叢巖懿 謝玉素 張留所①

海洋線蟲酸性pH脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析*

叢巖懿1, 2, 3, 4謝玉素1, 2, 3張留所1, 2, 3①

(1. 中國科學院海洋研究所 中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學與生物技術(shù)功能實驗室 青島 266237; 3. 中國科學院海洋大科學研究中心 青島 266071; 4. 中國科學院大學 北京 100049)

工業(yè)革命以來, 二氧化碳排放導(dǎo)致了海洋酸化。海水pH下降對無脊椎動物的生長發(fā)育、繁殖、代謝和免疫等多個生命過程產(chǎn)生重要影響, 但海洋無脊椎動物如何感知和響應(yīng)酸性pH脅迫的分子機制還很不清楚。本研究以團隊建立的海洋線蟲品系為模型, 對其在不同酸性pH條件下的表型特征及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了分析。結(jié)果表明, 當pH從實驗室最佳生長條件5.92下降到5.33時,.生長發(fā)育的速度明顯減慢, 但依然可以產(chǎn)卵繁殖; 但當pH下降到4.33時,.的生長受到嚴重影響, 表現(xiàn)為不能長成成體且不能產(chǎn)卵繁殖。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 發(fā)現(xiàn)當pH從5.92下降到4.33時, 海洋線蟲.脂肪酸β-氧化通路基因和不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因表達上調(diào); 表皮相關(guān)基因表達則呈現(xiàn)差異變化, 2個基因和6個基因表達顯著上調(diào), 表皮膠原基因類基因的表達沒有發(fā)生顯著變化; 細胞色素P450通路相關(guān)基因、凝集素C基因和HSP70家族基因的表達量顯著上調(diào)。當pH從5.92下降到5.33時, 上述提到的這些上調(diào)基因中的大多數(shù)沒有發(fā)生顯著變化。我們發(fā)現(xiàn)的海洋線蟲應(yīng)答酸化脅迫的主要調(diào)控模式, 為理解生物體能夠在低pH環(huán)境中生存的分子機制提供了參考, 為篩選和識別生物體響應(yīng)和適應(yīng)酸化脅迫的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。

海洋線蟲;; 酸性pH脅迫; 脂肪酸β-氧化; 物質(zhì)代謝細胞色素P450通路

海洋生物作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成, 需要適應(yīng)其生存環(huán)境的非生物因素, pH就是常見非生物因素之一(隋永年, 1986)。自工業(yè)革命以來, 由于人類大量的開采使用煤、石油和天然氣等化石燃料, 并砍伐了大量樹木植被, 大氣中的二氧化碳含量水平逐年上升。海洋吸收大氣中的二氧化碳, 導(dǎo)致二氧化碳分壓升高, 海水pH降低, 造成海洋酸化(Havenhand, 2019)?；どa(chǎn), 礦物燃料的燃燒, 交通運輸?shù)犬a(chǎn)生的酸性氣體也會通過大氣形成雨、霧、雪等向海洋輸送, 使得近海和遠海的表層海水的pH值降低(石強等, 2011)。污染物及工業(yè)廢水的排放, 例如基于形成水合物策略的海水淡化技術(shù)中排放的酸性污水等, 也會導(dǎo)致近岸海水pH降低(Montgomery, 2009)。

海水酸化的直接后果是對海洋生物的生長發(fā)育、代謝、鈣化、行為等過程產(chǎn)生影響。當水體從pH 8.3降低到6.9時, 凡納濱對蝦的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到破壞, 消化和代謝相關(guān)的酶的活性被誘導(dǎo)改變(Duan, 2019)。低pH條件下, 極地鱈魚的游泳能力下降(Kunz,2018)。當海水pH從8.1下降到7.4時, 珍珠貝殼的生長受到明顯抑制, 殼基質(zhì)蛋白基因表達顯著下調(diào)(Liu, 2017)。

