劉敏敏，席茂盛，李中媛，宋亞囝，張同存，羅學(xué)剛，*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津300457）

近年來(lái)，植物乳桿菌作為一種益生菌頻繁出現(xiàn)在大眾視野，已被用于多種發(fā)酵食品的手工和工業(yè)生產(chǎn)中，其產(chǎn)品也逐漸受到廣大消費(fèi)者的青睞。同時(shí)，植物乳桿菌已被允許開發(fā)不同的益生菌配方，其抗菌特性對(duì)食品安全也有顯著效果[1-2]。植物乳桿菌既可以天然存在形式參與傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程，也可以純種發(fā)酵劑形式添加到現(xiàn)代發(fā)酵工藝中[3]，其制品在生產(chǎn)、運(yùn)輸及使用過(guò)程中不可避免地會(huì)受到各種環(huán)境所帶來(lái)的影響，例如傳統(tǒng)食品發(fā)酵就要在相對(duì)寒冷的條件下進(jìn)行[4]。而在這些發(fā)酵食品生產(chǎn)過(guò)程中處在低溫環(huán)境中的乳酸菌起著至關(guān)重要的作用，不僅如此，定植腸道活菌數(shù)要求高于106CFU/mL才能發(fā)揮其益生效果[5]。因此研究植物乳桿菌的凍干保護(hù)及抗冷凍對(duì)其實(shí)際應(yīng)用有著重要意義。

真空冷凍干燥是在真空條件下進(jìn)行的，使凍結(jié)物料中的固態(tài)水升華從而被除去的一種高效干燥方法，常用于乳品發(fā)酵劑的工業(yè)化制備，通過(guò)真空冷凍干燥既能保持產(chǎn)品的優(yōu)良特性，又能達(dá)到快速干燥的效果[6]。然而，低溫會(huì)影響乳酸菌有關(guān)營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸?shù)哪ち鲃?dòng)性發(fā)生變化，使細(xì)胞代謝的酶活性降低及翻譯過(guò)程的RNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性發(fā)生變化，所有這些都將進(jìn)一步影響細(xì)菌的存活率[7]。因此選用合理的凍干保護(hù)劑就成為解決問題的關(guān)鍵手段[8-9]。通常來(lái)講，凍干保護(hù)劑可分為兩種：一種是分子量較小的化合物如氨基酸、低分子的糖類和糖醇類等；另一種是分子量較大的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、以及其他的合成聚合物等[10-12]。通過(guò)將不同分子量的化合物進(jìn)行組合復(fù)配往往可以實(shí)現(xiàn)更好的保護(hù)效果[13]。

植物乳桿菌CGMCC8198是本課題組前期篩選獲得的一株對(duì)人體健康有促進(jìn)作用的乳酸菌，已被證明具有很好的降血糖、降血脂、美白等功效[14-15]。本試驗(yàn)以植物乳桿菌CGMCC8198作為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)探究保護(hù)劑對(duì)菌體存活率的影響，然后選擇不同的水平組合采用正交試驗(yàn)方法對(duì)復(fù)合凍干保護(hù)劑進(jìn)行分析得出最優(yōu)配方，通過(guò)細(xì)胞流式術(shù)對(duì)發(fā)酵劑的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)[16-19]，并進(jìn)一步對(duì)凍干菌粉的活性進(jìn)行探究，旨在為植物乳桿菌的冷凍干燥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC8198：天津科技大學(xué)微生態(tài)與分子藥理研究室-80℃保藏。

1.1.2 試劑

濃縮乳清蛋白粉（食品級(jí)）、木糖醇、殼寡糖、氯化鈉、磷酸二氫鈉、戊二醛、無(wú)水乙醇（均為分析純）：天津市江天化工有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：海博生物技術(shù)有限公司；碘化丙啶（propidium Iiodide，PI）、5（6）-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯[（6）-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CFSE]、胰蛋白酶 （250 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）均為生物試劑：天津索羅門生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YQX-III厭氧培養(yǎng)箱：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；Alpha 2-4 LD plus快速冷凍干燥機(jī)：德國(guó)chirst公司；FEI-Apreo場(chǎng)發(fā)射高分辨掃描電子顯微鏡：美國(guó)捷克公司；CR21G高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；C6多功能細(xì)胞分析儀：美國(guó)Accuri公司；ZWYRD2401恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液及其他溶液的制備

