劉嬌 劉青 王大明 賈興旺

我國(guó)是慢性乙型肝炎(CHB)高發(fā)區(qū)，目前全球約有2.4億人攜帶乙型肝炎病毒(HBV)，HBV感染可導(dǎo)致急性或慢性肝炎，是引起肝纖維化、肝硬化、肝癌重要因素之一[1-2]。微小RNA(miRNA)對(duì)肝損傷十分敏感，mir-122、mir-146a均是免疫相關(guān)性miRNA，可參與細(xì)胞免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，mir-122可預(yù)測(cè)干擾素治療CHB的效果，且與HBV DNA高載量CHB患者肝損傷及預(yù)后有關(guān)，mir-146a與肝癌、肝損傷等肝臟疾病密切相關(guān)[3-7]。外泌體中含有大量HBV DNA及miRNA等成分，是HBV一種重要傳播介質(zhì)[8,9]。 本研究探討CHB患者血清外泌體mir-122、mir-146a表達(dá)水平，以及其與HBV DNA載量的關(guān)系，為臨床CHB的靶向治療提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

收集2018年5月至2019年12月南京醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院收治的CHB患者285例。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[10]中關(guān)于CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②血清樣本采集前患者未接受任何治療；③臨床檢測(cè)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝癌或其他腫瘤者；②妊娠或哺乳期婦女；③合并脂肪肝或其他類(lèi)型肝炎病毒感染者；④心、肺、腎等臟器功能異?；驀?yán)重病變者。根據(jù)血清外泌體HBV DNA載量，分為3組，每組95例：低載量組(HBV DNA<1×105拷貝/mL)，其中男性65例，女性30例，年齡18～75歲；中載量組(1×105拷貝/mL ≤HBV DNA≤1×107拷貝/mL)男性66例，女性29例，年齡19～76歲；高載量組(HBV DNA>1×107拷貝/mL)，男性67例，女性28例，年齡18～75歲。另取同期門(mén)診健康體檢者血清標(biāo)本95名為對(duì)照組，男性63名，女性32名，年齡18～76歲。4組受試者性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有樣品采集及資料調(diào)查均取得受試者及其家屬知情同意并簽字確認(rèn)。

二、主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天有限公司；Exosome Isolation Reagent試劑盒購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒、microRNA定量(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa生物公司；透明質(zhì)酸酶(HA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限司)；Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)試劑盒購(gòu)自上海彩佑生物科技有限公司；Ⅳ型膠原(C Ⅳ)試劑盒購(gòu)自南京萊富賽生物科技有限公司；層粘連蛋白(LN)試劑盒購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成。MODEL550型酶標(biāo)儀、7500型qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

三、方法

(一)血清外泌體制備 采集所有受試者晨起空腹外周靜脈血10 mL，3000 r/min(離心半徑為10 cm)，4℃離心10 min ，收集血清。采用血清外泌體提取試劑盒提取血清中外泌體，具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取物中外泌體采用透射電鏡觀(guān)察鑒定。

(二)血清外泌體HBV DNA載量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)血清外泌體HBV DNA載量。

(三)血清外泌體mir-122、mir-146a水平檢測(cè) 所有受試者均分別取50 μL外泌體樣本，采用RNA提取試劑盒提取外泌體總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用RT-qPCR法對(duì)mir-122、mir-146a進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共25 μL：SYBR Premix ExTaqⅡ(2×)12.5 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 s；95℃ 30 s；60℃ 30 s；72℃ 15 s；40個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線(xiàn)。mir-122上游引物序列(5′→3′)為：CCC GTG ATG CTT CTT TTC TC，下游引物序列(5′→3′)為：ATG TGA GAG GCA GGG TTC AG；mir-146a上游引物序列(5′→3′)為：CAT GGG TTG TCT CAG TGT CAG AGC T，下游引物序列(5′→3′)為：TGC CTT CTG TCT CCA GTC TTC CAA；內(nèi)參U6上游引物序列(5′→3′)為：GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T，下游引物序列(5′→3′)為：CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT。采用2-△△CT法對(duì)血清外泌體mir-122、mir-146a相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

(四)血清肝纖維化指標(biāo)檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清肝纖維化指標(biāo)，主要包括HA、PC Ⅲ、C Ⅳ及LN，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。HA正常范圍<120 ng/mL ；PC Ⅲ 正常范圍<15 ng/mL； C Ⅳ正常范圍<95 ng/mL；LN：正常范圍<130 ng/mL。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、4組患者血清外泌體HBV DNA 載量及mir-122、mir-146a表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，低、中、高載量組血清外泌體HBV DNA 載量及mir-122水平依次增加，mir-146a表達(dá)水平均依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