海洋線蟲, 曾用名(,), 隸屬于線蟲動物門(Nematoda), 色矛綱(Chromadorea), 小桿目(Rhabditida), 小桿科(Rhabditidae),屬; 與生物醫(yī)學模式生物秀麗線蟲屬于同一個科。.為雌雄異體, 繁殖上限溫度為25°C, 在9—25°C范圍內(nèi), 該物種的發(fā)育速度會隨著溫度的升高而加快(Moens, 2000)。在20°C左右, 鹽度為20左右的條件下.產(chǎn)生的子代數(shù)量最多(Moens, 2000)。目前關(guān)于海洋線蟲.在不同pH條件下的生長發(fā)育及其調(diào)控機制尚未報道(曹緒文等, 2018; Xie, 2020)。

酸性pH脅迫普遍存在并且會給生物體帶來一系列負面影響, 因此研究生物體響應(yīng)環(huán)境酸性pH脅迫的生物學機制意義重大。由于海洋兩性繁殖無脊椎動物中還沒有真正意義的模式生物, 所以目前關(guān)于海洋無脊椎動物應(yīng)對海水酸性pH脅迫的分子機制的研究還不夠深入。作者所在團隊經(jīng)過3年努力, 已經(jīng)構(gòu)建了成熟的海洋線蟲模式體系(Xie, 2020)。本研究以海洋線蟲為研究對象, 通過線蟲響應(yīng)不同pH環(huán)境的表型實驗與轉(zhuǎn)錄組分析, 以期為探究無脊椎動物應(yīng)答酸性pH脅迫的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 品系的獲得

海洋線蟲初始樣本采集于山東青島匯泉灣潮間帶, 相較于常規(guī)的秀麗線蟲NGM培養(yǎng)基(pH為6.33),.在海水NGM培養(yǎng)基(pH為5.92)的生長與繁殖更好。實驗室也嘗試通過添加Tris-HCl和KOH等試劑調(diào)節(jié)海水NGM培養(yǎng)基的pH至7.7(匯泉灣海水的pH為7.7左右), 但.的生長情況并不是很好。經(jīng)過很多的摸索和嘗試, 最終選擇了海水NGM培養(yǎng)基(pH為5.92)作為.的最佳培養(yǎng)基。本研究中使用的線蟲是經(jīng)過2年實驗室馴化培養(yǎng)后的.品系, 20°C條件下培養(yǎng)于接種大腸桿菌.OP50的海水NGM培養(yǎng)板。

1.2 海洋線蟲的同步化

在已接種OP50的海水培養(yǎng)板上培養(yǎng)海洋線蟲, 至平板上有大量蟲卵分布時, 收集蟲卵至15mL離心管中, 3600, 離心2min。棄上清后加入滅菌水清洗2次。在室溫下用堿性次氯酸鹽溶液處理蟲卵30s, 1300, 離心1min。用滅菌水清洗卵沉淀2次, 1300, 離心1min去上清后再加入海水(Da Silva, 2005)。用玻璃管轉(zhuǎn)移卵液至空的培養(yǎng)基平板上(有OP50, 1滴卵液/板), 20°C孵化過夜, 孵育20h后得到大量同步化的海洋線蟲L1幼蟲。

1.3 海洋線蟲表型實驗

鑒于目前實驗室海洋線蟲最佳培養(yǎng)基的pH為5.92, 本研究以pH 5.92為對照組, pH 5.33、pH 4.33和pH 3.33為酸性脅迫組。配制特定pH的海洋線蟲培養(yǎng)基小板(1.7g Agar, 0.25g Peptone, 97.5mL海水, 0.1mL 1mol/L MgSO4, 0.1mL 1mol/L CaCl2, 0.1mL 5mg/mL膽固醇乙醇溶液, 通過適量50%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH, 加入2.5mL 1mol/L K2HPO4緩沖溶液使其保持一個穩(wěn)定的pH), 每個pH小板接種10μL大腸桿菌OP50。待菌液干燥后, 每個pH小板轉(zhuǎn)入70只同步化的L1幼蟲, 觀察它們的生長發(fā)育情況, 記錄每個平板上觀察到的最早出現(xiàn)海洋線蟲成體的時間。每個pH條件進行3個重復(fù)。

