邊 倩,曹 妮,劉 航 ,李京濤 ,魏海梁,閆曙光 ,郭英君

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽 712021)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)；3.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院(銀川 750001)

肝硬化逐漸發(fā)展至肝癌這一病理過程中需經(jīng)歷肝癌癌前病變，肝部腫瘤細(xì)胞的異常增生是肝癌發(fā)生發(fā)展的主要病理因素[1]。微小RNA(miRNA)是小的非編碼RNA。這些非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從細(xì)胞的發(fā)育和分化到癌癥，miRNA均有廣泛參與[2]。miR-221在肝癌組織與細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，表明其可能參與了肝癌發(fā)展的過程，檢測miR-221的表達(dá)對于該病的診斷以及病情提示或存在重要意義[3]。益脾養(yǎng)肝方是陜西省名中醫(yī)常占杰教授防治肝癌癌前病變的方藥[4]。本實驗采用DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌癌前病變模型，探討益脾養(yǎng)肝方對模型大鼠miR-221表達(dá)水平的影響，具體研究與結(jié)果分析如下。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：180只SPF級大鼠，體重為100～120 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，許可證號SCXK(陜)2012-003。所有大鼠于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心分籠飼養(yǎng)，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，自由攝入食水，室溫(23±2)℃，相對濕度(50±5)%，光照：12 h明暗交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實驗。

1.2 藥品與試劑：益脾養(yǎng)肝方組方包括：黨參、白術(shù)、白花蛇舌草各30 g；枸杞子、鱉甲、半枝蓮各15 g；熟地黃、姜黃、郁金各10 g，購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，將組方制成凍干粉低溫保存。使用時設(shè)置濃度分別為1.2、0.6、0.3 g/ml。

其他藥品試劑及產(chǎn)地批號：護(hù)肝片，國藥準(zhǔn)字Z20003336；蘇木素，Sigma(H9627)；伊紅(水溶性)，國藥集團(tuán)(71014544)；二甲苯，國藥集團(tuán)(10023418)；TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司(40308ES20)；蛋白酶K(Proteinase K)，武漢華美生物工程有限公司(CSB-DP437A)；4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)，碧云天(C1002)；抗熒光淬滅封片，北京百奧萊博科技有限公司(0100-01)；Trizol試劑盒，上海名勁生物科技有限公司(Lot:252250AX)；五倍緩沖液，鄭州樂瑞生物有限公司(R101-01/02)；賽博綠實時多聚酶鏈反應(yīng)混合液(SYBR Green Master Mix)，上海恒斐生物科技有限公司(Q111-02)。

1.3 主要儀器與設(shè)備：病理切片機(jī)，德國Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)；顯微鏡，奧林巴斯BX53型生物顯微鏡；實時熒光定量PCR儀，ABI(Quant Studio 6)；微量分光光度計，杭州奧盛儀器有限公司(Nano-100)；電熱恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司(HW-SY11-K P2)；電泳儀，北京海天友誠科技有限公司(DYCZ-25D)；紫外分析儀，上海路陽儀器有限公司(LUV-270A)。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模、給藥及取材：將180只大鼠隨機(jī)分為六組：空白組、模型組、護(hù)肝片組及益脾養(yǎng)肝方高、中、低劑量組，每組30只。除空白組外，其余各組均以0.5 ml/100 g 的二乙基亞硝胺腹腔注射，每周50 mg/kg(2次/周，即1次/84 h)，連續(xù)給藥16周；空白組：給予同等條件的飼養(yǎng)與抓捕，同等時間點注射等量生理鹽水。造模次日起中藥高、中、低劑量組分別給予濃度為1.2、0.6、0.3 g/ml的益脾養(yǎng)肝方藥液灌胃，護(hù)肝片組按1 g/ml大鼠體重灌胃，空白組、模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。灌胃持續(xù)16周，1次/d。

待實驗周期結(jié)束，全部大鼠用10%的水合氯醛行腹腔注射(0.3 ml/100 g)，待大鼠麻醉后解剖腹腔，腹主動脈取血，3000 r/min離心15 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱備用；同時取各組大鼠肝臟組織，取部分肝組織放入4%多聚甲醛中，4 ℃固定過夜后制作石蠟切片及HE染色，其余肝組織置于-80 ℃冰箱備用。

2.2 制作組織病理片：將固定后的肝組織用酒精梯度脫水，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察并拍照。

