鄧宇運 李雁

高州市中醫(yī)院，廣東 高州525200

地中海貧血是臨床中常見的血液疾病之一，主要發(fā)病原因為血紅蛋白中的珠蛋白缺失或不足［1］。該病分布各個國家，但存在明顯的地域差異，東南亞發(fā)病人數(shù)較多［2］。目前，地中海貧血尚無有效治療措施。臨床上常采用婚前檢查、胎兒產(chǎn)前基因診斷等預防措施降低地中海貧血的患病率，通過血液學、遺傳學、分子生物學檢查來診斷是否患有地中海貧血。Gap-PCR技術(shù)是臨床常見的檢測方法之一，通過PCR技術(shù)擴增基因，同時檢測常見3種缺失型α-地中海貧血，為臨床診斷提供有效試驗依據(jù)。PCR-熒光探針法檢測的是bai-SYBR Green摻入到雙鏈duDNA中的量［3］，SYBR Green摻入到雙鏈DNA中后會發(fā)出熒光，而探針法是當探針結(jié)合到目標序列上，聚合酶降解探針后，探針上自帶的熒光基團離開淬滅基團，從而發(fā)出熒光，探針法特異性更強［4］。本研究探討PCR檢測在地中海貧血診斷中的應用價值，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年11月于我院婚前體檢者298例，年齡25～38歲，平均年齡（27.59±4.28）歲；男：女=1∶1。分別采用缺口PCR與PCR-熒光探針兩種方法進行檢測，檢測金標準為常規(guī)診斷和基因診斷兩種方法聯(lián)合診斷的結(jié)果。

1.2 納入排除標準 納入標準：①患者知情同意；②意識清楚，能正常表達。排除標準：①中途退出此次實驗的患者；②既往存在血液疾病的患者。

1.3 儀器9600PCR擴增儀（珠海黑馬公司）；DYY-8c型電泳儀（北京市六一儀器廠）；α-地中海貧血基因檢測試劑盒（深圳亞能生物公司），熒光定量PCR儀（型號：SLAN-96P，上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。

1.4 DNA提取和濃度測定 采用柱式法DNA提取試劑盒對外周靜脈血樣本提取DNA，并檢測提取質(zhì)量和濃度，DNA樣本的OD260nm/OD280nm比值應在1.6～2.0之間，OD260nm/OD230nm比值需≥2.0，濃度需≥50ng/μL。

1.5 檢測方法 所有患者均采用Gap-PCR與Gap-PCR技術(shù)檢測α-地中海貧血基因。

1.5.1 Gap-PCR技術(shù)檢測。α-地中海貧血基因檢測試劑盒可同時檢測中國人常見3種缺失型α-地中海貧血。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.2 PCR-熒光探針法檢測。每份樣本的PCR反應體系為20μL，每次試驗均做4個對比，每個受檢樣本復管測試，將反應管放在P熒光定量PCR儀上，選取需檢測反應管位置，勾選FAM、HEX、ROX、CY54種熒光標記物，對反應管編號，擴增檢測條件設置為37℃15min，95℃5min，1個循環(huán)；94℃30s→56℃10s→53℃60s，2個循環(huán)；92℃30s→60℃60s，30個循環(huán)。

1.6 結(jié)果判定 分別計算出各個樣本、校準品的ΔCt值，再將待測樣本的ΔCt減去校準品的ΔCt，得到ΔΔCt，計算2-ΔΔCt得出最終結(jié)果［4］。見表1。

1.7 MLPA復核不符樣本 按多重連接依賴探針擴增（MLPA）說明書操作，對Gap-PCR技術(shù)和基因拷貝數(shù)直接定量技術(shù)檢測結(jié)果不一致的樣本進行重復驗證。

表1 基因型結(jié)果判讀標準

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組檢測結(jié)果比較Gap-PCR組共檢出153例攜帶有α-地中海貧血基因缺失，其中，150例陽性，3例陰性，無α-地中海貧血基因缺失145例，PCR-FP組共檢出150例攜帶有α-地中海貧血基因缺失，均為陽性，無α-地中海貧血基因缺失148例。見表2。

表2 Gap－PCR組和PCR－FP組檢測結(jié)果比較（n）

2.2 不吻合樣本復核結(jié)果MLPA復核結(jié)果為1例基因型是--/αα，另外1例基因型為α-/αα，與缺口PCR技術(shù)檢測的結(jié)果相符，表明PCR-熒光探針法的檢測存在一定誤差，PCR-FP組漏檢率為1.01%。

2.3 兩組檢診斷價值比較 兩組診斷準確率、靈敏度、特異度無顯著差異（P＞0.05）。見表3。

表3 Gap－PCR組和PCR－FP組檢測的結(jié)果比較（%）

3 討論

地中海貧血是一種較常見的遺傳性疾病，有效預防本病的方法為抽血進行肽鏈檢測和基因分析，通過檢測父母是否患有該病，進而避免患病兒童的出生［5］。目前，針對地中海貧血的檢測方法有多種，其中，有專門檢測β-地中海貧血突變類型的方法，包括PCR-RDB、DNA測序等。檢測α-地中海貧血突變類型的方法，包括MAPH、RTFQ-PCR、MLPA等［6］。缺口PCR技術(shù)是臨床中檢測α-地中海貧血的主要方法之一，該技術(shù)在α-地中海貧血患者的篩查及診斷中占重要地位［7］。MLPA技術(shù)在檢測3種缺失型α-地中海貧血的應用效果較佳，可以同時檢測多個靶序列拷貝數(shù)的改變，但該方法檢測用時較長，試劑較昂貴，因此，臨床應用規(guī)模較?。?］。報道顯示，PCR-熒光探針法雖然檢測有效率略低于Gap-PCR技術(shù)，有判斷患者是否出現(xiàn)假陽性、使用儀器常規(guī)化、節(jié)約成本，同時操作簡單，減輕醫(yī)務人員工作量等明顯優(yōu)點［9］。

本研究顯示，Gap-PCR共檢出153例攜帶有α-地中海貧血缺失，無α-地中海貧血缺失145例，PCR-FP檢測結(jié)果分別為150例、148例。MLPA復核結(jié)果與缺口PCR技術(shù)檢測的結(jié)果相符，表明PCR-熒光探針法的檢測存在一定誤差，PCR-FP組漏檢率為1.01%。PCR-FP組檢測診斷的準確率組間無明顯差異，兩組診斷地中海貧血的靈敏度、特異性無顯著差異。

綜上所述，Gap-PCR與PCR-熒光探針法對α-地中海貧血均有一定診斷價值。