1.4 RNA-seq建庫準備及RNA-seq分析

通過1.2的方法得到大量的同步化的L1海洋線蟲幼蟲后, 用M9溶液將L1幼蟲從培養(yǎng)基上洗脫下來, 轉(zhuǎn)入15mL離心管中, 1300, 離心2min后棄上清。將收集的L1幼蟲轉(zhuǎn)移到已接種OP50的直徑9cm的pH平板上, 每個pH平板上放約60000只線蟲。20°C孵育3h后用M9溶液分別洗脫在不同pH環(huán)境下的L1幼蟲, 將洗脫液轉(zhuǎn)入15mL離心管中, 3600離心2min去上清, 再加入M9溶液離心去上清, 如此反復(fù), 洗滌三次, 去除大部分殘留細菌。然后將L1線蟲樣品轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中, 2000離心5min, 除去多余的上清。樣品立即在液氮中冷凍5min, –80°C保存。每個pH條件實驗(pH 4.33, pH 5.33和pH 5.92)進行三次重復(fù)。

將樣本用液氮迅速研磨后, 通過Trizol法提取RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染; 通過Qubit2.0 Fluorometer對RNA濃度進行精確定量。使用Illumina的NEBNext? UltraTM RNA Library Prep Kit試劑盒進行文庫構(gòu)建。把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行Illumina測序, 并產(chǎn)生150bp配對末端讀數(shù), 測序片段被高通量測序儀測得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA堿基識別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)。通過HISAT2 v2.0.5構(gòu)建參考基因組的索引, 將配對末端clean reads與參考基因組比對(Kim, 2015, 2019; Pertea, 2016)。參考基因組為實驗室測得的海洋線蟲基因組。featureCounts v1.5.0-p3被用來計算映射到每個基因的讀數(shù)(Liao, 2014)。根據(jù)基因的長度計算每個基因的FPKM, 并計算映射到該基因的讀數(shù)?；谪摱椃植? 通過R程序包DESeq2(1.16.1)進行兩個比較組合之間的差異表達分析(Love, 2014)。使用Benjamini和Hochberg法來調(diào)整所得P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。通過DESeq2篩選出校正后的P值小于0.05(P-adjusted<0.05)的基因被分配為差異表達基因。顯著差異表達的篩選標準為校正后的P值<0.05以及|log2foldchange|>1。使用R程序包clusterProfiler實現(xiàn)差異表達基因的GO富集分析和KEGG通路分析, 以校正后的P值小于0.05作為為顯著性富集的閾值(Yu, 2012)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋線蟲L. marina在不同酸性pH條件下的生長發(fā)育比較

為了探究在不同酸性pH條件下海洋線蟲.生長發(fā)育的速度, 我們進行了表型實驗。將同步化的70只海洋線蟲L1幼蟲轉(zhuǎn)移到不同pH平板上, 每個pH條件三次重復(fù), 記錄平板上出現(xiàn)成體的時間和成體數(shù)量。結(jié)果顯示: 在pH 5.92條件下, 海洋線蟲.在第4天出現(xiàn)成體, 成體率約為36%, 后續(xù)可以產(chǎn)卵繁殖(圖1); 在pH 5.33條件下, 第4天出現(xiàn)成體, 成體率約為18%, 也可以產(chǎn)卵繁殖(圖1); 在pH 4.33條件下, 第4天線蟲不能發(fā)育至成體, 只能長至L4期幼體, 最終在第6天死亡。在pH 3.33條件下, L1幼蟲不能存活, 2h內(nèi)全部死亡。

