劉小飛，于 波，黃麗麗，孫映波

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創(chuàng)新綜合利用重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】杜鵑紅山茶（Camellia azalea）為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）常綠灌木或小喬木，自然分布于廣東省陽春市鵝凰嶂自然保護區(qū)，為廣東省重點保護野生植物。杜鵑紅山茶花期長，在適宜條件下可四季開花［1］，為山茶屬植物的園林應用打開了廣闊前景。目前，國內外關于杜鵑紅山茶的研究主要集中在瀕危原因及保護、生物學特性及新品種選育等方面［2］，而分子生物學水平上的相關研究較少，僅有少量關于其葉綠體基因組方面的研究［3］，基因功能方面的相關研究少見，而篩選杜鵑紅山茶適用的qRT-PCR內參基因可為杜鵑紅山茶基因功能研究提供理論基礎和技術保障。【前人研究進展】在基因功能挖掘的過程中，基因表達模式是分析基因在物種中所起作用的重要方法之一。實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是目前基因表達分析的主要方法之一，要確保其結果的可靠性與準確性，需要選擇研究條件下適用的內參基因或組合基因來檢測目的基因的相對表達量，以提高結果的可靠性。轉錄延伸因子的編碼基因（EF1α）［4-5］、α-tubulin（TUA）［6］、β-tubulin（TUB）［4］、Ubiquitin（UBQ）［7］、肌動蛋白（Actin）［8-10］和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）［8］等看家基因常被用作各物種篩選內參基因的候選基因。研究發(fā)現(xiàn)，在不同條件下，內參基因的表達量也會發(fā)生變化，例如火龍果在不同的脅迫條件下與不同組織中的適用內參基因不同［5］，擬南芥在二倍體和四倍體中所用的內參基因數(shù)目有差異［11］，類似的情況也存在于檸條錦雞兒［12］和白樺［13］中。因此，正確選擇、使用內參基因對基因功能的研究顯得尤為重要。這方面的研究在杜鵑紅山茶中尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】選擇EF1α、TUA、TUB、UBQ、Actin和GAPDH等6個看家基因作為候選內參基因，通過不同的計算程序GeNorm和NormFinder評估這些看家基因在杜鵑紅山茶不同器官和不同時期花瓣中的穩(wěn)定性?！緮M解決的關鍵問題】篩選出適用于杜鵑紅山茶不同組織和不同時期花瓣qRT-PCR分析的內參基因。利用篩選出的適用于不同條件下的內參基因，分析目的基因CaGASA3的表達模式，驗證在杜鵑紅山茶不同器官和不同時期花瓣中最佳內參基因的可靠性，以期為進一步研究杜鵑紅山茶的關鍵功能基因提供技術保障和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品來源于生長健壯的杜鵑紅山茶樹（栽種于廣東省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境園藝研究所茶花資源圃內，N23°23'、E113°23'），樹齡5年，樹高3 m，冠幅1 m，直徑3.5 cm。取幼根（YR）、成熟根（MR）、幼葉（YL）、成熟葉（ML）、4期花瓣（PS4）和5期花瓣（PS5）用于篩選不同器官適用的qRT-PCR分析的內參基因，3次重復；選取花蕾長度分別為0.5 cm（S1）、1.0 cm（S2）、1.5 cm（S3）以及4期花瓣（S4）和5期花瓣（S5）用于篩選花發(fā)育不同時期適用的qRT-PCR分析的內參基因，3次重復。用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑儀器設備：UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（B511321，生工生物工程股份有限公司），熒光定量PCR儀（StepOne Puls型，美國ABI公司），凝膠成像儀（FR-980A，上海復日科技有限公司），臺式高速離心機（TD5AWS，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司），電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠），電泳槽（DYCP-32B，北京六一儀器廠），微型旋渦混合儀（WH-3，上海滬西分析儀器廠有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HS-800D，太倉市科教器材廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 總RNA提取采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（B511321），具體操作參照說明書。400 ng RNA用于cDNA第一鏈合成，方法參照文獻［9, 14］稍作改動。所得cDNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 內參基因的選擇和引物設計 參考已有的研究報道［4-10］，在杜鵑紅山茶轉錄組結果（中國國家生物信息中心登錄號：CRX165336）中篩選出6個差異不顯著的看家基因作為候選內參基因，分別為EF1α、TUA、TUB、UBQ、Actin和GAPDH。引物通過NCBI-blast設計，所用參數(shù)為：擴增序列長度為100～250 bp，引物長度為18～25個堿基，GC含量45%～55%，Tm值為60（± 3）℃。各內參基因的引物信息見表1，由生工生物工程股份有限公司合成引物。

