丁 維，鐘立仁，張海波，范鈞泓，王 力，何書華，王明強，韋安陽△

1.貴州中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科(貴陽 550001)；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院泌尿外科(廣州 510515)；3.貴州中醫(yī)藥大學(貴陽 550025)

勃起功能障礙(Erectile dysfunction,ED)是指無法獲得或(和)保持足夠的勃起功能進行滿意的性交[1-2]。中醫(yī)又稱作陽痿，《黃帝內(nèi)經(jīng)》對陽痿的論述較多，歸因于氣虛過甚，素有“氣大衰而不起不用”；又有“傷于寒則陰縮入，傷于熱則縱挺不收”；亦可由于房勞。有研究顯示ED的患病率隨著高脂血癥的嚴重程度呈線性增加[3]。高脂血癥(Hyperlipidemia,HR)狀態(tài)下，血液中的脂質(zhì)水平升高并被過氧化，此過程有助于產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(Reactive oxygen species,ROS)。ROS生成增多會使機體氧化應激水平增加，從而導致一系列對組織有害的連鎖反應，此病理過程與高脂血癥性ED關(guān)系密切[4]。

丹參為唇形科鼠尾草本屬植物，藥用其根。丹參味苦，藥性微寒，入心肝二經(jīng)[5]。《本草正義》云“丹參專入血分，其功在于活血行血，內(nèi)之達臟腑而化瘀滯，故積聚消而癥瘕破;外之利關(guān)節(jié)而通脈絡，則腰膝健而痹著行”，闡明了丹參具有涼血消腫，活血化瘀的功效。據(jù)《景岳全書》記錄，丹參“亦能養(yǎng)陰定志，益氣解煩”，而《滇南本草》謂丹參“補心定志，安神寧心”?，F(xiàn)代藥理學表明其化學成分主要由水溶性酚酸類及脂溶性丹參酮類化合物組成[6]。丹參酮ⅡA磺酸鈉(Sodium tanshinone ⅡA sulfonate,STS)是丹參酮ⅡA的水溶性衍生物，而丹參酮ⅡA是從丹參根部分離得到的脂溶性二萜類化合物。STS是一種傳統(tǒng)的中草藥，可有效治療各種心血管疾病，如缺血性中風和心肌梗死等[7]。有研究發(fā)現(xiàn)STS可通過提高核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor,Nrf2)和血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)的表達水平進而增加機體的抗氧化能力[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥ED大鼠體內(nèi)氧化應激水平上升，本實驗將進一步觀察STS對Hrf2/HO-1通路及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)表達的影響，探討其對改善高脂血癥ED大鼠勃起功能的機制。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：8周齡250～300 g的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠18只，所有大鼠均在南方醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，12 h/12 h自然晝夜光線照射，標準溫度(22～25) ℃、濕度(60±10)%。所有雄性大鼠在實驗前均通過交配試驗以證明勃起功能正常。

1.2 主要實驗器材與試劑：Biopac Systems海綿體內(nèi)壓特定儀(操作軟件：Biopac System AcqKnowledge 4.4)；氧化應激指標SOD、GSH和MDA購于南京建成生物工程研究所；山羊抗鼠、兔二抗(Proteintech)； Nrf2一抗(Abcam)；HO-1一抗(Proteintech)； Western blot二抗(Abbkine)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組：所有大鼠適應性喂養(yǎng)2周后隨機分為三組，分別為正常組、高脂血癥組、高脂血癥加丹參酮ⅡA磺酸鈉組各6只。高脂血癥加丹參酮ⅡA磺酸鈉組為造模成功后的高脂血癥大鼠每天腹腔注射10 mg/kg的STS溶液；而高脂血癥組則予以腹腔注射等量生理鹽水，以上治療處理持續(xù)16周。

2.2 HR大鼠模型的建立：為了建立高脂血癥模型，本研究使用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠。分配為高脂血癥組及高脂血癥加丹參酮ⅡA磺酸鈉組的大鼠均喂養(yǎng)高脂飼料，喂養(yǎng)時間持續(xù)16周。按Bakircioglu造模方法,高脂飼料的主要成分為膽固醇(2%)、豬油(10%)、蛋黃粉(10%)、正常鼠糧(79%)。與此同時，對照組大鼠同時接受正常飼料喂養(yǎng)。

