陳柳冰?陳潮金?黑子清?羅晨芳

【摘要】目的 構建小鼠過表達GJB1基因的重組腺相關病毒（rAAV）載體，建立一種小鼠腎臟過表達GJB1基因的動物模型。方法 采用PCR擴增制備小鼠GJB1基因片段，利用基因重組技術構建含GJB1基因的重組質(zhì)粒，將攜帶小鼠GJB1基因的腺相關病毒（AAV）穿梭質(zhì)粒與pAAV-RC、pHelper共轉(zhuǎn)染AAV-293 細胞，通過選擇培養(yǎng)基篩選出同源重組的陽性克隆獲得rAAV。將30只成年C57BL/6J雄性小鼠隨機分為5組各6只（W1組、W2組、W3組、W4組及空白對照組），經(jīng)尾靜脈將rAAV注射到W1 ～ W4組小鼠體內(nèi)，分別于注射后1周、2周、3周、4周取其心臟、肝臟、腎臟組織行PCR檢測GJB1 mRNA的表達情況，并經(jīng)石蠟包埋切片后采用免疫組織化學法檢測Cx32的表達。結果 含GJB1基因的rAAV被成功構建。隨著注射后時間的延長，小鼠腎臟組織GJB1基因轉(zhuǎn)錄及Cx32蛋白表達強度均逐漸增強，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P均 < 0.05），而其他器官（肝臟、心臟）GJB1基因表達未見明顯增強（P均 > 0.05）。

結論 采用rAAV技術可成功構建腎臟過表達GJB1基因的小鼠模型，這對深入研究GJB1基因在腎損傷中的作用機制、評估以GJB1為治療靶點的藥物療效等具有重要的科學價值和臨床意義。

【關鍵詞】GJB1基因;重組腺相關病毒;急性腎損傷;小鼠模型

Establishment of mouse models of renal overexpression of GJB1 gene Chen Liubing， Chen Chaojin， Hei

Ziqing， Luo Chenfang. Department of Anesthesiology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guang-zhou 510630， China

Corresponding author， Luo Chenfang， E-mail： 15975604518@ 139. com

【Abstract】Objective To construct a recombinant adeno-associated virus vector （rAAV） overexpressing GJB1 gene， and to establish a mouse model overexpressing GJB1 gene in the kidney. Methods GJB1 gene fragment was amplified by PCR. Recombinant plasmids containing GJB1 gene were constructed by gene recombination technology. AAV carrying GJB1 gene was co-transfected with pAAv-RC and pHelper into AAV-293 cells. Homologous recombinant postive clones were screened to obtain rAAV. Thirty adult male C57BL/6J mice were randomly divided into five groups （W1， W2， W3， W4 and blank control groups）， six in each group. rAAV was injected into the mice in the W1-W4 groups through the tail vein. The heart， liver and kidney tissues were taken at 1-， 2-， 3- and 4-week after injection， respectively. The expression level of GJB1 mRNA ws quantitatively measured by PCR. The expression level of Cx32 mRNA was detected by immunohistochemistry after paraffin embedded sections. Results The rAAV containing GJB1 gene was successfully constructed. With the prolonged time after injection， the GJB1 gene transcription and expression intensity of GJB1 protein in renal tissues were gradually increased， which significantly differred from those in the blank control group （both P < 0.05）. However， the expression intensity of GJB1 gene in other organs， such as liver and heart， did not increase significantly （all P > 0.05）. Conclusions The mouse model with kidney-specific over-expression of GJB1 gene can be successfully constructed by the rAAV technology， which has important scientific value and clinical significance for in-depth study of the mechanism of GJB1 gene in renal injury and for the evaluation of drug efficacy with GJB1 as the therapeutic target.

【Key words】GJB1 gene;Recombinant adeno-associated virus;Acute kidney injury;Mouse model

目前，腎臟疾病已成為危害民眾健康、耗費巨大衛(wèi)生資源的全球性的公共健康問題之一，其治療也成為了目前世界衛(wèi)生領域迫切需要解決的一個難題。急性腎損傷（AKI）的發(fā)病率和病死率近幾十年仍居高不下，可增加慢性腎臟?。–KD）的發(fā)病風險，具有潛在惡化性，甚至會進展為終末期腎病（ESRD）[1-2]。較多原因可引發(fā)AKI，以缺血再灌注損傷最為常見，但目前AKI的具體發(fā)病機制尚未完全闡明，而且缺乏有效的防治手段[3]。因此，深入探討AKI的機制，尋找減輕腎損傷的方法，是目前圍術期器官功能保護領域亟待解決的重要問題。

