劉媛媛，陸婉瑤，劉 雙，秦雅菲，楊翊暉，丁 晨，郭 蓓，2**

(1.北京農(nóng)學(xué)院 a.植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，b.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院；2.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

大豆的豆莢是莢果的一種，大豆的成熟期，豆莢的背縫線與腹縫線開裂從而種子從豆莢散出的現(xiàn)象稱為炸莢(Pod-shattering)[1-2]。大豆的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，豆莢的炸裂會(huì)對(duì)產(chǎn)量造成嚴(yán)重的影響。易炸莢品種與中度炸莢的品種造成的減產(chǎn)可以達(dá)到57～175 和0～186 kg/hm2[3]。炸莢在其他油料作物和豆科作物中也有發(fā)現(xiàn)[4]。

植物MADS-box基因家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著非常重要的作用[5]，控制許多發(fā)育過程，包括根、花還有果實(shí)的發(fā)育[6]。擬南芥中的FRUITFULL(FUL)基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，研究表明該基因起到調(diào)控?cái)M南芥開花時(shí)間、花分生組織的分化、莖生葉的發(fā)育以及心皮與果實(shí)的發(fā)育的作用。徐勇等研究了桃樹(Prunuspersica)中與擬南芥FUL同源的基因PpMADS6，過表達(dá)PpMADS6的擬南芥植株出現(xiàn)了花期提前，單花器官增多，成熟期的角果不易開裂等一系列性狀[7]。AGL8基因也被稱作AGAMOUS-like8，F(xiàn)RUITFULL，F(xiàn)UL等，前人的研究發(fā)現(xiàn)，AGL8基因?qū)π钠さ陌l(fā)育和分裂組織的分化起到調(diào)控作用[8-9]。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李冉陽[10]通過同源擴(kuò)增從大豆中克隆得到與擬南芥FUL基因相似的GmAGL8基因，同時(shí)對(duì)GmAGL8進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，比對(duì)了GmAGL8與桃PpMADS6和擬南芥FUL的核酸序列，相似度分別為 80% 和 77% ，三者的氨基酸序列同源性為74%。在GmAGL8中發(fā)現(xiàn)與MADS基因家族相似的MEF2，并找到可能與多聚體的形成有關(guān)的K-box基因。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GmAGL8的功能，本試驗(yàn)將構(gòu)建的過表達(dá)GmAGL8的載體(pCAMBIA1300∷GmAGL8)和反義抑制表達(dá)GmAGL8的載體(pCAMBIA1300∷antiGmAGL8)轉(zhuǎn)入擬南芥中，觀察轉(zhuǎn)基因后代的表型變化，以驗(yàn)證大豆GmAGL8基因的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：擬南芥(Columbia)，擬南芥agl8突變體(購自英國(guó)諾丁漢大學(xué))；表達(dá)載體：中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的GmAGL8過表達(dá)載體pCAMBIA1300∷GmAGL8，GmAGL8反義抑制表達(dá)載體pCAMBIA1300∷antiGmAGL8；供試農(nóng)桿菌：LBA4404；抗生素：卡那霉素；購自北京擎科生物科技有限公司的T5 Direct PCR Kit(Plant)及遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)基礎(chǔ)試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥的室內(nèi)培養(yǎng) 將擬南芥種子置于4 ℃冰箱低溫春化48 h后播種，萌發(fā)兩周后移栽，培養(yǎng)土為泥炭土∶蛭石∶珍珠巖3∶3∶1的混合土。培養(yǎng)室內(nèi)溫度設(shè)置為26 ℃，每天16 h光照/8 h黑暗，光強(qiáng)1 500 lx，空氣相對(duì)濕度55%～65%。擬南芥喜濕，在培養(yǎng)過程中要注意保持空氣相對(duì)濕度，同時(shí)防止土壤染菌。

1.2.2 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化(花浸法) 將含有陽性轉(zhuǎn)化子的農(nóng)桿菌菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體。配置1/2MS液體培養(yǎng)基100 mL，加入20 μL的silwetL-77，重懸菌體使OD600重新達(dá)到1.0左右，此重懸液即為侵染液。擬南芥種植大約6周后去其初生花序，初次侵染需將已開的花全部剪掉。將擬南芥的花序部分浸入侵染液1 min，期間晃動(dòng)，避光培養(yǎng)24 h后恢復(fù)原培養(yǎng)條件。在初次轉(zhuǎn)化后可根據(jù)植株?duì)顟B(tài)進(jìn)行重復(fù)侵染，侵染3次后可等待果莢成熟收獲種子[11-12]。