2.3 肝細(xì)胞凋亡的檢測：先用PBS潤洗脫蠟后的病理切片，再用PBS稀釋2 mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/ml。在每個樣本上滴加100 μl的Proteinase K溶液，37 ℃孵育20 min。再用PBS潤洗樣本，去掉多余液體。按1∶5的比例用去離子水稀釋緩沖液。每個樣本滴加100 μl 緩沖液使其覆蓋樣本，37 ℃孵育10 min。之后在組織上加入TdT孵育緩沖液，勿讓組織干片。將蓋玻片蓋在組織上，載玻片置于濕盒內(nèi)室溫孵育60 min，PBS反復(fù)洗滌后，添加DAPI繼續(xù)孵育5 min，染核后使用PBST 沖洗去除多余DAPI，使用含抗熒光淬滅劑封片液進(jìn)行封片后熒光顯微鏡下觀察大鼠肝細(xì)胞凋亡圖。

2.4 實時熒光定量PCR檢測miR-221表達(dá)量：取出各組大鼠肝組織，采用Trilzol法提取總RNA，采用微量分光計測定RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳對RNA的完整性進(jìn)行檢測。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，以U6為內(nèi)參，在表1所示的引物條件下進(jìn)行miR-221表達(dá)的檢測。miR-221引物序列合成后在PCR儀上進(jìn)行實時定量反應(yīng),以2-△△Ct法來計算miR-221的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次以校正最終結(jié)果，見表1。

表1 rno-miR-221引物序列表

3 統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD檢驗，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠一般情況比較 空白組大鼠的毛色光亮，形體適中，動作行為敏捷，進(jìn)食水情況正常且未出現(xiàn)死亡。其他組大鼠實驗7周后，食量明顯減少，毛色晦暗，動作反應(yīng)遲緩，益脾養(yǎng)肝方高劑量組和護(hù)肝片組上述癥狀有所改善，模型組和益脾養(yǎng)肝方低劑量組大鼠各死亡1只。

2 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化情況比較 空白組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生破壞，竇間隙正常，細(xì)胞核大小正常，其余各組肝組織結(jié)構(gòu)均受到破壞，且有異型性增生細(xì)胞緊密排列，肝細(xì)胞胞質(zhì)水腫，模型組及益脾養(yǎng)肝方中、低劑量組表現(xiàn)更為明顯，且模型組及益脾養(yǎng)肝方中、低劑量組可見多核細(xì)胞，部分胞核體積成倍增大，竇間隙消失，能夠觀察到較為明顯的淋巴以及炎性浸潤(圖1)。

3 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡情況比較 空白組幾乎無紅染的凋亡細(xì)胞顯示，其余各組均可見因細(xì)胞膜通透性改變導(dǎo)致水腫，體積增大的凋亡肝細(xì)胞(圖2)。六組肝細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，其余各組肝細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)均升高(P<0.05)；與模型組比較，護(hù)肝片組及益脾養(yǎng)肝方中、高劑量組肝細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.05)；與護(hù)肝片組比較，益脾養(yǎng)肝方低、中劑量組肝細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)均升高(P<0.05)，且護(hù)肝片組與益脾養(yǎng)肝方高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；益脾養(yǎng)肝方各劑量組之間比較，高劑量組肝細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)均低于低、中劑量組(P<0.05)，且中劑量組低于低劑量組(P<0.05)。見表2。

4 各組大鼠肝組織miR-221表達(dá)水平比較 見表3。六組肝組織miR-221相對表達(dá)量比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，其余各組miR-221相對表達(dá)量均升高(P<0.05)；與模型組比較，護(hù)肝片組及益脾養(yǎng)肝方低、中、高劑量組miR-221相對表達(dá)量降低(P<0.05)；與護(hù)肝片組比較，益脾養(yǎng)肝方低、中、高劑量組miR-221相對表達(dá)量均升高(P<0.05)；益脾養(yǎng)肝方各劑量組之間比較，高劑量組miR-221相對表達(dá)量均低于低、中劑量組(P<0.05)，且益脾養(yǎng)肝方中劑量組低于低劑量組(P<0.05)。

A：空白組；B：模型組；C：護(hù)肝片組；D：益脾養(yǎng)肝方低劑量組；E：益脾養(yǎng)肝方中劑量組；F：益脾養(yǎng)肝方高劑量組 圖1 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡表達(dá)，胞核呈紅色熒光(HE染色，×200)

A：空白組；B：模型組；C：護(hù)肝片組；D：益脾養(yǎng)肝方低劑量組；E：益脾養(yǎng)肝方中劑量組；F：益脾養(yǎng)肝方高劑量組 圖2 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡表達(dá)，胞核呈紅色熒光(免疫熒光染色，×400)

