS-PAGE圖譜上僅出現(xiàn)一個(gè)蛋白條帶，表明經(jīng)Ni2+親和柱一步純化，便得到了高純度的rBTI（表觀(guān)純度＞95%）。

2.2 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠蒸煮損失率的影響

蒸煮損失率是評(píng)判肉糜凝膠持水性好壞的重要指標(biāo)，rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠蒸煮損失率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著rBTI添加量的增加，凝膠的蒸煮損失率呈逐步下降的趨勢(shì)。當(dāng)rBTI添加量為0.02‰時(shí)，魚(yú)糜凝膠的蒸煮損失率即發(fā)生了顯著下降（P＜0.05），繼續(xù)增加rBTI添加量至0.04‰，蒸煮損失率雖有下降趨勢(shì)，但變化不明顯（P＞0.05）。再繼續(xù)增加rBTI添加量，蒸煮損失率顯著下降（P＜0.05），當(dāng)添加量為0.12‰時(shí)，魚(yú)糜凝膠的蒸煮損失率從對(duì)照組的3.3%下降至1.68%。以上結(jié)果表明添加rBTI能有效降低魚(yú)糜凝膠的蒸煮損失率，提高凝膠的持水性。其原因可能是rBTI改善了魚(yú)糜凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使結(jié)構(gòu)變得緊密，從而保留了更多的水分。

圖3 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠蒸煮損失率的影響Fig.3 Effect of rBTI on the cooking loss rate of surimi gel

2.3 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠白度的影響

rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠白度的影響見(jiàn)圖4。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。圖4 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠白度的影響Fig.4 Effect of rBTI on gel whiteness of surimi gel

由圖4可知，改變r(jià)BTI添加量對(duì)魚(yú)糜凝膠的白度值并未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。目前常用于凝膠的添加劑如淀粉、魔芋膠等，在加工過(guò)程中易產(chǎn)生褐變，嚴(yán)重影響產(chǎn)品白度[19]。本試驗(yàn)中所用rBTI為純品，而且rBTI對(duì)熱穩(wěn)定，在加工過(guò)程中不會(huì)發(fā)生褐變反應(yīng)，不會(huì)改變凝膠本身的色素累積，能很好地保留魚(yú)糜凝膠的白度值。

2.4 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠穿刺力的影響

rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠穿刺力的影響見(jiàn)圖5。

圖5 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠穿刺力的影響Fig.5 Effect of rBTI on gel penetration force of surimi gel

由圖5可知，隨著rBTI添加量的增大，魚(yú)糜凝膠的穿刺力會(huì)逐漸提高。當(dāng)rBTI添加量為0.02‰時(shí)，凝膠的穿刺力較未添加rBTI組有所提高，但并未表現(xiàn)出顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)rBTI添加量達(dá)到0.04‰時(shí)，凝膠的穿刺力較未添加rBTI組顯著提高（P＜0.05）。隨著rBTI添加量增加，魚(yú)糜凝膠的穿刺力提高，表明rBTI可以提高肉糜凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的緊密度。rBTI添加量為0.04‰、0.08‰以及0.12‰三組之間的穿刺力沒(méi)有出現(xiàn)顯著差別（P＞0.05），因此rBTI添加量為0.04‰時(shí)即可有效改善魚(yú)糜凝膠的穿刺力。

2.5 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠黏附性的影響

rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠黏附性的影響見(jiàn)圖6。

圖6 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠黏附性的影響Fig.6 Effect of rBTI on gel adhesion of surimi gel

由圖6可知，隨著rBTI使用量的增大，魚(yú)糜凝膠的黏附性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。在黏性下降階段，魚(yú)糜凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定較差，在黏性上升階段，凝膠結(jié)構(gòu)逐步緊密而穩(wěn)定，品質(zhì)得到改善。rBTI添加量在0‰～0.04‰時(shí)，魚(yú)糜凝膠的黏附性呈下降趨勢(shì)。與未添加rBTI組相比，當(dāng)rBTI含量為0.02‰時(shí)，凝膠的黏附性有所降低，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），當(dāng)rBTI添加量為0.04‰時(shí)，出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)rBTI添加量在0‰～0.04‰時(shí)，魚(yú)糜凝膠的劣化作用大于rBTI對(duì)內(nèi)源酶的抑制作用，凝膠的劣化作用為主要優(yōu)勢(shì)，劣化使得肉糜凝膠內(nèi)部黏性降低。rBTI添加量在0.04‰～0.12‰時(shí)，魚(yú)糜凝膠的黏附性呈上升趨勢(shì)。rBTI添加量為0.08‰時(shí)，凝膠的黏附性雖有提高，但較0.04‰組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），然而當(dāng)rBTI添加量提高至0.12‰時(shí)，凝膠黏附性較0.04‰組及0.08‰顯著增高（P＜0.05），表明當(dāng)rBTI添加量大于0.04‰，尤其添加量為0.12‰時(shí)，魚(yú)糜凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的緊密度顯著提高。因此，隨著rBTI添加量增加，提高了蛋白質(zhì)的黏結(jié)作用，表現(xiàn)為凝膠黏附性增大。

2.6 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響

rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖7。

圖7 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of rBTI on the strength of surimi gel

