徐楊張學(xué)良杜惠芬柴丹丹連曉雯張瑞君李克生

1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州730050；2.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州750050

再生基因4（regenerating geneⅣ，RegⅣ）為鈣依賴性凝集素（c型凝集素）超家族的一員，是一種小分子分泌性蛋白質(zhì)，分子量約為18.2KD，由158個氨基酸構(gòu)成，包括22個氨基酸的信號肽和一個C型植物凝集素識別結(jié)構(gòu)域［1，2］。RegⅣ蛋白在消化道腫瘤、生殖系統(tǒng)及其他系統(tǒng)腫瘤以及潰瘍和炎性組織中呈高表達(dá)［3-5］，在正常胃腸道及胰腺中的表達(dá)水平非常低；其異常表達(dá)能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲和遷移，抵抗凋亡，并可提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物和放射線的耐受水平［6，7］。本研究團(tuán)隊前期對胃癌中RegⅣ和SOX9的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Reg IV可能通過調(diào)控SOX9的表達(dá)水平參與胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移［8］。可見，RegⅣ在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。本研究在大腸埃希菌系統(tǒng)中構(gòu)建攜帶目的基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)人RegⅣ全長重組蛋白，并對表達(dá)的包涵體蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)復(fù)性、純化，為制備RegⅣ單抗及開發(fā)新型的RegⅣ抗癌靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）購自Merck公司；pET-30a表達(dá)載體為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈；DNA Marker，蛋白質(zhì)Marker，限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ，T4 DNA連接酶購自Takara公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），純化試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒購自大連寶生物公司；本研究所用其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純；pEGFP-C1-RegIV質(zhì)粒由本實(shí)驗室前期試驗構(gòu)建保存（酶切位點(diǎn)為KpnⅠ/BamHⅠ）。

1.2 構(gòu)建pET-30a-RegIV重組質(zhì)粒 將本實(shí)驗室前期構(gòu)建保存的序列正確的pEGFP-C1-RegIV質(zhì)粒［8］和pET-30a表達(dá)載體分別用KpnⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，用DNA純化試劑盒分別進(jìn)行純化，然后將純化的目的片段和pET-30a空載體置于16℃水浴中連接過夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在LB平板（含50μg/mL卡那霉素）鋪板后37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，標(biāo)記并挑取單個菌落，以此做模板用pET-30a載體通用引物T7/T7terminator進(jìn)行PCR擴(kuò)增。待反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將PCR鑒定為陽性的克隆菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切（KpnⅠ/BamHⅠ）鑒定，取1mL菌液送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測定，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-30a-RegIV，將pET-30a-RegIV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，在LB平板（含50μg/mL卡那霉素）鋪板后37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

1.3 RegIV基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-30a-RegIV/BL21（DE3）重組菌加入到5mL LB培養(yǎng)基（含卡那霉素50μg/mL），37℃，200r/min過夜培養(yǎng)。次日將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶50轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中（含卡那霉素50μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0，取出1mL未誘導(dǎo)菌液做陰性對照，余者加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，4℃5500r/min離心10min，收集菌體，按1g/10mL向菌體沉淀中加入TE緩沖液，充分混勻，反復(fù)凍融3次，冰浴超聲破碎至溶液透明，4℃12000r/min離心15min，收集上清。向沉淀中加入適量2mol/L的尿素溶液，懸浮沉淀，4℃靜置5min，4℃12000r/min離心15min，收集上清。最后加入8mol/L的尿素溶液4℃振搖過夜，使沉淀完全溶解。分別將上清樣品、尿素溶液溶解的沉淀樣品及陰性對照品處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4 重組人RegIV蛋白的復(fù)性純化 取誘導(dǎo)表達(dá)的沉淀物以8 mol/L的尿素溶液溶解，以尿素溶液梯度遞減方式復(fù)性，用Sephacryl S-400凝膠層析柱純化，收集主蛋白峰，獲得目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定pET-30a-RegIV/DH5α菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約500～1000之間的片段，目的片段加上表達(dá)載體上的核苷酸序列理論值為814 bp，因此選取2號與7號菌液提取質(zhì)粒。見圖1。質(zhì)粒pET-30a-RegIV的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約500bp的目的片段，與理論值一致（477 bp）以及約5400bp的載體片段。見圖2。陽性克隆測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，目的基因片段與靶基因（序列號：NM_001159352.2）一致。見圖3。共編碼RegIV含信號肽序列的158個氨基酸殘基。加上表達(dá)載體上的38個氨基酸殘基，重組質(zhì)粒pET-30a-RegIV表達(dá)的重組蛋白共196個氨基酸殘基，N末端具有His標(biāo)簽，分子量理論值約為22KD。

2.2 重組人RegIV蛋白的表達(dá)、復(fù)性及純化 選取7號質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)前后的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，構(gòu)建的工程表達(dá)菌pET-30a-RegIV/BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在約22KD處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期分子量一致，表明目的蛋白在大腸埃希菌成功表達(dá)。目的蛋白在誘導(dǎo)表達(dá)菌超聲裂解后的離心沉淀物中，表明目的蛋白以包涵體形式表達(dá)，結(jié)果見圖4。表達(dá)產(chǎn)物包涵體經(jīng)8mol/L尿素溶液溶解，梯度尿素溶液復(fù)性，Sephacryl S-400凝膠層析進(jìn)行純化，獲得了0.31mg/mL、0.4mg/mL、0.74mg/mL、2.49 mg/mL四個濃度的RegIV重組蛋白，純化的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖5。

注：M：DNA marker；1～10：菌落

圖2 pET-30a-RegIV質(zhì)粒雙酶切驗證

圖3 pET-30a-RegIV序列比對結(jié)果

注：M：protein marker；1：未誘導(dǎo)表達(dá)菌菌體蛋白；2：IPTG誘導(dǎo)4h表達(dá)菌菌體蛋白；3：誘導(dǎo)表達(dá)菌菌體裂解上清液；4：誘導(dǎo)表達(dá)菌菌體裂解沉淀2mol/L尿素洗滌液；5：誘導(dǎo)表達(dá)菌菌體裂解沉淀8mol/L尿素溶解液。

圖5 RegIV重組蛋白復(fù)性純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

3 討論

本研究成功構(gòu)建了pET-30a-RegIV原核表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coliBL21（DE3）獲得了原核表達(dá)工程菌pET-30a-RegIV/BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)了重組人RegIV蛋白。重組人RegIV蛋白以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)梯度尿素溶液復(fù)性后使用Sephacryl S-400凝膠層析進(jìn)行純化，獲得了純度較好的的重組蛋白，為后續(xù)制備RegIV特異性抗體及開發(fā)新型的Reg IV抗癌靶向治療藥物奠定了基礎(chǔ)。