1.2.3 qRT-PCR反應條件 利用LightCycler480II型熒光定量PCR儀進行qRT-PCR反應，采用20 μL反應體系，其中2X SG Fast qPCR Master Mix（B639271, BBI, Roche）10 μL、ddH2O 7.2 μL、10 ng/μL cDNA 2 μL、上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）分別為0.4 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，45 個循環(huán)。每個反應3次重復。

表1 6個候選內參基因的引物信息Table 1 Primer information of 6 candidate reference genes

1.2.4 引物特異性鑒定及擴增效率計算 通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳的方法對PCR擴增的產(chǎn)物進行分析，分析反應熔解曲線圖，判斷所設計引物的特異性。將所有cDNA原液等量混合后稀釋，設置5個濃度梯度，分別為cDNA原液的100、10-1、10-2、10-3、10-4倍，測定qRT-PCR的標準曲線。程序運行完成后計算線性相關系數(shù)（R2）和擴增效率（E）。

1.2.5 內參基因穩(wěn)定性驗證及CaGASA3基因表達模式分析 以綜合排名穩(wěn)定的2個內參基因來校準杜鵑紅山茶不同器官和不同時期花瓣中CaGASA3的表達量，驗證所篩選的內參基因的表達穩(wěn)定性。CaGASA3基因qRT-PCR擴增所用的引物為：上游引物5'CTTTCACCACCTGGGTTTGG3'，下游引物5'CTCACTGAAGGCCGTGGTAAA3'。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與內參基因的確認 試驗數(shù)據(jù)采用Excel和OriginPro 9.1進行整理，利用GeNorm［15］和NormFinder［16］評估6個候選內參基因在杜鵑紅山茶不同器官和不同時期花瓣中的表達穩(wěn)定性，依據(jù)評估結果對各候選基因進行排序，篩選出兩組樣品中適用的內參基因。最適內參基因數(shù)目的確定可以利用GeNorm計算配對變異值（Pairwise Variation Value）來實現(xiàn)。當Vn/n+1＞0.15時，應當選擇n+1個內參基因作進一步校正，若Vn/n+1＜0.15，則無需引入n+1個內參基因進行校正，n個內參基因已達到準確校正目的基因表達量的要求。

2 結果與分析

2.1 總RNA質量及引物特異性

以杜鵑紅山茶不同器官和不同時期花瓣為材料提取總RNA，經(jīng)過平板電泳檢測發(fā)現(xiàn)，28S和18S條帶清晰（圖1），OD260/280介于1.86～2.03之間，表明獲得的總RNA質量較好，可用于后續(xù)試驗分析。

圖1 杜鵑紅山茶不同器官（A）和不同時期花瓣（B）總RNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from different organs（A）and petals of different stages（B）of Camellia azalea

2.2 引物擴增特異性分析和擴增效率

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)平板電泳檢測，結果（圖2）顯示，產(chǎn)物大小介于132～227 bp之間，符合設計預期，產(chǎn)物單一且無雜帶，表明所設計引物的特異性較好；同時，利用所選的6個候選內參基因引物，分別對杜鵑紅山茶不同器官和不同時期花瓣的5個濃度梯度（10倍稀釋）的cDNA模板進行qRT-PCR擴增，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制對應的標準曲線，結果表明，6個候選內參基因的相關系數(shù)R2＞0.9927（表2），表明cDNA模板量與對應的Ct值有較好的線性關系，滿足qRT-PCR要求。同時，6個候選內參基因在兩組樣品中的熔解曲線均為單峰（圖3），且重復性好，可用于不同器官和不同時期花瓣中的后續(xù)試驗。

圖2 6個候選內參基因的引物擴增特異性Fig. 2 Primer amplication specificity of 6 candidate reference genes

表2 qRT-PCR中6個候選內參基因的引物擴增效率和反應標準曲線的相關系數(shù)Table 2 Primer amplification efficiency of 6 candidate reference genes in qRT-PCR and the correlation coefficient of the reaction standard curve