2.2 海洋線蟲L. marina在不同酸性pH條件下的轉(zhuǎn)錄組分析

我們通過高通量RNA測序(RNA-seq)來識別和量化海洋線蟲.在不同pH條件下的差異表達基因。以pH 5.92為對照組, pH 5.33, pH 4.33分別作為處理組, 錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR<5%和|log2FoldChange|> 1作為差異基因篩選閾值。圖2是差異表達基因的聚類熱圖。各比較組合中上調(diào)基因和下調(diào)基因的數(shù)量如表1所示。

圖1 海洋線蟲在不同pH值的成體率

注: 誤差條代表3次重復(fù)實驗的標準誤差(*<0.05, **<0.01, ***<0.001)

2.3 脂肪酸代謝相關(guān)基因表達隨pH的下降而升高

通過KEGG分析, 我們發(fā)現(xiàn)當pH下降到4.33時, 海洋線蟲.脂肪酸β-氧化通路涉及的關(guān)鍵酶(Watts, 2017)基因表達顯著上調(diào)(圖3, 圖4a, 圖4b)。在秀麗線蟲中, 對應(yīng)AMP-binding enzyme注釋的絕大多數(shù)為?；o酶A合成酶家族基因(, acyl-CoA Synthetase), 因此在海洋線蟲.中的這7個注釋為AMP-binding enzyme的基因極有可能就是表達酰基輔酶A合成酶的基因(圖4a)。酰基輔酶A合成酶可以催化脂肪酸與輔酶A形成硫酯鍵, 形成脂酰-CoA, 這是脂肪酸β-氧化的起始步驟(許雪梅等, 2009; Ellis, 2010)。此外, 隨著pH的下降, 我們還發(fā)現(xiàn)了3個與不飽和脂肪酸合成相關(guān)的基因的表達量顯著升高(圖3, 圖4c), 其中EVM0000114屬于ELO家族, 秀麗線蟲的脂肪酸延長酶基因參與了不飽和脂肪酸延長的主要步驟, 因此海洋線蟲EVM0000114基因很有可能也是編碼脂肪酸延長酶的基因。

表1 每個比較組合中差異表達基因的數(shù)量

Tab.1 The number of differentially expressed genes in each combination

圖2 海洋線蟲在不同pH值下差異表達基因的聚類熱圖

注: 橫坐標為樣品名, 縱坐標為差異基因FPKM歸一化后的數(shù)值, 紅色表示上調(diào), 藍色表示下調(diào)

2.4 表皮相關(guān)基因差異表達

當pH下降到4.33時, 海洋線蟲.表皮合成相關(guān)的2個蝦紅素(Astacin)基因和6個補丁家族基因(Patched family)表達顯著上調(diào)(圖5a, 5b)。但是, 表皮膠原基因類基因的表達沒有發(fā)生顯著變化(圖5c)。

2.5 細胞色素P450通路相關(guān)基因表達隨pH的下降而升高

在pH 4.33的條件下, KEGG pathway分析結(jié)果顯示, 海洋線蟲.中細胞色素P450通路得到顯著富集; 細胞色素P450氧化酶、黃素結(jié)合的單加氧酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、ABC轉(zhuǎn)運蛋白等基因的表達量都顯著升高(圖3, 圖6)。而在pH 5.33條件下, 細胞色素P450通路相關(guān)基因中僅EVM0009829、EVM0007061、EVM0012458、EVM0004308、EVM0011078表達上調(diào)。此外, 海洋線蟲.核激素受體基因(nuclear hormone receptor)也在pH下降到4.33時表達量顯著升高(圖6)。

2.6 凝集素C基因和熱休克蛋白基因的表達隨pH的下降而上調(diào)

在pH 4.33條件下, 海洋線蟲.中3個注釋為HSP70和1個注釋為HSP90的基因, 以及5個凝集素C基因的表達量顯著升高(圖7a, 7b)。但是, 在pH 5.33條件下, 這些基因的表達量并沒有發(fā)生顯著變化。