將植物乳桿菌CGMCC8198以2%的接種量接種于加有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中過(guò)夜；取菌液收集到離心管中，4℃條件下6 000 r/min離心10 min，棄掉上清液；用0.9%生理鹽水補(bǔ)充至離心前體積，重復(fù)離心3次收獲菌泥，將菌泥懸浮于生理鹽水中，最終體積為原發(fā)酵液體積的1/10，制成菌懸液。

模擬人工胃液[20]：用50%的鹽酸將無(wú)菌水調(diào)至不同pH 值，分別為 2.0、2.5、3.0，經(jīng) 115 ℃高壓滅菌 20 min，冷卻后加入10 g/L胃蛋白酶，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，制得 pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0 的人工胃液。

模擬人工腸液[20]：稱取磷酸二氫鉀6.8 g溶于無(wú)菌水，調(diào)節(jié)pH值為7.4，115℃高壓滅菌20 min，冷卻后加入10 g/L胰蛋白酶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除菌備用。

1.3.2 真空冷凍干燥

將菌懸液與配制的保護(hù)劑按體積比1∶3的比例混合均勻后分裝于凍干瓶中，裝樣高度為0.3 cm～0.4 cm，在-80℃冰箱預(yù)凍24 h以上。待快速冷凍干燥機(jī)開機(jī)預(yù)冷1 h后迅速將預(yù)凍好的樣品放置物料盤內(nèi)，期間應(yīng)確保樣品不回融。在冷凍干燥機(jī)蓋好后，開始抽真空，進(jìn)入真空冷凍干燥。約24 h之后，冷凍干燥過(guò)程結(jié)束；將凍干樣品取出后放于干燥處保藏備用。

1.3.3 活菌數(shù)及凍干存活率的測(cè)定

將凍干菌粉用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）復(fù)水至凍干前體積，以10的倍數(shù)依次遞增稀釋，取 3 個(gè)合適的稀釋度（10-8、10-9、10-10），吸取50 μL的菌液于MRS固體培養(yǎng)基涂布均勻，每個(gè)稀釋度作3個(gè)平行，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，計(jì)數(shù)。

式中：N0為凍干菌粉復(fù)水至原菌液體積后的活菌數(shù)，CFU/mL；N為凍干前原菌液?jiǎn)挝惑w積活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在濃縮乳清蛋白粉和殼寡糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%和4%的條件下，選定木糖醇添加量依次為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%5個(gè)水平，以凍干后的存活率為檢測(cè)指標(biāo)，得到木糖醇在復(fù)合保護(hù)劑中最佳的添加量；在木糖醇和殼寡糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%和4%的條件下，選定濃縮乳清蛋白粉添加量依次為5%、10%、15%、20%、25%5個(gè)水平，以凍干后的存活率為檢測(cè)指標(biāo)，得到濃縮乳清蛋白粉在復(fù)合保護(hù)劑中最佳的添加量；在木糖醇和濃縮乳清蛋白粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%和10%的條件下，選定殼寡糖添加量依次為2%、4%、6%、8%、10%5個(gè)水平，以凍干后的存活率為檢測(cè)指標(biāo)，得到殼寡糖在復(fù)合保護(hù)劑中最佳的添加量。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行三因素試驗(yàn)，各因素分別設(shè)計(jì)3個(gè)水平，研究木糖醇（A）、濃縮乳清蛋白粉（B）和殼寡糖（C）質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)凍干存活率的影響。各因素試驗(yàn)水平如表1所示。

表1 凍干保護(hù)劑正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor level of orthogonal test for freeze-dried protective agent

1.3.6 場(chǎng)發(fā)射高分辨掃描電鏡分析

將添加不同保護(hù)劑的凍干菌粉分別用導(dǎo)電膠固定于樣品臺(tái)，噴金后置入場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡內(nèi)，進(jìn)行電鏡觀察并拍照。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)分析菌粉活力

將凍干菌粉用0.1 mol/L的PBS復(fù)水，4℃條件下12 000 r/min離心2 min，收集菌體；洗滌2次后重懸于PBS中，將菌懸液濃度控制在1×106CFU/mL：分別取1 mL菌懸浮液置于100℃水浴30 min，熱處理殺死所有菌體，與1 mL新鮮菌體懸浮液混合；取100 μL加到896 μL 的 PBS 中，然后分別加入 2 μL PI和 2 μL CFSE于37℃避光孵育15 min；用于評(píng)價(jià)兩種染液區(qū)分死活細(xì)菌的效果。優(yōu)化后的凍干菌粉用同樣的方法處理。