Connexin （Cx）蛋白是一種特殊的通道蛋白，由其組成的縫隙連接（GJ）是細胞間直接通訊的重要方式，其傳遞的信號參與和介導了細胞的增殖、分化、遷移、凋亡等一系列過程，對于各種生命活動具有重要意義[4-5]。由Cx32蛋白組成的GJ不僅參與了腎素的分泌、腎血流量的控制以及腎小球濾過率等多種生理功能的調(diào)節(jié)，而且與腎臟缺血再灌注損傷后的腎臟病理性重構密切相關[6]。我們在前期研究中已通過多個AKI的動物模型發(fā)現(xiàn)，圍術期AKI嚴重程度與Cx32蛋白的表達變化高度一致，抑制Cx32蛋白的功能后，腎損傷的程度明顯減輕[7-9]。這一結果提示我們，由Cx32所介導的“旁細胞效應”在圍術期AKI的過程中可能起至關重要的作用。為了更好地探究GJB1/Cx32在腎臟疾病中的作用，我們團隊已經(jīng)構建了GJB1全基因敲除小鼠模型，為深入研究腎損傷的發(fā)病機制、臨床治療提供了重要的試驗動物模型。但是，全身性的基因敲除可能引起全身性GJ功能失調(diào)、潛在的MODS，難以特異性再現(xiàn)腎臟GJB1基因參與AKI的過程和相應細胞病理變化等缺陷。

腺相關病毒（AAV）是一種安全、持久、高效、高特異性的基因操作工具，重組腺相關病毒（rAAV）技術已被廣泛應用于多種基因轉(zhuǎn)導和基因治療中[10]。為了更好地闡明GJB1基因在AKI及CKD中的作用，我們團隊初次構建了腎臟高表達GJB1基因的小鼠模型， 并在此基礎上通過一系列改進，摸索出了更好的給藥劑量以及注射方法，對深入研究GJB1基因在腎損傷中的作用及機制、評估以GJB1/Cx32為靶點的治療藥物等的療效具有重要的科學價值和臨床意義。

材料與方法

一、材 料

1. 實驗動物

30只SPF級8 ～ 10周齡的雄性 C57BL/6小鼠（合格證編號44007200051845）由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供[SCXK（粵）2013-0002]，體質(zhì)量為20 ～ 25 g。動物模型的構建及標本的采集均在中山大學附屬第三醫(yī)院內(nèi)完成[SYXK （粵） 2017-0083]。動物按照每籠6只群養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24 ～ 26℃，相對濕度為60%，光暗間隔為12 h，允許動物自由攝食飲水。本研究方案經(jīng)中山大學實驗動物倫理委員會審查批準。

2. 試劑及儀器

主要試劑包括：磷酸鹽緩沖液（PBS）及DMEM不完全高糖培養(yǎng)液（江蘇凱基公司），胎牛血清（Gibco公司），質(zhì)粒pAAV-GV388、pAAV-RC、pHelper、細胞系AVV-293（上海吉凱基因科技有限公司），1 kp DNA ladder Marker（Fermentas公司），250 bp DNA ladder Marker（捷瑞公司），瓊脂糖（賽百盛公司），In-Fusion? PCR 克隆試劑盒（Clontech公司），Taq聚合酶（SinoBio公司），dNTP（Takara公司），限制性內(nèi)切酶（NEB公司），質(zhì)粒抽提試劑盒（Promega公司），DNA凝膠回收試劑盒（天根生化公司），RNA提取試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司），PCR引物（捷瑞公司），其中GJB1基因引物1序列為5-GGAGGTAGTGGAATGGATCCCGCCACCATGAACTGGACAGGTCTATACAC-3，引物2序列為5-TCACCATGGTGGCGGGATCGCAGGCTGAGCATCGGTCGCTC-3。主要儀器包括：PCR儀（Applied Biosystems公司），穩(wěn)壓DNA電泳儀（BioRad公司），高速離心機（日立公司），凝膠成像儀（天能公司），Gilson移液器（吉爾森公司），細菌搖床（華利達實驗設備公司），細菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

二、方 法

1. rAAV的構建與篩選

根據(jù)小鼠GJB1 （NM_001302496） 基因cDNA的序列，設計合成含有同源重組序列及酶切位點的擴增引物序列：GJB1（41304-1）-P1，5-GGA GGTAGTGGAATGGATCCCGCCACCATGAACTGGACAGGTCTATACAC-3;GJB1（41304-1）-P2，5-TCACCATGGTGGCGGGATCGCAGGCTGAGCATCGGTCGCTC-3。利用PCR儀進行PCR反應擴增GJB1 DNA片段。PCR產(chǎn)物大小為895 bp。利用Northern blot檢測PCR擴增得到的產(chǎn)物。利用 BamHⅠ消化AAV載體GV388獲得線性化載體，利用Northern blot檢測酶切結果。參照GV388載體說明書構建反應體系，完成GV388線性載體與GJB1基因片段的環(huán)化，構建GJB1基因過表達AAV載體，并利用Northern blot檢測構建后的線性化表達載體，引物序列分別為：Globin-F，5-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3;pEG FP-N-3，5-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3。