3 討論

3.1 脂肪酸β-氧化可能是海洋線蟲響應(yīng)酸性pH脅迫的主要途徑

從分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)當pH下降到4.33時, 25個脂肪酸β-氧化通路基因表達顯著上調(diào)(圖4a, 圖4b), 這些基因數(shù)目占鑒定出的所有上調(diào)基因的11%。脂肪酸β-氧化過程是一個高度的放能過程, 每一輪β-氧化會產(chǎn)生一個NADH, 1個FADH2和1個乙酰-CoA(Houten, 2016), 每個乙酰-CoA經(jīng)過氧化可產(chǎn)生10個ATP(Ashrafi, 2007; Braeckman, 2009; Akram, 2014)。氧化的脂質(zhì)底物可能是在海洋線蟲.生命早期階段滿足發(fā)育所需能量的主要來源, 脂肪酸β-氧化通路基因表達上調(diào), 反映了海洋線蟲.動員能量儲備來應(yīng)對環(huán)境pH的下降。

pH下降導(dǎo)致的脂肪酸分解代謝增加在不少文獻中都有所報道。Hall等(2008)的研究發(fā)現(xiàn), 當pH從7下降到4, 秀麗線蟲3個脂肪酸β-氧化通路基因表達量都顯著升高, 包括?；o酶A合成酶(,.), ?；o酶A氧化酶(.,.)和3-羥酰輔酶A脫氫酶(,.)基因。該研究認為pH下降影響了鈉氫交換體NHX-2耦合H+濃度的營養(yǎng)物質(zhì)的攝入, 導(dǎo)致線蟲只能通過脂肪酸的分解來提供一種替代的能量來源(Hall, 2008)。與海洋線蟲.相比, 秀麗線蟲脂肪酸β-氧化通路上調(diào)的基因數(shù)量少很多(Cong, 2020), 可見脂肪酸β-氧化雖然參與了秀麗線蟲對酸性脅迫的響應(yīng), 但可能并不發(fā)揮主要作用。紫海膽在海水pH下降時, 脂肪酸氧化途徑中的多個基因表達上調(diào)(Evans, 2017), 該研究認為酸性脅迫作用于代謝基因網(wǎng)絡(luò), 使ATP轉(zhuǎn)向維持細胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡, 以此來增強生物體對海水酸化的耐受性(Evans, 2017)。

3.2 細胞色素P450通路基因參與海洋線蟲對酸性pH脅迫的響應(yīng)

細胞色素P450通路的物質(zhì)代謝過程主要分為2個階段。第一階段: 親脂性物質(zhì)被細胞色素P450單氧化酶(CYP)等修飾成親電或親核物質(zhì)。第二階段: 經(jīng)過第一階段反應(yīng)產(chǎn)生的親水性化合物在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等的催化作用下與極性配體結(jié)合。最后由ABC轉(zhuǎn)運蛋白把這些性狀改變的化合物運輸?shù)郊毎?Barnes, 1960; Dieterich, 2008; Croom, 2012)。當pH從8.0降到7.3時, 長牡蠣Cytochrome P450 1A5和Glutathione S-transferase Ω-1表達量顯著升高(Timmins-Schiffman, 2014)。在本研究中, 當pH下降到4.33時, 10個物質(zhì)代謝細胞色素P450通路基因表達顯著上調(diào)(圖3, 圖6)。我們在秀麗線蟲中也發(fā)現(xiàn), 當pH從6.33(秀麗線蟲正常培養(yǎng)基的pH)下降到3.13時, 32個細胞色素P450 通路基因表達上調(diào)(Cong, 2020)。秀麗線蟲在pH 3.13的條件下依然可以產(chǎn)卵繁殖, 而海洋線蟲.在pH 4.33的條件下不能長成成體, 海洋線蟲表現(xiàn)得更不耐酸; 我們推測造成這種差異的原因是海洋線蟲.基因組中的細胞色素P450通路基因與陸生自由生活線蟲相比, 發(fā)生了顯著縮減(Xie, 2020)。物質(zhì)代謝細胞色素P450通路基因的啟動表達很可能是為了保護生物體免受更酸的環(huán)境產(chǎn)生的有毒物質(zhì)的侵害, 或清除因更酸的環(huán)境導(dǎo)致生理狀態(tài)紊亂而積累在其體內(nèi)的有毒物質(zhì)。

