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        UPLC法同時測定薔薇紅景天中絡塞維、絡塞琳和絡塞定的含量

        2020-11-20 04:25:26劉丹妮張珂陳曉祥楊璐潘馨慧王航宇王金輝
        關鍵詞:紅景天薔薇供試

        劉丹妮,張珂,陳曉祥,楊璐,潘馨慧,王航宇,王金輝,3*

        (1 石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室,新疆 石河子,832002;2 新疆林業(yè)科學院/新疆林業(yè)資源與利用國家林草局重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830052;3 深圳弘?yún)R生物醫(yī)藥有限公司,廣東 深圳 518000)

        薔薇紅景天(RhodiolaroseaL.)是一種在歐洲和亞洲廣泛應用的藥用植物,其在中國主要分布在東北、西北和西南,廣泛生長于新疆地區(qū),其具有抗腦缺血、抗氧化、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫和抗疲勞等功效[1-4]。薔薇紅景天中主要含以下幾類化學成分:苯丙烯醇苷類(絡塞維,絡塞琳),苯乙醇苷類(紅景天苷,酪醇),黃酮苷類(草質(zhì)素甙,山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖甙)單萜類(絡塞定),其中紅景天苷、酪醇以及絡塞維是薔薇紅景天中主要的活性成分,主要特征性成分是絡塞維、絡塞琳和絡塞定等化合物[5](圖1)。研究發(fā)現(xiàn),薔薇紅景天具有雙向調(diào)節(jié)和延緩衰老的藥理活性,這種的活性不僅與紅景天苷相關更與其特殊成分絡塞維,絡塞琳等苯丙素苷類成分有關。絡塞維是某些品種紅景天中重要活性成分,它在薔薇紅景天中含量較高,是其特有指標成分之一,具有良好的抗炎,和抗肺纖維化的作用[6-7]。絡塞琳和絡塞定可以有效的促進神經(jīng)興奮抗抑郁癥[8-9]、益智[10-11]、抗癌[12]等作用。

        圖1 絡塞維、絡塞琳和絡塞定的化學結構

        目前,在《中國藥典》收錄的紅景天藥材為大花紅景天(RhodiolacrenulataHk.F.et al.,Thoms)[13],主要對紅景天苷進行質(zhì)量監(jiān)控,而對絡塞維、絡塞琳和絡塞定的質(zhì)量控制較為缺少。有部分研究集中于對薔薇紅景天有效成分的分離純化,其活性成分和質(zhì)量控制的也主要集中在紅景天苷,而對其特有成分絡塞維,絡塞琳和絡塞定的研究較少,其含量測定也多采用HPLC,檢測時間較長,分離度低[14-15]。

        本研究中建立了UPLC方法同時測定薔薇紅景天中絡塞維、絡塞琳和絡塞定的含量,多種成分的含量測定可以全面反應藥材質(zhì)量,提高其抗炎、抗肺纖維化和抗抑郁等藥理作用。該方法取樣量少,簡單快速,靈敏度和分離度高,為有效的控制薔薇紅景天的質(zhì)量和改善藥理作用提供更高效的方法,為其制劑的研發(fā)和臨床應用提供科學依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        超高效液相色譜儀(Waters ACQUITY UPLC,美國Water公司),Empower 2.0色譜工作站,F(xiàn)W-100型高速萬能粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司),BSA224S型萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司),SY-360型超聲波清洗儀(上海寧商超聲儀器有限公司),TGL-16G型離心機(上海安亭科學儀器廠),SZ-93 A自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

        薔薇紅景天,由石河子大學藥學院譚勇教授鑒定為紅景天屬薔薇紅景天干燥的根,絡塞維(實驗室自制,純度≥98%),絡塞琳(實驗室自制,純度≥98%),絡塞定(實驗室自制,純度≥98%),甲醇、乙腈(色譜級,DUKSAN化學試劑公司,韓國),分析級磷酸(武漢化學試劑廠),水(實驗室自制)。

        1.2 方法

        1.2.1 色譜條件

        色譜柱:ACQUITY BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)柱,流動相A:甲醇-乙腈(1∶1),流動相B:0.1%的磷酸水溶液,梯度洗脫條件見表1,流速為0.2 mL · min-1,柱溫:30 ℃,檢測波長為210 nm。

        表1 流動相梯度洗脫條件

        1.2.2 對照品溶液的制備

        精密稱取對照品絡塞維、絡塞琳和絡塞定各適量,分別置于10 mL容量瓶中,使用色譜級甲醇進行溶解,并定容至刻度線,搖勻,即得到濃度分別為1.000、0.940和5.500 mg · mL-1的絡塞維、絡塞琳和絡塞定對照品儲備溶液。