2. GJB1基因過表達AAV載體轉(zhuǎn)染與篩選

將3×106 個AAV-293 細胞接種到培養(yǎng)皿中，并加入10 ml含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃含5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合達到70% ～ 80% 時，用提取的含GJB1基因的AAV質(zhì)粒載體同 pHelper、pAAV-RC共轉(zhuǎn)染進 AAV-293細胞，培養(yǎng)72 h后收集帶有GJB1基因的AAV。

3. AAV 病毒的濃縮及純化

收集成功轉(zhuǎn)染的細胞與其培養(yǎng)基一同高速離心，去除上清液后用 1 ml PBS重懸細胞。重懸后的細胞在干冰乙醇浴和37℃水浴中反復凍融4次。凍融結束后以9708轉(zhuǎn)/分離心，并將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中。加入40% 的聚乙二醇8000后于冰上放置 2 h，以4854轉(zhuǎn)/分離心 30 min并去除上清液。用PBS重懸沉淀物。以5317轉(zhuǎn)/分離心 30 min后將上清液移至新的EP管中。加入Benzonase 核酸酶37℃ 孵育 30 min。過濾后往濾液中添加氯化銫（CsCl）直到密度為1.41 g/ml（折射率為1.372）并振蕩使之充分溶解。將樣品置于超速離心管中以41 200轉(zhuǎn)/分離心24 h，形成密度梯度。收集不同密度的樣品并進行滴度測定。

4. 超濾脫鹽及保存

于Amicon-15 超濾裝置中加入4 ml去離子水，將病毒液加入超濾裝置中，并加入PBS使其總體積達到4 ml。以3760轉(zhuǎn)/分離心10 min，直到最終體積為250 μl，加入PBS 稀釋濃縮后的病毒使其體積為4 ml。重復上述過程3次，使最終體積約為 0.5 ml。往病毒濃縮液中加入甘油使其濃度為5%，分裝保存于-80℃冰箱中。

5. 動物實驗分組及處理

將30只小鼠隨機分為5組，每組6只，分別為空白對照組、W1組、W2組、W3組、W4組。取 1×1012 v.g的rAAV 2/9-CMV-eGFP稀釋到200 μl

生理鹽水中，經(jīng)尾靜脈將rAAV注射到小鼠體內(nèi)，分別于注射后1周（W1組）、2周（W2組）、3周（W3組）、4周（W4組）后用1%戊巴比妥鈉70 mg/kg腹腔注射進行麻醉，然后處死小鼠，取其心臟、肝臟、腎臟組織，采用PCR檢測GJB1的mRNA表達情況，并經(jīng)石蠟包埋切片后行免疫組織化學檢查（免疫組化）檢測Cx32的表達。通過免疫組化和PCR從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平來評價造模是否成功。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)。計量資料用表示，多組間的比較采用單因素方差分析，各組與對照組的多重比較采用 Dunnett-t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、GJB1基因rAAV的構建

1. GJB1基因的克隆合成

成功克隆合成小鼠GJB1基因片段，該DNA片段長度為895 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳可清晰顯示，見圖1A。

2. GJB1基因rAAV載體構建及測定結果

GV388載體在多克隆位點經(jīng)過酶切后得到線性結構，構建重組載體。經(jīng)1%瓊脂糖電泳可清晰顯示，見圖1B。在正確酶切的線性載體中加入GJB1基因片段及引物進行PCR，其后得到的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳可清晰顯示陽性克隆測序結果，其中陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為1120 bp，陰性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為259 bp，見圖1C。

3. GJB1基因rAAV包裝及濃度測定

GJB1基因rAAV載體轉(zhuǎn)染AAV-293 細胞48 h后可觀察到細胞形態(tài)學發(fā)生變化：細胞逐漸變圓并從培養(yǎng)盤上脫落。與陰性對照組相比，培養(yǎng)基的顏色由紅色變?yōu)槌壬螯S色。濃縮收集病毒質(zhì)粒，檢測其濃度為1.26×1013 v.g/ml。

二、GJB1基因在小鼠腎臟表達明顯升高

經(jīng)鼠尾靜脈注射后，隨著時間延長，小鼠腎臟組織Cx32 mRNA表達逐漸增強，在腎臟中不同組相互比較的F = 86.570、P < 0.001。而其他器官（肝臟、心臟）GJB1基因表達未見明顯增強，在肝臟中不同組相互比較的F = 1.250、P = 0.316;在心臟中不同組相互比較的F = 2.609、P = 0.060，見圖2。W1組與W2、W3、W4組腎臟Cx32 mRNA表達比較的P值分別為0.603、0.047、0.001、0.001。免疫組化結果與qPCR結果一致，提示Cx32主要在近端腎小管中過表達，在肝臟及心臟中未見明顯過表達，見圖3。