圖3 各比較組合中上調(diào)基因的KEGG富集情況

注: 由于下調(diào)基因數(shù)量較少, 所以下調(diào)基因并未被KEGG富集到任何通路中

注: a. ?；o酶A合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平; ABE. AMP-binding enzyme, AMP結(jié)合酶; b. 脂肪酸β-氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平; CPT. carnitine palmitoyl transferase, 肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶; ACDH. acyl-CoA dehydrogee, ?；o酶A脫氫酶; ACOX. acyl-CoA oxidase, ?；o酶A氧化酶; ECH. enoyl CoA hydratase, 烯酰輔酶A水合酶; 3-HACD. 3-hydroxyacyl CoA dehydrogee, 3-羥酰輔酶A脫氫酶; Thiolase. 硫解酶; c. 海洋線蟲不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。ADH. Zinc-binding dehydrogenase, 鋅結(jié)合的脫氫酶; ELO. fatty acid elongase, 脂肪酸延長酶。倍數(shù)變化表示處理組(pH 4.33, pH 5.33)與對照組(pH 5.92)的基因表達量的比值(處理組FPKM值/對照組FPKM值)。誤差條代表3次重復(fù)實驗的標準誤差。*<0.05, **<0.01, ***<0.001

注: a. 線蟲蝦紅素樣金屬蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄水平; b. 補丁蛋白相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平; c. 膠原基因的轉(zhuǎn)錄水平。倍數(shù)變化表示處理組(pH 4.33, pH 5.33)與對照組(pH 5.92)的基因表達量的比值(處理組FPKM值/對照組FPKM值)。誤差條代表3次重復(fù)實驗的標準誤差。*<0.05, **<0.01, ***<0.001

圖6 海洋線蟲細胞色素P450通路相關(guān)基因及核激素受體基因的表達情況

注: CYP. cytochrome P450 oxidase, 細胞色素P450氧化酶; FMO. Flavin-binding monooxygee, 黃素結(jié)合的單加氧酶; GST. glutathione-S-transferase, 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶; ABC. ATP-binding cassette transporters, ABC轉(zhuǎn)運蛋白; NHR. nuclear hormone receptors, 核激素受體。倍數(shù)變化表示處理組(pH 4.33, pH 5.33)與對照組(pH 5.92)的基因表達量的比值(處理組FPKM值/對照組FPKM值)。誤差條代表3次重復(fù)實驗的標準誤差。*<0.05, **<0.01, ***<0.001

圖7 海洋線蟲凝集素C基因(a)和熱休克蛋白基因(b)的表達情況

注: 倍數(shù)變化表示處理組(pH 4.33, pH 5.33)與對照組(pH 5.92)的基因表達量的比值(處理組FPKM值/對照組FPKM值)。誤差條代表3次重復(fù)實驗的標準誤差。*<0.05, **<0.01, ***<0.001

核激素受體NHRs是參與多種生理過程的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 研究表明NHRs可以調(diào)節(jié)P450通路中Ⅰ期和Ⅱ期解毒基因和、等的表達(Fisher, 2006), 它在調(diào)節(jié)解毒酶功能方面具有廣泛的底物特異性, 在對內(nèi)源及外源有毒物質(zhì)的代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Hoffmann, 2015), 有毒物質(zhì)很可能通過配體間接或直接與核激素受體結(jié)合, 然后激活外源物質(zhì)解毒相關(guān)基因的表達(Lindblom, 2006; Hoffmann, 2015)。