2.3 大鼠陰莖海綿體壓力測定及頸動脈測壓：HR大鼠模型建模成功后及注射STS或生理鹽水16周后，對各組大鼠進行陰莖勃起功能檢測和頸動脈壓力測定。對實驗用大鼠稱重和麻醉成功后，打開盆腔并定位海綿體神經(jīng)。使用正負電極刺激神經(jīng)促使陰莖勃起，刺激參數(shù)設置為：振幅(5 mA)，頻率(50 Hz)，脈沖寬度(61.66 ms)，持續(xù)時間(50 s)。選取靠近龜頭的陰莖兩側(cè)部分作為穿刺點，穿刺針連接的壓力感受儀可對陰莖海綿體內(nèi)的壓力進行檢測。打開刺激電極刺激50 s，收集刺激期間的數(shù)據(jù)并重復上述步驟3次，記錄并保存ICP壓力曲線文件。ICP壓力測定后，通過穿刺頸動脈對壓力進行測定，記錄并保存頸動脈壓力(Mean arterial pressure,MAP)曲線文件，以進行后續(xù)分析。

2.4 組織取材：大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓力和頸動脈內(nèi)壓測量結(jié)束后，彎鑷子夾住陰莖的龜頭后使用眼科剪在根部處剪斷陰莖。丟棄陰莖的龜頭端，并沿著遠端到近端的方向用鑷子擠出陰莖中剩余的血液，使用生理鹽水進行漂洗，直至沖洗液無色透明為止。將陰莖浸入生理鹽水中，用彎鑷將尿道海綿體部分及表面的筋膜撕下并丟棄，使用預冷的PBS徹底清潔剩余的海綿體。最后加入液氮中保存，用于后續(xù)的Western blot和其他檢測。

2.5 Western blot檢測蛋白表達：采用Western blot法檢測大鼠陰莖海綿體平滑肌中Nrf2、HO-1的蛋白表達。

2.6 血清及組織氧化應激標記物和血脂水平測定：將陰莖組織加入Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)中勻漿，在4 ℃下14000 r/min離心10 min，收集上清液進行生化分析。根據(jù)制造商的說明使用檢測試劑盒對陰莖組織中的丙二醛、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的水平進行測定。用試劑盒檢測大鼠血清總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平。

結(jié) 果

1 各組大鼠體重及血脂變化 見表1、2。造模前，各組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模后，高脂血癥組和丹參酮ⅡA磺酸鈉組的體重比正常組有明顯的增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；造模前，各組大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；高脂血癥大鼠給予STS治療16周后TG較正常組明顯降低，HDL較正常組明顯升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠造模前后體重比較(g)

表2 各組大鼠造模前后血脂水平比較(mmol/L)

2 各組大鼠勃起功能比較 見表3。通過對ICP/MAP結(jié)果進行分析，高脂血癥組勃起功能明顯降低，平均ICP和ICP/MAP比值較正常組明顯降低(P<0.05)。與高脂血癥組大鼠相比，丹參酮ⅡA磺酸鈉組大鼠勃起功能顯著改善，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠勃起功能比較

3 各組大鼠陰莖海綿體組織的氧化應激水平比較 見表4。高脂飲食誘導的高脂血癥大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)，SOD及GSH含量降低而MDA含量增高，與正常組大鼠相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與高脂血癥組比較，STS治療能提高高脂血癥大鼠海綿體組織內(nèi)SOD，GSH水平，而MDA的水平顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠陰莖海綿體平滑肌SOD、GSH、MDA比較

4 各組大鼠陰莖海綿體組織Nrf2和HO-1相對表達水平比較 見表5(圖1)。Western blot檢測陰莖海綿體組織內(nèi)Nrf2和HO-1的表達水平可發(fā)現(xiàn)，高脂血癥組大鼠的海綿體組織的Nrf2和HO-1表達水平較正常組上升，但兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。丹參酮ⅡA磺酸鈉組大鼠的陰莖海綿體組織的Nrf2和HO-1表達水平較高脂血癥組進一步提高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠陰莖海綿體平滑肌Nrf2、HO-1 蛋白相對表達比較