討論

目前，對腎臟中Cx蛋白的研究正逐步滲透到各種腎臟疾病中。以細胞間GJ通訊和Cx作為靶點治療在AKI、腎細胞癌等腎臟疾病的研究還有較大的空間[11]。我們團隊在前期研究中主要針對腎臟中的GJ通道進行探討，已經(jīng)構建的GJB1基因全身性敲除小鼠和體外細胞實驗進一步驗證了GJB1基因是有治療價值的潛在靶點[8]。然而，考慮到同一基因在不同組織中的表達與功能不同，為避免全身各臟器高表達Cx32蛋白帶來的不良反應，構建一種腎臟高表達GJB1基因的模型顯得極有意義。

AAV是一種屬于微小病毒科的無包膜單鏈線狀DNA 病毒，作為質(zhì)粒穿梭載體具有安全性能高、免疫原性低、物理性質(zhì)穩(wěn)定和宿主范圍廣泛等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于基因轉(zhuǎn)導和基因治療[10]。至今，已發(fā)現(xiàn)包括AAV1-9、DJ、DJ/8、Rh10等在內(nèi)的12種不同血清型的AAV，而且不同的血清型對不同的臟器有不同程度的識別及感染能力[12-17]。

多項研究表明，運用rAAV9作為載體，能夠?qū)崿F(xiàn)在腎臟的基因編輯[14， 18-19]。同時，rAAV9已被證實對小鼠腎臟具有較高的特異性識別能力和轉(zhuǎn)染效率[20-21]。與上述研究結果一致的是，我們選擇rAAV9作為載體，AAV-293 細胞用于rAAV9的包裝與擴增，獲得了相當高的AAV滴度，并最終在腎臟中獲得了GJB1基因的高表達。然而，Ikeda等[22]報道利用AAV8載體能將基因高效轉(zhuǎn)染到腎間充質(zhì)細胞內(nèi)，但AAV9對腎小管細胞的轉(zhuǎn)染效率較低。通過分析我們發(fā)現(xiàn)，這可能與2個實驗在AAV9的劑量選擇、動物模型、觀察時間等方面明顯不同有關，Ikeda等采用的是1×1011 GCs的AAV2/9，用于單側(cè)輸尿管梗阻的模型小鼠，并在轉(zhuǎn)染3周后觀察轉(zhuǎn)染效率;而我們采用的是1×1012 v.g的AAV9載體，用于雙側(cè)腎臟缺血再灌注模型小鼠，并在轉(zhuǎn)染4周后觀察轉(zhuǎn)染效率。另外，我們選擇的目的基因GJB1僅在近端腎小管上皮細胞中廣泛表達，在腎小球及腎臟髓質(zhì)中無明顯表達。以上這些不同因素均可能是我們利用rAAV9載體能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GJB1基因的原因。

至今研究者們已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)21種Cx蛋白，其中Cx26、Cx30.3、Cx31、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx46等已被證實在腎臟組織中表達。其中，GJB1/Cx32在腎臟組織中的表達高達90%[23]。GJB1已被報道在肝臟、心臟中廣泛表達[24-26]。為了驗證rAAV9對腎臟的特異性，我們收集了肝臟、心臟組織，并通過qPCR和免疫組化檢測了GJB1/Cx32基因和蛋白水平的變化，結果顯示肝臟、心臟組織中的Cx32基因和蛋白水平無明顯變化。此外，隨著給藥時間的延長，rAAV9在腎臟中的作用越來越明顯，提示rAAV9對腎臟具有較好的特異性，這與Schievenbusch等[20]和Picconi等[21]的研究結論類似。

目前，提高靶向腎小球給藥治療效率仍存在很大困難[27]。尋找一種安全高效的載體直接靶向腎小管是治療腎臟疾病新的方向。Atherton等（2009年）的研究表明以近端腎小管細胞為靶點的藥物可顯著提高治療腎小管纖維化藥物的濃度和療效，這提示了直接靶向腎小管進行腎臟疾病的治療是一種可行的且具有巨大前景的方法[28]。綜上所述，重組GJB1基因載體在與Cx32介導的AKI相關研究中具有一定的應用前景，該方法可供腎臟研究者借鑒與參考，這對深入研究GJB1基因在腎損傷中的作用機制、評估以GJB1為治療靶點的藥物療效等具有重要的科學價值和臨床意義。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-05-28）

（本文編輯：洪悅民）