1.3.8 凍干菌粉的耐受性測(cè)試

取0.01 g凍干菌粉加入裝有10 mL人工胃液的試管中，于37℃搖床振蕩處理2 h；取樣計(jì)數(shù)。另取0.1 mL菌液作對(duì)照。

取0.01 g凍干菌粉加入裝有10 mL人工腸液的試管中，于37℃搖床振蕩處理，每隔20 min取樣計(jì)數(shù)，持續(xù)2 h。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用originpro9.1作圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 單因素試驗(yàn)

探究在凍干保護(hù)劑中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的木糖醇、濃縮乳清蛋白粉及殼寡糖對(duì)植物乳桿菌CGMCC8198凍干存活率的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1a可知，凍干保護(hù)劑中木糖醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，凍干存活率達(dá)到最大值。之后隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高凍干存活率降低，可能是由黏度升高造成菌體分布不均勻?qū)е?。而在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)發(fā)生一定程度下降，其原因應(yīng)該是由于質(zhì)量分?jǐn)?shù)太低無(wú)法對(duì)菌體起到充分保護(hù)效果所引起的。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選取木糖醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由圖1b可知，凍干保護(hù)劑中濃縮乳清蛋白粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%～15%范圍內(nèi)凍干存活率持續(xù)升高，在此之后略有下降，但程度并不明顯基本保持在一定范圍內(nèi)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果并考慮經(jīng)濟(jì)因素，選取濃縮乳清蛋白粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由圖1c可知，凍干保護(hù)劑中殼寡糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%～8%范圍內(nèi)，凍干存活率隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而升高，且在8%時(shí)達(dá)到最大值。在10%時(shí)，凍干存活率發(fā)生一定程度的下降。最后根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選取殼寡糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of single factor test

2.1.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以菌體凍干存活率為響應(yīng)值，對(duì)復(fù)合凍干保護(hù)劑的配方進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表2。

表2 凍干存活率正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 2 Orthogonal test results and range analysis of freeze-dried survival rate

從極差分析結(jié)果得出，三因素影響順序?yàn)锽＞C＞A，即凍干保護(hù)劑中濃縮乳清蛋白粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)凍干存活率的影響最大，其次分別為殼寡糖和木糖醇。最佳的物料配比組合為A3B2C1，即木糖醇1.5%、濃縮乳清蛋白粉15%、殼寡糖6%

凍干存活率方差分析見表3。

表3 凍干存活率方差分析Table 3 Variance analysis of freeze-dried survival rate

從方差分析結(jié)果得出，試驗(yàn)所選修正模型P值0.043＜0.05，說(shuō)明模型對(duì)實(shí)際情況具有代表性。3個(gè)變量木糖醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、濃縮乳清蛋白粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和殼寡糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均對(duì)凍干存活率產(chǎn)生顯著性影響，且濃縮乳清蛋白粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)產(chǎn)生影響最大。三因素對(duì)凍干存活率的影響順序?yàn)闈饪s乳清蛋白粉（B）＞殼寡糖（C）＞木糖醇（A），這與正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果一致。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳工藝條件下，即凍干保護(hù)劑中木糖醇、濃縮乳清蛋白粉及殼寡糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%、15%及6%，菌體的凍干存活率達(dá)到84.90%，高于正交試驗(yàn)中各試驗(yàn)組。由此可得菌體在最優(yōu)凍干保護(hù)劑的保護(hù)下經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥后仍能保持較高的存活率。

2.2 電鏡掃描結(jié)果

將按最優(yōu)比添加單一保護(hù)劑和復(fù)合保護(hù)劑的凍干菌粉在場(chǎng)發(fā)射高分辨掃描電鏡下放大5 000倍，觀察菌粉的結(jié)構(gòu)見圖2。

