劉彤 任憲奔 李營 韓守孟 張為 李明昌

爆震傷(即沖擊傷)是指沖擊波擊中時(shí)釋放出的能量而造成的各種損傷,是戰(zhàn)爭中最常見的損傷。顱腦爆震傷與其他創(chuàng)傷相似，但又有其特殊性，能引起神經(jīng)功能障礙。本研究通過建立顱腦爆震傷大鼠模型，檢測爆震傷對大鼠神經(jīng)功能的損害作用，探討其初步機(jī)制，為顱腦爆震傷的防治提供一種可靠的動(dòng)物模型。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：水合氯醛(武漢谷歌試劑公司)，免疫熒光抗體TUNEL試劑盒(Roche)，免疫組化抗體ZO-1(三鷹公司)，50g當(dāng)量圓柱狀TNT炸藥(北京理工大學(xué)爆炸科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，高速相機(jī)圖像采集系統(tǒng)(北京理工大學(xué)爆炸科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：選擇健康雄性SD大鼠32只，體重200～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分成對照組和模型組，模型組每組依據(jù)距離爆源遠(yuǎn)近(分別為0.4 m，0.5 m，0.6 m，0.7 m處)各隨機(jī)放置4只大鼠，分別為模型組1、2、3、4小組，對照組4只放置在同一現(xiàn)場遠(yuǎn)處，無爆源影響。顱腦爆震傷模型2小時(shí)后，行神經(jīng)行為學(xué)評分，然后取大鼠腦組織進(jìn)行研究。

3.實(shí)驗(yàn)方法：動(dòng)物模型制備：TNT爆炸后無金屬彈片，完全由爆炸沖擊波釋放能量，造成大鼠腦部單純爆震傷。 神經(jīng)行為學(xué)評分：大鼠神經(jīng)功能評分采用改良Garcia，同一單盲者在造模后2小時(shí)進(jìn)行評估，分為6項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評分(0～3或1～3分)，具體包括：(1)自主活動(dòng)；(2)四肢活動(dòng)；(3)提尾時(shí)前爪伸展；(4)攀爬抓持；(5)軀干兩邊的觸摸反應(yīng)；(6)大鼠觸須反應(yīng)。最多18分，最少零分。評分越低，說明神經(jīng)功能越差。 爆炸沖擊波強(qiáng)度數(shù)據(jù)計(jì)算：在爆炸試驗(yàn)中，圓柱形炸藥的質(zhì)量為50 g，炸藥直徑為30 mm，炸藥高度為43.4 mm。本研究利用商用有限元軟件ANSYS/AUTODYN對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)值模擬。模擬計(jì)算出距離爆原不同距離位置處沖擊波的超壓峰值及產(chǎn)生的沖量。

4.TUNEL雙標(biāo)免疫熒光法檢測大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

5.免疫組化檢測ZO-1蛋白表達(dá)，對比各組組內(nèi)及組間腦組織ZO-1蛋白表達(dá)量差異。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

1.爆震傷后神經(jīng)行為學(xué)評分變化:與對照組相比，爆震傷各組神經(jīng)行為學(xué)評分均明顯的下降。離爆源越近大鼠傷勢越重，評分越低，表明爆炸沖擊波隨距離逐漸衰減，距離越近爆炸沖擊波對大鼠造成的損傷越嚴(yán)重，距離越遠(yuǎn)對大鼠損傷越輕微。對照組神經(jīng)行為學(xué)評分為(18±0.00)分，爆震傷1組為(0±0.00)分，爆震傷2組為(10±0.41)分，爆震傷3組為(12±0.82)分，爆震傷4組為(17±0.41)分。我們選取爆震傷組2(距離爆源0.5 m)作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.爆炸沖擊波強(qiáng)度數(shù)據(jù)采集:利用商用有限元軟件ANSYS/AUTODYN對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)值模擬。首先利用AUTODYN-2D中的多材料歐拉公式對空氣區(qū)域進(jìn)行建模，得到包含空氣和高爆藥的楔體，共設(shè)置6個(gè)測點(diǎn)，測點(diǎn)到雷管點(diǎn)的距離分別為0.4 m、0.5 m、0.6 m、0.7 m、0.8 m、0.9 m。超壓計(jì)算結(jié)果見表1。

表1 超壓計(jì)算結(jié)果

3.爆震傷后腦組織神經(jīng)元凋亡情況:對照組凋亡率為(3.5±1.21)%，爆震傷組為(55.4±4.25)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖 1。

a：對照組神經(jīng)細(xì)胞凋亡染色(TUNEL雙標(biāo)免疫熒光法，×40)