圖1 各組大鼠陰莖海綿體平滑肌Nrf2、HO-1蛋白相對表達

討 論

大量的研究表明，氧化應激在高脂血癥ED的發(fā)病過程中起著重要作用[9]。陽痿的發(fā)病與腎、肝、心、脾功能失調(diào)有關(guān)，尤其與肝的疏泄條達，情志異常密切相關(guān)。情志不遂可致肝氣郁滯，進而導致陽痿，《素問·痿論》曰：“思想無窮，所愿不得……宗筋弛縱,發(fā)為筋痿”；《顧松園醫(yī)鏡》亦有記載：“陽痿有因志意不遂所致者”；清代醫(yī)家沈金鰲認為有志難舒，則肝氣難以條達舒暢，可能導致陽器不用。而現(xiàn)代研究認為情志不暢與氧化應激關(guān)系密切，情志異常，煩躁易怒會使體內(nèi)氧化應激損傷加重，而氧化應激所產(chǎn)生的超氧化物會進一步導致情志異常。本研究發(fā)現(xiàn)，HR組大鼠出現(xiàn)勃起功能障礙，而經(jīng)STS治療后高脂血癥大鼠勃起功能得到明顯改善，具體的機制可能與STS介導的抗氧化應激有關(guān)。Nrf2是體內(nèi)調(diào)節(jié)氧化還原平衡的關(guān)鍵信號因子，它能調(diào)節(jié)一系列保護機體免受氧化應激損傷的基因表達，包括GSH，SOD和HO-1[10]。HO-1是Nrf2下游的效應因子，被認為是細胞內(nèi)最重要的抗氧化物質(zhì)之一。Nrf2/HO-1抗氧化通路的激活有助于保護組織免受多種疾病的侵襲[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥狀態(tài)下大鼠陰莖海綿體組織中Nrf2和HO-1的蛋白水平表達上升，表明當機體氧化應激水平上升時，Nrf2和HO-1會反射性激活以保護機體。此外，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂血癥大鼠陰莖海綿體MDA含量增加，SOD和GSH水平下降，表明陰莖海綿體組織內(nèi)發(fā)生了氧化應激的損傷，陰莖海綿體平滑肌功能受損。本研究結(jié)果也在高脂飼料喂養(yǎng)大鼠模型的其他研究中可觀察到，佐證了本研究的結(jié)果[12]。

丹參酮ⅡA磺酸鈉是中藥丹參中分離的丹參酮ⅡA經(jīng)磺化得出的水溶性物質(zhì)。研究表明，STS具有清除自由基與抗氧化應激、抗炎抑菌、改善血液循環(huán)等作用[13]。本次研究發(fā)現(xiàn)STS能顯著增加高脂血癥大鼠海綿體組織中Nrf2和HO-1的表達，提示STS增強了高脂血癥大鼠的抗氧化能力，表明激活Nrf2/HO-1通路在保護組織免受氧化應激方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。本研究同時發(fā)現(xiàn)，STS治療可顯著提高GSH、SOD的水平和降低MDA含量，表明STS治療能有效降低陰莖海綿體內(nèi)氧化應激水平，由于ROS導致一系列損傷會導致ED，因此可推斷STS可通過抑制高脂血癥的氧化應激而發(fā)揮治療作用。另外，氧化應激的增加可以通過低密度脂蛋白的氧化來促進動脈粥樣硬化疾病，而氧化低密度脂蛋白本身可以通過誘導未耦合的eNOS、線粒體電子傳遞鏈、黃嘌呤氧化酶和NAD(P)H氧化酶來增加超氧陰離子生成，導致了ROS的進一步生成。本次研究發(fā)現(xiàn)，HR組大鼠LDL較NC組顯著增高，而氧化LDL增加了體內(nèi)氧化應激的發(fā)生，而STS組較HR組TG明顯降低，HDL明顯升高，Silva等[15]的實驗研究表明丹參酮ⅡA能降低血清甘油三酯(TG)的水平，增加家兔血清一氧化氮濃度，從而達到抗動脈粥樣硬化的效果，STS能降低大鼠體內(nèi)TG水平，可能是在延緩陰莖小動脈粥樣硬化的發(fā)生方面起到了保護作用。因此，STS可通過激活Nrf2/HO-1通路增加抗氧化能力，進而降低TG濃度，提高HDL含量，改善高脂血癥大鼠的勃起功能。本研究為探索STS在治療高脂血癥導致的ED提供了理論依據(jù)。