由圖7可知，當(dāng)rBTI添加量為0.02‰時(shí)，魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度由1.017 N提高至1.196 N，較未添加rBTI組顯著提高（P＜0.05），表明添加rBTI能夠提高魚(yú)糜凝膠的凝膠強(qiáng)度。當(dāng)rBTI添加量為0.02‰、0.04‰、0.08‰時(shí)，凝膠強(qiáng)度有所提高，但差異不顯著（P＞0.05），表明這3組rBTI添加量對(duì)魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度的影響作用相似。研究表明，黃鰭金槍魚(yú)魚(yú)子中提取的一種胰蛋白酶抑制劑、牛血清蛋白和卵清蛋白均能提高魚(yú)糜凝膠的強(qiáng)度[20]。

2.7 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠TCA-溶解肽的影響

在肉糜凝膠加工過(guò)程中，溫度、內(nèi)源酶等均會(huì)引起蛋白質(zhì)降解，尤其在40℃保溫時(shí)，降解作用加劇[21]。三氯乙酸（TCA）-溶解肽的含量可以反映肉糜凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)的降解情況，rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠TCA-溶解肽含量的影響見(jiàn)圖8。

圖8 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠TCA-溶解肽含量的影響Fig.8 Effect of rBTI on the content of TCA-dissolved peptide in surimi gel

由圖8可知，TCA-溶解肽含量隨著rBTI添加量的增多呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明添加rBTI可以抑制內(nèi)源酶對(duì)魚(yú)糜凝膠內(nèi)部蛋白質(zhì)的降解。當(dāng)rBTI添加量為0.02‰時(shí)，凝膠TCA-溶解肽含量較未添加rBTI組下降了 96 μg/mL，差異顯著（P＜0.05），表明 rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠內(nèi)源酶抑制效果顯著。當(dāng)rBTI添加量由0.04‰增加至0.12‰時(shí)，TCA-溶解肽含量變化不明顯，表明rBTI添加量為0.04‰時(shí)對(duì)魚(yú)糜凝膠內(nèi)源酶的抑制作用已達(dá)最大程度。

2.8 魚(yú)糜凝膠的SDS-PAGE分析

肌原纖維蛋白是維持肉糜凝膠結(jié)構(gòu)的主要蛋白質(zhì)，如肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC，分子質(zhì)量為200 kDa）及肌動(dòng)蛋白（actin，分子質(zhì)量為43 kDa）等對(duì)凝膠的形成及穩(wěn)定有重要影響。對(duì)魚(yú)糜凝膠蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 不同rBTI添加量魚(yú)糜凝膠蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.9 SDS-PAGE pattern of surimi gel added with rBTI at different levels

隨著rBTI添加量的增多，魚(yú)糜凝膠中的肌球蛋白重鏈以及肌動(dòng)蛋白明顯增多。SDS-PAGE結(jié)果與TCA-溶解肽結(jié)果一致，添加rBTI抑制了魚(yú)肉肉糜中內(nèi)源酶的活性，減弱了酶對(duì)肌肉纖維蛋白的水解，TCA-溶解肽含量較對(duì)照組降低。同時(shí)，更多肌肉纖維蛋白的保留有利于魚(yú)糜凝膠的形成及維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，凝膠穿刺力及強(qiáng)度等指標(biāo)較對(duì)照組顯著提高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)及親和層析獲得了高純度的rBTI，檢測(cè)了rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠蒸煮損失率、白度、穿刺力、黏附性及凝膠強(qiáng)度的影響，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明，rBTI對(duì)魚(yú)糜凝膠的白度無(wú)顯著影響，可以有效降低蒸煮損失率，提高保水性，并改善凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。綜合白度值、穿刺力、強(qiáng)度、TCA-溶解肽含量等指標(biāo)，得出rBTI為0.04‰是最適合的添加量。通過(guò)TCA-溶解肽含量測(cè)定及SDSPAGE試驗(yàn)，分析rBTI通過(guò)抑制內(nèi)源酶對(duì)肌球蛋白的降解從而維持魚(yú)肉肉糜凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。魚(yú)糜在70℃保溫時(shí)易形成劣化凝膠，嚴(yán)重降低凝膠品質(zhì)。rBTI有極好的耐熱性，對(duì)類(lèi)胰蛋白酶有較強(qiáng)的抑制作用，今后可進(jìn)一步研究rBTI對(duì)凝膠劣化的抑制作用及條件。

傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)理論認(rèn)為蛋白酶抑制劑是抗?fàn)I養(yǎng)因子，有關(guān)蛋白酶抑制劑的報(bào)道多集中于對(duì)其滅活方法的研究[22]。然而，如今膳食中蛋白質(zhì)普遍過(guò)剩，少量抑制劑引起的營(yíng)養(yǎng)素吸收降低并不會(huì)妨礙人體健康，迄今為止還未有研究證明少量的蛋白酶抑制劑對(duì)人體有害。越來(lái)越多的報(bào)道表明蛋白酶抑制劑是膳食中重要的活性成分[23]。本文研究蛋白酶抑制劑對(duì)肉糜凝膠的影響及機(jī)理，拓寬了蛋白酶抑制劑的應(yīng)用渠道，為鱸魚(yú)魚(yú)糜制品的開(kāi)發(fā)提供了新的思路。