表3 各組大鼠肝組織miR-221相對表達(dá)量比較

討 論

肝臟組織在形成完整的肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma cancer，HCC)之前會經(jīng)歷一個“肝炎-肝硬化-肝癌”過程[5]，而在肝硬化到肝癌之間會出現(xiàn)一個復(fù)雜且漫長的癌前病變階段，對該階段的干預(yù)或治療與祖國醫(yī)學(xué)中的“治未病”理念不謀而合。肝積、肥氣、臌脹、積聚、黃疸以及肺積在中醫(yī)歸屬于肝癌疾病范疇，原發(fā)性肝癌中醫(yī)辨證分型主要體現(xiàn)為氣滯血瘀型、肝郁脾虛型、肝腎陰虛型、肝郁氣滯型以及脾胃氣虛型等方面[6]。益脾養(yǎng)肝方有活血行氣、益脾養(yǎng)肝以及消腫散結(jié)等功效。劉亞珠等[7]研究發(fā)現(xiàn)益脾養(yǎng)肝方對于大鼠肝癌癌前病變具有抑制作用，其作用可能與抗細(xì)胞異常增殖和抗細(xì)胞氧化損傷有關(guān)。李福廣等[8]認(rèn)為益脾養(yǎng)肝組方之一的姜黃可以抑制肝細(xì)胞癌相關(guān)肝星狀細(xì)胞的增殖，并降低其侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，高劑量的益脾養(yǎng)肝方與護(hù)肝片具有相似的作用，兩組對抑制肝癌發(fā)生具有積極作用。在檢測肝細(xì)胞凋亡情況時發(fā)現(xiàn)，建模各組細(xì)胞凋亡能力均有不同程度的升高，而護(hù)肝片組和高劑量益脾養(yǎng)肝方治療的大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)有所下降，中劑量的益脾養(yǎng)肝方次之，結(jié)果表明了護(hù)肝片組及中、高劑量的益脾養(yǎng)肝方能抑制肝細(xì)胞的凋亡作用。

隨著研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)相關(guān)信號通路及轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在肝癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮巨大作用。miRNA是一種長度為19～24個核苷酸的小分子單鏈RNA，它們可結(jié)合目標(biāo)靶mRNA的3’非編碼區(qū)(3’-UTR)從而發(fā)揮對于靶標(biāo)基因的調(diào)控作用，進(jìn)一步參與機(jī)體細(xì)胞發(fā)育以及各種生物學(xué)行為過程[9]。目前發(fā)現(xiàn)對于HCC，miR-221發(fā)揮著在HCC中類似原癌基因的作用[10]，即miR-221是HCC的致癌因子。最近的一項研究表明，miR-221刺激腫瘤的發(fā)生并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，從而大大縮短了肝癌小鼠模型的平均死亡時間[11]。miR-221在腫瘤進(jìn)展中的促進(jìn)作用可能是由于miR-221參與了某些肝癌癌前病變的機(jī)制，如NF-κB途徑被認(rèn)為是炎癥和惡性腫瘤之間的潛在聯(lián)系[12-13]。此外，miR-221還作為肝癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的啟動子，通過靶向AdipoR1基因來激活HCC細(xì)胞[14]。而Fu等[15]發(fā)現(xiàn)miR-221通過靶向植物同結(jié)構(gòu)域指蛋白(PHF2)促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示建模各組大鼠肝組織miR-221表達(dá)水平均明顯升高，提示miR-221過表達(dá)可能是HCC發(fā)生的風(fēng)險。相對未做任何干預(yù)的模型組，護(hù)肝片組及益脾養(yǎng)肝方低、中、高劑量組miR-221表達(dá)水平均明顯降低，提示應(yīng)用相關(guān)藥物治療后，miR-221表達(dá)受到抑制。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，護(hù)肝片組大鼠miR-221表達(dá)水平高于益脾養(yǎng)肝方低、中、高劑量組，而益脾養(yǎng)肝方高劑量組miR-221表達(dá)水平均低于低、中劑量組，且益脾養(yǎng)肝方中劑量組miR-221表達(dá)水平低于低劑量組。實驗結(jié)果表明，一定劑量的益脾養(yǎng)肝方對肝組織miR-221表達(dá)具有抑制作用。

綜上所述，本益脾養(yǎng)肝方能夠改善肝臟功能，延緩肝癌癌前病變進(jìn)展，其治療機(jī)制可能與抑制miR-221表達(dá)作用有關(guān)。