2.3 候選內參基因表達豐度分析

對6個候選內參基因在不同器官和不同時期花瓣中的Ct值進行匯總，通過OriginPro 9.1軟件預測候選內參基因轉錄豐度，Ct值越小，表達豐度越高。由圖4A可知，在杜鵑紅山茶不同器官中，所有候選內參基因的Ct值介于17～24之間，表明表達比較適中。GAPDH和EF1α的Ct值最低，分別處于17.85～21.73和19.32～23.04之間，表明這2個基因轉錄豐度最高。而TUA和TUB的Ct值最高，分別介于23.97～27.57和22.60～28.17之間，表明其轉錄豐度較低。由圖4B可知，在杜鵑紅山茶不同發(fā)育時期的花瓣中，所有候選內參基因的Ct值均介于17～22之間，表明表達較適中。GAPDH的Ct值最低，介于17.60～19.48之間，表明該基因轉錄豐度最高。而TUA的Ct值最高，介于23.65～26.11之間，表明其轉錄豐度較低。

2.4 候選內參基因表達穩(wěn)定性分析

利用2個軟件分別評估6個候選內參基因在杜鵑紅山茶不同器官和不同時期花瓣中的表達穩(wěn)定性。

2.4.1 GeNorm分析 GeNorm算法是根據(jù)所有候選內參基因的成對變異值來計算各基因的表達穩(wěn)定值M的，M值越小表明基因穩(wěn)定性越好，M＜1.5的候選內參基因才可作內參基因使用。GeNorm評估結果表明，6個候選內參基因的M值均小于1.5，表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。在不同器官中候選內參基因的M值大小排序為：TUB＞EF1α＞Actin＞UBQ＞TUA＞GAPDH（圖5A），其中以GAPDH和TUA基因的穩(wěn)定性最好。在不同時期的花瓣中候選內參基因的M值大小排序為：TUA＞EF1α＞Actin＞GAPDH＞TUB＞UBQ（圖5B），其中以UBQ和TUB的穩(wěn)定性最好。

利用GeNorm計算杜鵑紅山茶不同器官和不同時期花瓣中的配對變異值，結果（圖6）表明，不同器官中V2/3值為0.148，不同時期花瓣中V2/3值為0.107，二者均小于0.15，因此，本試驗所選的兩組樣品中最適內參基因數(shù)目均為2個。

圖3 6個候選內參基因在杜鵑紅山茶不同器官（A）和不同時期花瓣（B）中的熔解曲線Fig. 3 Melting curves of 6 candidate reference genes from different organs（A）and petals of different stages（B）of Camellia azalea

2.4.2 NormFinder分析 NormFinder算法是基于方差分析對候選內參基因穩(wěn)定性進行排序，并引入不同樣品組間表達差異。與GeNorm類似，候選內參基因的表達穩(wěn)定值M越小，表達越穩(wěn)定。結果表明，在不同的器官中，6個候選內參基因按照M值由高到低排列依次為：TUB＞EF1α＞UBQ＞Actin＞TUA＞GAPDH（圖7A），表明GAPDH最穩(wěn)定，其次為TUA和Actin。在不同時期的花瓣中，6個候選內參基因按照M值由高到低排列依次為：EF1α＞TUA＞Actin＞GAPDH＞UBQ＞TUB（圖7B），表明TUB最穩(wěn)定，其次為UBQ和GAPDH。

2.5 內參基因穩(wěn)定性的驗證

為了進一步驗證篩選到的內參基因的穩(wěn)定性，選擇不同器官中穩(wěn)定性最好的內參基因（TUA和GAPDH）和不同時期花瓣中穩(wěn)定性最好的內參基因（TUB和UBQ），校準CaGASA3基因的表達模式。結果（圖8）表明，在不同器官中，分別以TUA、GAPDH和TUA+GAPDH為內參時，CaGASA3的表達模式趨勢一致，CaGASA3基因在杜鵑紅山茶的地上部分表達均較高；不同時期花瓣中，分別以UBQ、TUB和UBQ+TUB為內參時，CaGASA3在花瓣發(fā)育的不同時期表達模式趨勢相同，均在S4期表達量達到最高。通過CaGASA3基因的表達模式分析，進一步證明了TUA和GAPDH為不同器官中適用的內參基因，TUB和UBQ為不同時期花瓣中適用的內參基因。