1.2.3 種子的抗生素篩選 用70%乙醇、2%的次氯酸鈉(每50 mL加15 μL吐溫)依次對(duì)種子消毒。消毒后的種子與0.1%的瓊脂糖混合，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基(含Kan=50 mg/L)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選。1周左右即可初步篩選轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定 一種方法為傳統(tǒng)的CTAB法提取DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)；另一種方法無需提取DNA，利用T5 Direct PCR Kit(Plant)直接用植物組織進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在植物的嫩葉或幼莖上，用直徑1.5 mm打孔器取樣后直接放入PCR反應(yīng)體系(2×T5 Direct PCR Mix 12.5 μL，EYFP F/R引物各1 μL，dd H2O 10.5 μL至總體積25 μL)中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性3 min; 98 ℃, 10 s/58 ℃, 10 s/72 ℃, 20 s，34個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸4 min。使用的引物：GmAGL8-F 5’GGGGTACCATGGGGAGAGGAAGGGTGCAGT TG 3’；GmAGL8-R 5’CGGAATTCTTCATTTGTAGGACGAAGCATCCAAGG 3’；EYFP-F 5’ CTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGG GTG3’；EYFP-R 5’ TTACTTGTACAGCTCGT CCATGCCGAGAGTGATC 3’。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察 在相同培養(yǎng)條件下，觀察過表達(dá)和反義抑制GmAGL8的轉(zhuǎn)基因植株與擬南芥野生型及agl8突變體在生長(zhǎng)發(fā)育、開花時(shí)間、莢的形態(tài)、莢開裂等表型特征上的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果

2.1.1 過表達(dá)GmAGL8擬南芥的PCR鑒定結(jié)果 經(jīng)過抗卡那霉素篩選，獲得21棵抗性植株，采用傳統(tǒng)的CTAB法提取葉片DNA后，利用載體上帶有的EYFP基因片段設(shè)計(jì)引物以構(gòu)建好的pCAMBIA1300∷GmAGL8質(zhì)粒為陽性對(duì)照，ddH2O為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。

由電泳圖可見，在測(cè)定的21株中，有13株擴(kuò)增出了720 bp的目標(biāo)條帶，而野生型中沒有目標(biāo)條帶出現(xiàn)。初步確定1、4、6、11、13～21號(hào)為陽性植株，回收種子，繼續(xù)培養(yǎng)T1代。

2.2.2 anti-GmAGL8轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果 同樣通過抗生素篩選獲得轉(zhuǎn)化anti-GmAGL8的擬南芥30株。除了采用傳統(tǒng)方法檢測(cè)外，嘗試直接用葉片采用T5 Direct PCR Kit(Plant)進(jìn)行直擴(kuò)法PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖2，可以看出有2株擴(kuò)增出清晰可見的750 bp目標(biāo)條帶。繼續(xù)培養(yǎng)陽性株獲得T1代植株。比較圖1與圖2的擴(kuò)增結(jié)果顯示看出，與傳統(tǒng)的CTAB法提取DNA后進(jìn)行PCR相比，直擴(kuò)PCR的方法更加簡(jiǎn)便，且條帶清晰，只需小面積葉片，特別適合于材料稀少的樣品。

WT.野生型；+.陽性對(duì)照；-.陰性對(duì)照

WT.野生型；+.陽性對(duì)照；-.陰性對(duì)照

2.3 擬南芥的表型觀察結(jié)果

將過表達(dá)AGL8轉(zhuǎn)基因植株T1代(12株)，anti-GmAGL8轉(zhuǎn)基因植株T1代(10株)，野生型植株(10株)，agl8突變體植株(5株)，在相同條件下進(jìn)行培育，仔細(xì)觀察不同生育時(shí)期，不同類型的植株表型上的差異。

2.3.1 葉片形態(tài) 如圖3顯示，在葉片形態(tài)方面，過表達(dá)GmAGL8植株(圖3-A)葉片相對(duì)較厚，呈圓形；野生型植株(圖 3-B)及anti-GmAGL8植株(圖3-C)葉片均較薄，但野生型葉柄長(zhǎng)，葉片呈水滴形，而anti-GmAGL8植株葉柄較短葉片偏長(zhǎng)，呈長(zhǎng)圓形。agl8突變體植株(圖3-D)長(zhǎng)勢(shì)很弱，葉片發(fā)黃且植株矮小。

A.GmAGL8過表達(dá)植株；B.野生型；C.anti-GmAGL8植株；D.agl8突變體

2.3.2 角果形態(tài) 在角果形態(tài)方面(圖4)，與野生型(圖4-C)相比，anti-GmAGL8植株(圖4-A)角果短，長(zhǎng)度在0.5 cm左右；agl8突變體植株(圖4-B)角果短小且瘦弱，多為畸形和敗育果莢；過表達(dá)GmAGL8植株(圖4-D)角果較長(zhǎng)，與野生型相近，平均在1.20 cm，并且過表達(dá)植株果莢比同時(shí)期其他類型植株的果莢成熟更早。

