程偉華 盧振華 趙利鋒 呂高波

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)主要采取手術(shù)切除、射頻消融、化療和靶向治療等，但復(fù)發(fā)率高、遠(yuǎn)期生存期低[1]。因此尋找HCC的預(yù)后標(biāo)志物對(duì)制定治療方案、降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、提高遠(yuǎn)期生存率具有重要的臨床價(jià)值。雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶-2(dual-speci city tyrosine-(Y)-phosphorylation-regulated kinase-2，DYRK2)是DYRK家族成員之一。與多種實(shí)體瘤的腫瘤生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)[2]。但DYRK2對(duì)HCC患者臨床預(yù)后的影響目前尚未報(bào)道。本研究主要探討DYRK2蛋白在預(yù)測(cè)HCC患者術(shù)后生存期的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究納入了2010年1月至2015年12月期間在我院接受根治性手術(shù)的158例HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)原發(fā)性HCC，并經(jīng)病理確診；(2)接受根治性手術(shù)切除；(3)術(shù)前未接受化療或靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)轉(zhuǎn)移性HCC；(2)HCC復(fù)發(fā)；(3)術(shù)前接受其他治療。158例患者的平均年齡為(58.3±12.4)歲，男性103例、女性55例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)討論通過，并經(jīng)患者簽署知情同意書。

二、免疫組化染色

將HCC患者的癌組織及癌旁組織的石蠟包埋樣本進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯、酒精梯度洗脫，切片脫蠟至水化，加入3%過氧化氫孵育5 min。自來水沖洗后，PBS浸泡3 min，加入含5%的山羊血清封閉，室溫孵育10 min，加入1∶100稀釋的抗DYRK2多克隆抗體(貨號(hào)：ab37912，Abcam公司，美國(guó))，4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，自來水充分沖洗、復(fù)染、封片。

三、免疫組化分析

由2名病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行，評(píng)估內(nèi)容包括陽性率評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分，病理科醫(yī)師對(duì)患者臨床資料和預(yù)后情況均不知情。陽性率評(píng)分：每個(gè)樣本隨機(jī)選擇5個(gè)視野，在200倍視野下測(cè)定陽性(棕色)細(xì)胞占總細(xì)胞百分比為陽性率并取平均值，以<10%陽性率為0分、10%～30%陽性率為1分、30%～50%陽性率為2分、50%～70%陽性率為3分、>70%陽性率為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：根據(jù)陽性細(xì)胞的棕色染色強(qiáng)度，分為0分(無染色)、1分(弱染色)、2分(中等染色)、3分(強(qiáng)染色)。DYRK2的最終評(píng)分為陽性率評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積，范圍為0～12分，其中0～4分定義為低表達(dá)、5～12分定義為高表達(dá)。

四、術(shù)后隨訪

所有HCC患者出院通過門診隨訪，隨訪內(nèi)容包括病史、體格檢查、CT或MRI等腹部影像學(xué)檢查，術(shù)后1年內(nèi)每3個(gè)月一次，術(shù)后1年后每6個(gè)月一次。以手術(shù)日期至確診復(fù)發(fā)日期為無進(jìn)展生存期(progress-free survival，PFS)，以手術(shù)日期至死亡日期為總生存期(overall survival，OS)。最后一次隨訪時(shí)間為2018年9月30日。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、DYRK2染色情況

見圖1。158例HCC患者的癌組織中DYRK2的組化評(píng)分顯著低于癌旁組織[(4.8±1.3)分 vs (9.6±2.2)分]，P<0.001。

圖1 3例HCC患者癌與癌旁DYRK2染色的典型圖片。

二、DYRK2低表達(dá)與高表達(dá)患者的臨床資料比較

見表1。根據(jù)DYRK2染色評(píng)分，將158例HCC患者分為低表達(dá)組(≤4分，95例)和高表達(dá)組(≥5分，63例)。與DYRK2高表達(dá)組相比，DYRK2低表達(dá)患者中AFP>20 ng/mL、腫瘤直徑>5 cm、TNM III-IV期、復(fù)發(fā)患者比例更高(P<0.05)；但兩組患者的年齡、性別、HBsAg陽性率、肝硬化比例和組織學(xué)分級(jí)等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同DYRK2表達(dá)水平患者的臨床及病理資料比較

三、DYRK2低表達(dá)與高表達(dá)患者的生存期比較

見圖2。與DYRK2高表達(dá)組患者相比，DYRK2低表達(dá)組患者的PFS和OS均明顯縮短(均P<0.001)。

圖2 不同DYRK2表達(dá)水平患者的PFS和OS生存曲線

四、影響HCC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析

見表2。單因素及多因素Cox回歸分析顯示，DYRK2低表達(dá)(HR=1.874，95%CI：1.521～2.339，P<0.001)和TNM III-IV期(HR=1.455，95%CI：1.210～1.782，P<0.001)是預(yù)測(cè)HCC患者OS縮短的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 影響HCC患者OS的單因素及多因素Cox回歸分析

討 論

DYRK2是DYRK家族的主要成員之一，該激酶家族對(duì)酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)均有磷酸化酶的活性[3]。DYRK2能夠與含有EDD、DDB1和VPRBP結(jié)構(gòu)域(即EDVP復(fù)合物)的E3連接酶結(jié)合，從而直接磷酸化目標(biāo)蛋白，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期中起到重要的作用[4]。如DYRK2可直接磷酸化p53蛋白的第46位絲氨酸而增強(qiáng)p53的促凋亡活性，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5]。細(xì)胞周期過程中G1/S期轉(zhuǎn)換的失調(diào)將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而c-Jun/c-Myc蛋白的降解是G1/S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵過程。有研究發(fā)現(xiàn)DYRK2能磷酸化c-Jun和c-Myc蛋白，從而加速c-Jun/c-Myc蛋白由泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解過程，從而延長(zhǎng)G1期而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[6]，提示DYRK2在腫瘤中起到抑制腫瘤增殖的作用。此外，DYRK2還能夠通過磷酸化Snail蛋白促進(jìn)其降解而抑制乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞惡性侵襲轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)步驟，這提示了DYRK2在腫瘤中可抑制轉(zhuǎn)移侵襲的發(fā)生。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DYRK2在HCC癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，這提示在HCC中DYRK2的表達(dá)水平受到抑制。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)HCC患者的DYRK2表達(dá)降低與AFP水平、腫瘤直徑、TNM分期和術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。通過生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，DYRK2表達(dá)降低與HCC患者的PFS縮短和OS縮短密切相關(guān)，進(jìn)一步通過單因素和多因素Cox回歸分析證實(shí)DYRK2低表達(dá)是HCC患者總體預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示DYRK2的表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后的良好指標(biāo)。