鑒于細胞色素P450通路基因可能在線蟲應(yīng)對極端酸性環(huán)境脅迫時可能發(fā)揮的重要作用, 并且該通路基因數(shù)量眾多, 功能復(fù)雜, 本實驗室在今后的研究中會著重開展此通路基因的篩選與鑒定, 通過大規(guī)模突變體篩選和CRISPR基因編輯技術(shù)探究決定線蟲響應(yīng)和適應(yīng)酸性環(huán)境脅迫的關(guān)鍵基因, 以期為生物能夠在不斷變化的pH環(huán)境中生存的分子機制的理解提供參考, 也可能會為提高評估和監(jiān)測生態(tài)修復(fù)的后果提供新的解決方案。

3.3 表皮相關(guān)基因、凝集素C基因及熱休克蛋白基因共同參與海洋線蟲對酸性pH脅迫的響應(yīng)

在秀麗線蟲中,(Nematode Astacin)編碼一種類似蝦紅素的金屬蛋白酶(WormBase, 2019), 它與表皮合成密切相關(guān)(Novelli, 2004)。注釋為Patched family的基因在秀麗線蟲中絕大多數(shù)都是(ached-elated protein)基因, 這些基因參與了線蟲的表皮更替過程;基因的破壞會導(dǎo)致秀麗線蟲的蛻皮障礙(Zugasti, 2005)。在本研究中,和基因的表達上調(diào)說明表皮相關(guān)基因參與了海洋線蟲.對酸性pH脅迫的響應(yīng)我們前期的研究結(jié)果顯示, 當pH下降到4.33時, 秀麗線蟲中有大量表皮膠原基因表達上調(diào)(Cong, 2020); 但海洋線蟲.的基因表達卻沒有發(fā)生顯著變化(圖5c), 推測可能是由于兩種線蟲的表皮結(jié)構(gòu)成分不同, 所以對酸性pH脅迫的響應(yīng)不同。

C型凝集素是一種Ca2+依賴的糖結(jié)合蛋白(Drickamer, 1989)。當海水pH從8.1下降到7.7時, 翼足類動物的C型凝集素家族基因表達量也顯著上調(diào)(Maas, 2015), 特別的是, 這些C型凝集素家族基因的功能可能與生物的礦化作用相關(guān)。此外, C型凝集素在維持機體穩(wěn)態(tài)、免疫防御以及免疫監(jiān)視等生理過程中也發(fā)揮著重要作用。當海水pH從8.1下降到7.7時, 紫貽貝的C型凝集素基因的表達量也顯著升高, 該研究認為海水酸化可能在紫貽貝感染致病菌的早期階段觸發(fā)特定的免疫相關(guān)基因,促進抗菌肽和模式識別受體的轉(zhuǎn)錄(Castillo, 2017)。我們鑒定到的這5個上調(diào)的C型凝集素基因在海洋線蟲對酸性pH脅迫的響應(yīng)中究竟是發(fā)揮何種功能, 有待于進一步研究。

熱休克蛋白作為一種常見的細胞應(yīng)激的指示蛋白, 在許多刺激下如熱休克、缺氧、重金屬、寒冷、滲透、鹽、紫外線、氧化應(yīng)激和病原體感染等都會被誘導(dǎo)表達(Morimoto, 1998; Swindell, 2007)。Urbarova等(2019)的研究發(fā)現(xiàn), ?？诘蚿H環(huán)境條件下, 應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量急劇增加, 其中非常顯著的就是熱休克蛋白Hsp70和Hsp90的上調(diào)。本研究顯示, 熱休克蛋白家族基因也參與了海洋線蟲.對酸性pH脅迫的響應(yīng), 它們發(fā)揮的具體功能有待于進一步研究。