由圖2d可以看出添加復(fù)合保護(hù)劑組凍干菌粉表面相對(duì)光滑，個(gè)體完整且無(wú)致密小孔，相對(duì)未添加保護(hù)劑組結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定且均勻，對(duì)菌體能形成完整的保護(hù)，使細(xì)胞免受低溫的破壞；而添加單一保護(hù)劑的凍干菌粉大多呈疏松結(jié)構(gòu)，表面粗糙且多褶皺、多孔洞、多塌陷、無(wú)規(guī)則，部分結(jié)構(gòu)較松散，沒有形成完整的屏障。結(jié)果表明添加復(fù)合保護(hù)劑的凍干菌粉結(jié)構(gòu)更平整，對(duì)菌體包裹效果更完全，在凍干過(guò)程中可能會(huì)起到更好的保護(hù)作用。

2.3 細(xì)胞流式術(shù)評(píng)價(jià)菌粉活性

圖2 添加不同保護(hù)劑的凍干菌粉掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope of freeze-dried bacterial powder with different protective agents

為了證明PI-CFSE雙染色能夠區(qū)分不同生理狀態(tài)下的植物乳桿菌CGMCC8198菌體，首先對(duì)50%的活菌和50%死菌混合樣品進(jìn)行流式細(xì)胞分析，得到的熒光信號(hào)圖見圖3。

圖3 PI-CFSE雙染色熒光信號(hào)圖Fig.3 The graph of PI-CFSE double staining fluorescence signal

根據(jù)染色特征菌體被分在4個(gè)不同的區(qū)域，位于熒光信號(hào)圖左上區(qū)域反映的是被PI標(biāo)記的死菌數(shù)約占45.33%，而右下區(qū)域反映的是CFSE標(biāo)記的活菌數(shù)約占40.26%；未被染色的菌體只占到總數(shù)的0.51%。結(jié)果表明，PI-CFSE雙染色可以很好的區(qū)分不同生理狀態(tài)下的植物乳桿菌CGMCC8198菌體。

對(duì)添加復(fù)合保護(hù)劑的凍干菌粉進(jìn)行分析見圖4。

圖4a和圖4b分別為植物乳桿菌CGMCC8198凍干前后菌體PI-CFSE雙染色熒光信號(hào)圖。比較可以得出，凍干后的菌體活性發(fā)生一定程度下降，表現(xiàn)在凍干后右下象限細(xì)胞的相對(duì)比例減少，而在左上和右上象限細(xì)胞明顯增加，凍干前后菌體活性表見表4。

圖4 凍干前后菌體活性圖Fig.4 Bacterial activity diagram before and after freeze-drying

表4 凍干前后菌體活性表Table 4 Cell activity before and after lyophilization

由表4可知，相較不加保護(hù)劑的全無(wú)活性還是表現(xiàn)出較大差異，約80.47%的活性得到保持，表明該復(fù)合保護(hù)劑會(huì)起到一定程度的保護(hù)效果。

2.4 凍干菌粉在模擬人工胃液和模擬人工腸液中的耐受性

凍干菌粉在不同pH值模擬胃液中的存活率如表5所示。

表5 凍干菌粉耐酸存活率對(duì)比Table 5 Comparison of acid-resistant survival rate of freezedried fungus powder

由表5可以看出，在不同pH值情況下，保護(hù)劑組的存活率都明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明該復(fù)合保護(hù)劑在酸性條件下也會(huì)對(duì)菌體起到保護(hù)作用，但仍有較大的提升空間。

凍干菌粉在模擬腸液的活菌數(shù)變化如圖5所示。

圖5 凍干菌粉在模擬腸液中的活菌數(shù)變化Fig.5 Changes of viable bacterial count of freeze-dried bacterial powder in simulated intestinal juice

圖5可以看出，凍干菌粉在模擬腸液處理80 min后活菌數(shù)基本保持穩(wěn)定，可達(dá)到3.40×108CFU/mL，表明該菌粉具有較好的腸溶性。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素、正交試驗(yàn)確定了植物乳桿菌CGMCC8198凍干制劑中復(fù)合保護(hù)劑的優(yōu)化配方為濃縮乳清蛋白15%、殼寡糖6%及木糖醇1.5%。在此條件下，場(chǎng)發(fā)射高分辨電鏡及掃描流式細(xì)胞術(shù)分析顯示該復(fù)合保護(hù)劑具有很好的保護(hù)效果。耐受性試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)優(yōu)化后的凍干菌粉具有較好的耐酸性及腸溶性。綜上所述，本研究結(jié)果為該菌株在功能性食品方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。