圖4 6個候選內參基因在杜鵑紅山茶不同器官（A）和不同時期花瓣（B）中的Ct值Fig. 4 Ct values of 6 candidate reference genes in different organs（A）and petals of different periods（B）of Camellia azalea

圖5 GeNorm分析內參基因表達穩(wěn)定性Fig. 5 Gene expression stability of the candidate reference genes calculated by GeNorm

圖6 GeNorm分析最佳內參基因數(shù)目Fig. 6 Number of optimal reference genes calculated by GeNorm

圖7 NormFinder分析內參基因表達穩(wěn)定性Fig. 7 Expression stability of the candidate reference genes calculated by NormFinder

圖8 CaGASA3在杜鵑紅山茶不同器官（A）和不同時期花瓣（B）中的表達模式分析Fig. 8 Expression analysis of CaGASA3 in different organs（A）and petals of different periods（B）of Camellia azalea

3 討論

qRT-PCR技術是目前最常用的基因功能分析方法，應用qRT-PCR檢測基因功能的前提是篩選出合適的內參基因［17-26］。GeNorm［15］和NormFinder［16］是qRT-PCR內參篩選中兩種常用的評估程序，已在多種植物中廣泛應用。利用這些方法，Dai等［4］篩選出不同脅迫條件下適用于桑樹的內參基因；Saddhe等［8］篩選出不同鹽脅迫條件下適用于紅樹的內參基因；Da Silva等［7］篩選出適用于甘薯不同組織中的內參基因；Nong等［5］篩選出適用于不同脅迫條件下火龍果中的最佳內參基因。通常，看家基因在不同組織器官中具有穩(wěn)定的表達水平，但它們的轉錄水平在不同條件下會有相應變化［6,27］。因此，篩選出適用于不同研究目的的內參基因非常重要。

本研究選擇了6種看家基因作為候選內參基因，通過GeNorm和NormFinder評估了6個候選基因表達的穩(wěn)定性，并利用CaGASA3基因的表達模式驗證了所選內參基因的可靠性，最終得出在杜鵑紅山茶不同器官中的最佳內參基因為TUA和GAPDH，在杜鵑紅山茶不同時期花瓣中的最適內參基因為TUB和UBQ。內參基因 α-Tubulin（TUA）編碼的 α 微管蛋白是細胞骨架的基礎成分，在進化上具有較高的保守性，在許多物種中均能穩(wěn)定表達［20］。GAPDH是糖酵解、糖異生及光合作用碳循環(huán)過程中的關鍵酶，在紅球姜21和彩色馬蹄蓮［19］中均表達穩(wěn)定。TUB2編碼的β-微管蛋白在桑樹［4］中表達穩(wěn)定。UBQ可在紅球姜［21］、黃杜鵑［22］和火龍果［5］等植物中表達穩(wěn)定。本研究結果表明，在杜鵑紅山茶不同器官和不同時期花瓣中的最適內參基因是不同的。鑒于不同的環(huán)境條件，如非生物脅迫和生物脅迫都會影響內參基因表達的穩(wěn)定性，今后將對杜鵑紅山茶的不同脅迫條件下內參基因的表達穩(wěn)定性作進一步研究。

4 結論

本研究通過GeNorm和NormFinder對杜鵑紅山茶中6個候選qRT-PCR內參基因的穩(wěn)定性進行評估。由GeNorm程序評估得到不同器官中6個基因的穩(wěn)定性排名為：GAPDH＞TUA＞UBQ＞Actin＞EF1α＞TUB，不同時期花瓣中6個基因的穩(wěn)定性排名為：UBQ＞TUB＞GAPDH＞Actin＞EF1α＞TUA；由NormFinder程序評估得到不同器官中6個基因的穩(wěn)定性排名為：GAPDH＞TUA＞Actin＞UBQ＞EF1α＞TUB，不同時期花瓣中6個基因的穩(wěn)定性排名為：TUB＞UBQ＞GAPDH＞Actin＞TUA＞EF1α。利用GeNorm計算配對變異值表明，不同器官和不同時期花瓣中最適內參基因數(shù)目均為2個，因此，杜鵑紅山茶不同器官中最適內參基因為TUA和GAPDH，而不同時期花瓣中最適內參基因為TUB和UBQ。