4 結(jié)論

我們的研究結(jié)果表明, 當pH從5.92下降到4.33時, 海洋線蟲.通過大量脂肪酸β-氧化通路基因上調(diào)來響應(yīng)酸化脅迫, 細胞色素P450通路基因、凝集素C基因、表皮相關(guān)基因(和)和HSP70家族基因等共同參與響應(yīng)過程。這些基因的表達變化與表型實驗的結(jié)果相吻合, 當pH從5.92下降到5.33時, 海洋線蟲.生長發(fā)育的速度明顯減慢, 但依然可以產(chǎn)卵繁殖, 上述這些基因的表達并沒有發(fā)生顯著變化(只有其中幾個基因表達上調(diào)); 而當pH下降到4.33時, 海洋線蟲.則不能長成成體, 上述這些基因表達顯著上調(diào)。我們在海洋線蟲.中發(fā)現(xiàn)的應(yīng)答酸化脅迫的調(diào)控模式, 為理解生物體能夠在低pH環(huán)境中生存的分子機制提供了參考, 同時為篩選和識別生物體響應(yīng)和適應(yīng)酸化脅迫的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。

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調(diào)查的對象為杭州市內(nèi)五所高校的在校大學生群體，五所高校分別浙江工業(yè)大學、浙江中醫(yī)藥大學、浙江工商大學、杭州電子科技大學、杭州師范大學。數(shù)據(jù)收集時間為2018年9月9日至9月25日。調(diào)研過程共發(fā)放問卷350份，收回有效問卷336份，問卷有效率為96%。問卷收集到的信息包括大學生的基本信息、生活費的來源、對互聯(lián)網(wǎng)借貸平臺的認知、互聯(lián)網(wǎng)借貸平臺使用情況等一系列指標和信息。

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TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF THE RESPONSE OF MARINE NEMATODETO ACIDIC STRESS

CONG Yan-Yi1, 2, 3, 4, XIE Yu-Su1, 2, 3, ZHANG Liu-Suo1, 2, 3

(1. CAS Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Since the industrial revolution, carbon dioxide emissions have led to ocean acidification. The decrease in pH of seawater has important effects on the growth, reproduction, metabolism, and immune regulation of organisms. At present, the molecular mechanisms by which marine organisms perceive and respond to acidic stress remain largely unknown. In this study, marine nematodewas used as an animal model to analyze its phenotypic and transcriptome characteristics under different pH values. Our report provided a reference for exploring the regulatory mechanism of marine invertebrates in response to the acidic stress of seawater. We found that when pH decreased from 5.92 to 5.33 (the optimum growth condition of.is 5.92 in laboratory), the growth and development rate of.decreased significantly, but it could still spawn. In contrast, when pH dropped to 4.33, the growth of.was seriously affected, showing that it could not grow into adulthood and spawn. Through transcriptome analysis, we found that when pH decreased from 5.92 to 4.33, the expression of the fatty acid β-oxidation pathway genes and the unsaturated fatty acid synthesis genes were significantly up-regulated in.. Furthermore, the expressions of 2genes and 6genes were also significantly up-regulated, while the expression level ofgenes were not changed. Additionally, we found that cytochrome P450 pathway genes, lectin C genes and HSP70 family genes were significantly up-regulated. However, when pH decreased from 5.92 to 5.33, most of the above up-regulated genes did not change significantly. This study may lay a foundation for the future study for identifying the master gene(s) responding and adaptation to an acidic stress in nematodes and other marine animals.

marine nematodes;; acidic stress; fatty acid β-oxidation; drug metabolism cytochrome P450

* 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室山東省重大科技創(chuàng)新工程課題, 2018SDKJ0302-1號; 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學與生物技術(shù)功能實驗室 2018年度青年科研人員特別資助項目, 2018.09-2020.08; 青島創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項目, Grant 16-8-3-19-zhc號; 中國科學院海洋大科學研究中心重點部署項目, 2019.11—2022.11。叢巖懿, 碩士研究生, E-mail: congyanyi17@mails.ucas.ac.cn

張留所, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: lzhang@qdio.ac.cn

2020-03-12,

2020-04-18

Q955; K826.15

10.11693/hyhz20200300070