A.anti-GmAGL8植株； B.agl8突變體； C.野生型；D.過表達(dá)GmAGL8植株

2.3.3 角果開裂情況 通過觀察發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥角果(圖5-A、5-B、5-C)在變黃成熟后一周正常開裂；而anti-GmAGL8轉(zhuǎn)基因擬南芥在角果成熟時(shí)果莢會(huì)完全炸開；過表達(dá)GmAGL8(圖5-D、5-E)轉(zhuǎn)基因擬南芥在角果成熟后兩周少有開裂；agl8突變體植株(圖5-F)雖然偶能結(jié)莢，但由于敗育和發(fā)育不全而干癟，幾乎得不到成熟的種子。通過隨機(jī)碰撞試驗(yàn)計(jì)算得到過表達(dá)植株抗裂角指數(shù)平均為0.44，anti-GmAGL8轉(zhuǎn)基因植株抗裂角指數(shù)平均為0.35，野生型抗裂角指數(shù)為平均0.38。通過IBM SPSS Statistics19進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明不同類型植株抗裂角指數(shù)差異顯著。

另外還發(fā)現(xiàn)，在開花時(shí)間方面，過表達(dá)GmAGL8植株出現(xiàn)早花現(xiàn)象，在發(fā)芽第20天左右開始開花；野生型植株一般在發(fā)芽第32天左右開花，而anti-GmAGL8與agl8突變體植株開花較遲，平均在發(fā)芽后40 d左右開花。

3 討論與結(jié)論

FUL基因作為受上游基因調(diào)控的基因，對(duì)控制擬南芥開花、葉片形態(tài)、果實(shí)發(fā)育起到調(diào)控作用。研究表明，F(xiàn)UL在蓮座葉、莖生葉維管束中表達(dá)，使葉片細(xì)胞排列緊密，擬南芥FUL基因的突變體會(huì)產(chǎn)生植株葉片變寬和葉肉細(xì)胞分布松散的現(xiàn)象，過表達(dá)IiFUL基因會(huì)使擬南芥出現(xiàn)莖生葉片的表型[11-13]。在本試驗(yàn)中過表達(dá)和抑制表達(dá)GmAGL8的植株葉片與野生型相比在厚度和形狀上也產(chǎn)生了一些變化，說明GmAGL8基因在某種程度上參與了葉片的發(fā)育過程。Mciller 曾研究發(fā)現(xiàn)，DEFH28是金魚草中FUL的直系同源基因，影響了轉(zhuǎn)基因擬南芥的花序分生組織的誘導(dǎo)和后期的花分生組織的形成[14]。對(duì)比本試驗(yàn)中GmAGL8的過表達(dá)、抑制表達(dá)、及突變體和野生型擬南芥植株的開花時(shí)間，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GmAGL8植株出現(xiàn)早花現(xiàn)象，果莢成熟早，anti-GmAGL8與agl8突變體植株開花較遲，這說明GmAGL8的表達(dá)在一定程度上可以促進(jìn)擬南芥開花轉(zhuǎn)變過程。Gu等[11]發(fā)現(xiàn)擬南芥ful突變體植株果莢短小，與本試驗(yàn)anti-GmAGL8、agl8突變體植株果莢短小的現(xiàn)象相一致。 另外，過表達(dá)GmAGL8轉(zhuǎn)基因擬南芥在角果成熟時(shí)少有開裂，而anti-GmAGL8由于果莢變短種子數(shù)量不變，使得莢果隨著成熟期到來過早開裂。

A、B、C.野生型；D、E.過表達(dá)GmAGL8植株；F.agl8突變體

目前，有關(guān)大豆炸莢基因的報(bào)道相對(duì)較少，F(xiàn)unatsuki等利用炸莢栽培性狀差距大的兩個(gè)大豆品種圖位克隆了抗炸莢基因pdh1，董陽等也以抗炸莢品種黑農(nóng)44和炸莢的野生大豆ZYD00755為材料克隆了抗炸莢基因SHAT1-5，前者在大豆的炸莢過程中降低莢皮扭曲力起到負(fù)調(diào)控作用，后者提高腹縫線次生細(xì)胞壁厚度起到正調(diào)控作用[15-16]。過表達(dá)GmAGL8基因的擬南芥角果不易炸裂，暗示該基因在控制植物果莢開裂中起到負(fù)調(diào)控作用。

GmAGL8基因作為FUL基因的同源基因，結(jié)合其他物種與FUL同源的基因在擬南芥中的研究，初步認(rèn)為GmAGL8基因在擬南芥中行使著與FUL基因類似的功能，對(duì)擬南芥葉片發(fā)育、開花時(shí)間以及果莢長(zhǎng)短與開裂均有影響，一定程度上促進(jìn)開花及果莢成熟，提高果莢抗裂性。已有學(xué)者進(jìn)行了油菜過表達(dá)FUL及其同源基因的研究，來控制油菜角果的開裂[17]。探尋GmAGL8基因?qū)Υ蠖构v開裂的影響，研究該基因與同樣作為控制大豆炸莢的pdh1、SHAT1-5基因作用模式的差異，對(duì)大豆品種的改良，提高大豆收獲效率與經(jīng)濟(jì)收益具有重要意義。