4.ZO1蛋白表達(dá)變化:對照組ZO-1陽性率為(28.3±3.47)%，爆震傷組(4.8±1.26)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

a：對照組腦組織ZO-1(免疫組化，×40) b：爆震傷組腦組織ZO-1(免疫組化，×40)

討論

顱腦爆震傷是炸藥爆炸所產(chǎn)生的高壓波作用于頭面部，造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷。爆震傷在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生多重的、嚴(yán)重的腦震蕩。相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在伊拉克、阿富汗的局部戰(zhàn)爭中，有約3萬士兵遭遇過爆震傷[1]，克羅地亞戰(zhàn)爭中，顱腦爆震傷約占頭部受傷人數(shù)的一半[2]。近年來，爆震傷的發(fā)生率逐年遞增[3]。

爆震傷致傷機(jī)制復(fù)雜，普遍認(rèn)為血腦屏障通透性增加和炎癥反應(yīng)是爆震傷最重要的病理生理機(jī)制。有研究表明，由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞表面的緊密連接蛋白如Claudins、Occludin、ZO、JAMs等之間組成的緊密連接(tight junction，TJ)是維持血腦屏障通透性最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。血腦屏障在腦組織受損或缺血、缺氧和炎癥刺激下，引起血腦屏障通透性升高而引起腦水腫[4]。爆震傷者行為學(xué)障礙與血腦屏障通透性增加相關(guān)[5]，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，血腦屏障通透性在爆震傷后增加[6]。

本研究通過使用合適當(dāng)量的TNT炸藥，建立一種質(zhì)量穩(wěn)定的大鼠爆震傷模型，真實(shí)地模擬了實(shí)戰(zhàn)當(dāng)中爆震傷對傷者產(chǎn)生的損害。由于TNT爆炸無彈片產(chǎn)生，僅有氣浪沖擊波的作用。相對于其他致傷源而言，更大程度上復(fù)原了戰(zhàn)場爆炸沖擊波對受者頭部的損害過程。我們設(shè)置了不同距離的實(shí)驗(yàn)組，與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組大鼠均受到一定程度的神經(jīng)功能損害。實(shí)驗(yàn)組間距離爆源越近，損傷程度越明顯。0.4 m處大鼠全部死亡，0.5 m處大鼠損傷重。神經(jīng)行為學(xué)評分明顯降低，0.6 m處大鼠損傷較重，神經(jīng)行為學(xué)評分降低較明顯，0.7 m、0.8 m處大鼠損傷較輕，神經(jīng)行為學(xué)評分改變較小。我們認(rèn)為，0.4～0.5 m是大鼠具有極高死亡風(fēng)險(xiǎn)的距離，0.5～0.6 m是建立爆震傷大鼠模型適合的距離，如需建立穩(wěn)定可靠的大鼠爆震傷模型可選用0.5～0.6 m距離。鑒于后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要，我們選用0.5 m作為爆震傷最適合的模型制作距離。

后續(xù)病理研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，爆震傷組存在相對較高的神經(jīng)細(xì)胞凋亡陽性率，表明爆震傷能通過損傷動(dòng)物腦組織神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)而引起神經(jīng)功能障礙。ZO-1蛋白是反映血腦屏障通透性的關(guān)鍵分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織ZO-1蛋白表達(dá)量低于對照組。與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞表面的緊密連接蛋白如Claudins、Occludin、ZO、JAMs等之間組成的緊密連接是維持血腦屏障通透性最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，ZO-1作為緊密連接的重要組成，其表達(dá)量明顯降低，表明爆震傷可能通過對血腦屏障的緊密連接分子造成破壞以及造成腦出血，引起血腦屏障通透性增加，產(chǎn)生炎癥及腦水腫等病理變化，進(jìn)而造成顱腦神經(jīng)功能障礙。該研究結(jié)果表明，對血腦屏障緊密連接分子ZO-1的有效保護(hù)[7],可能是預(yù)防和減輕爆震傷損傷的有效手段。TREM-1可能通過促進(jìn)p38MAPK/MMP-9的激活和ZO-1的降解參與sah誘導(dǎo)的早期腦損傷(EBI)的發(fā)病機(jī)制，而TREM-1的抑制明顯減輕了EBI的嚴(yán)重程度，為EBI的治療提供了新的途徑[8]。ω-3魚油脂肪乳對重型顱腦創(chuàng)傷具有幫助恢復(fù)的作用[9]。