二、4組患者血清肝纖維化指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，低、中、高載量組血清肝纖維化指標(biāo)HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均依次增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

三、CHB患者血清外泌體mir-122、mir-146a表達(dá)水平與HBV DNA 載量的相關(guān)性

結(jié)果顯示，血清外泌體mir-122與mir-146a水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.765，P<0.05)，與HBV DNA 載量呈正相關(guān)(r=0.773，P<0.05)；mir-146a與HBV DNA 載量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.840，P<0.05)。

四、CHB患者血清外泌體mir-122、mir-146a表達(dá)水平與肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性

結(jié)果顯示，血清外泌體mir-122水平與HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均呈正相關(guān)(r=0.764、0.699、0.665、0.697，P<0.05)，mir-146a水平與HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.779、-0.731、-0.691、-0.738，P<0.05)。

表1 四組患者血清外泌體HBV DNA 載量及mir-122、mir-146a表達(dá)水平比較

表2 4組患者血清肝纖維化指標(biāo)比較(ng/mL，±s)

討 論

外泌體內(nèi)容物包括特性蛋白、脂質(zhì)、DNA、mRNA及miRNA等多種分子，可參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)傳遞、血管生成、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等生理病理過(guò)程。與游離性miRNA相比，外泌體源性miRNA穩(wěn)定性及抗降解能力更強(qiáng)，在CHB及肝細(xì)胞癌診斷及靶向治療中意義重大[11-14]。

mir-122與HBV密切相關(guān)，是一種肝損傷標(biāo)志性miRNA[15]。王福玲[16]研究報(bào)道，血清mir-122水平隨HBV DNA增加而升高，與HBV DNA呈正相關(guān)。Mosedale等[17]研究報(bào)道，外泌體mir-122水平在藥物性肝損傷細(xì)胞中顯著增加，與細(xì)胞程序性死亡及細(xì)胞膜通透性增加有關(guān)。Jiao等[18]研究報(bào)道，持續(xù)病毒應(yīng)答組血清和外泌體mir-122-5p水平均顯著高于無(wú)應(yīng)答組，mir-122-5p可作為丙型病毒性肝炎診療的生物標(biāo)志。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，HBV DNA低、中、高載量組血清外泌體mir-122表達(dá)水平均顯著增加，且與HBV DNA載量、肝纖維化指標(biāo)HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均呈正相關(guān)。HA主要在肝內(nèi)皮細(xì)胞中降解，肝臟組織受損時(shí)，對(duì)其降解能力下降，可導(dǎo)致血清HA水平增加。PC Ⅲ、C Ⅳ、LN是肝硬化早期指標(biāo)，可反映是否肝纖維化。提示血清外泌體mir-122水平增加可能與CHB患者HBV DNA復(fù)制及肝纖維化有關(guān)，影響CHB發(fā)生發(fā)展。

mir-146a與多種慢性炎癥性疾病有關(guān)，可參與天然免疫和獲得性免疫過(guò)程，在肝臟疾病中亦發(fā)揮重要作用[7, 19]。馬宏豐和石小哲[20]研究報(bào)道，mir-146a在原發(fā)性肝癌組織及HepG2細(xì)胞中均顯著下調(diào)，過(guò)表達(dá)mir-146a可降低HepG2細(xì)胞增殖，以及其遷移及侵襲。周興宏等[21]研究報(bào)道，三七皂苷R1可通過(guò)上調(diào)mir-146a水平減輕ApoE-/-小鼠血糖血脂水平，保護(hù)小鼠肝臟炎癥損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清外泌體mir-146a表達(dá)水平隨HBV DNA載量增加而降低，與mir-122、HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均呈負(fù)相關(guān)，提示CHB患者血清外泌體mir-146a可能與mir-122起拮抗作用，影響HBV DNA復(fù)制及肝纖維化進(jìn)程，血清外泌體mir-122、mir-146a水平有可能成為CHB患者靶向治療的新型標(biāo)志物。

mir-122和mir-146a參與CHB發(fā)生發(fā)展的具體炎癥相關(guān)通路尚不完全清楚，有待加大樣本量進(jìn)一步深入探究。