        精密吸取1.000、0.940和5.500 mg · mL-1的絡塞維、絡塞琳和絡塞定對照品儲備溶液適量,分別置于2 mL容量瓶中,使用色譜級甲醇進行定容,搖勻,即可得到每1 mL含絡塞維 150.00 μg、絡塞琳 47.00 μg和絡塞定 550.00 μg的混合對照品溶液。

        1.2.3 供試品溶液的制備

        精密稱取薔薇紅景天粉末約1.0 g,置于50 mL具塞錐形瓶中,加入甲醇25 mL,混勻后,進行重量的稱定,在室溫條件下超聲30 min,溶液恢復到室溫,再次重量稱定,使用甲醇補足重量,混勻后,于4 000 r · min-1條件下離心10 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,濾液即為薔薇紅景天供試品溶液,取1 μL供試品溶液注入超高效液相色譜儀中進行檢測。

        1.2.4 方法學考察

        1.2.4.1 專屬性考察

        精密吸取甲醇溶劑、混合溶液和薔薇紅景天供試品溶液在“1.2.1”色譜條件下進樣分析,進樣量1 μL。

        1.2.4.2 線性關系考察

        分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 μL,在“1.2.1”色譜條件下進行色譜分析,以對照品的濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),計算回歸方程。

        1.2.4.3 精密度試驗

        取同一混合對照品溶液重復進樣6次,進樣量1 μL,以“1.2.1”色譜條件進行色譜分析。計算絡塞維、絡塞琳和絡塞定峰面積的RSD值。

        1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗

        室溫條件下,同一份供試品溶液分別取1 μL于0、1、2、4、6、8、12 h在“1.2.1”色譜條件下進行色譜分析,計算絡塞維、絡塞琳和絡塞定在12 h的峰面積的RSD值。

        1.2.4.5 重復性試驗

        精密稱取同一批號薔薇紅景天供試品6份,按照“1.2.3”方法制備供試品溶液,取1 μL供試品溶液在“1.2.1”色譜條件下進樣分析,檢測絡塞維、絡塞琳和絡塞定的含量并計算RSD值。

        1.2.4.6 加樣回收率試驗

        精密稱取已測含量的同一批次薔薇紅景天供試品6份,每份質(zhì)量約1 g,分別精密加入等量的混合對照品溶液,按照“1.2.3”的方法制備供試品溶液,在“1.2.1”色譜條件下進樣1 μL進行分析,檢測供試品的含量,并計算絡塞維、絡塞琳和絡塞定平均回收率和RSD值。

        1.2.4.7 樣品測定

        精密稱取8批新疆省不同批次的薔薇紅景天,按照“1.2.3”的方法制備供試品溶液,在“1.2.1”色譜條件下進樣1 μL進行分析,分別測定樣品中絡塞維、絡塞琳和絡塞定的含量。

        2 結果

        2.1 專屬性試驗

        供試品和對照品具有相同保留時間的色譜峰,空白溶劑甲醇在保留時間處未出現(xiàn)色譜峰,說明溶劑無干擾。色譜圖見圖2。

        a:空白溶劑;b:絡塞琳對照品;c:絡塞維對照品;d:絡塞定對照品;e:對照品混合溶液;f:薔薇紅景天供試品;1:絡塞琳;2:絡塞維;3:絡塞定。

        2.2 標準曲線的建立

        以對照品的濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),建立各成分標準曲線,結果顯示絡塞維、絡塞琳和絡塞定在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系,回歸方程及線性范圍如表2所示。

        表2 絡塞維、絡塞琳和絡塞定的線性回歸方程 n=7

        2.3 精密度試驗

        數(shù)據(jù)分析得到絡塞維、絡塞琳和絡塞定峰面積的RSD值分別為0.26%、0.30%和0.24%,結果顯示儀器具有良好的精密度,為檢測結果的準確性提供基礎。

        2.4 穩(wěn)定性試驗

        檢測得到絡塞維、絡塞琳和絡塞定的峰面積,數(shù)據(jù)分析顯示RSD值分別為1.30%、0.82%和0.39%,說明薔薇紅景天供試品在室溫條件下12 h具有良好的穩(wěn)定性。

        2.5 重復性試驗

        檢測得到絡塞維、絡塞琳和絡塞定的峰面積,數(shù)據(jù)分析顯示RSD值分別為1.49%、1.41%和1.26%,說明該方法具有良好的重復性。

        2.6 加樣回收率試驗

        平行測定6份供試品,檢測得到絡塞維、絡塞琳和絡塞定平均回收率結果見表3,數(shù)據(jù)分析顯示RSD值分別為2.61%、2.86%和2.54%,加樣回收率符合標準范圍。

        表3 絡塞維、絡塞琳和絡塞定的回收率測定結果 n=6

        2.7 樣品測定

        按照“1.2.4.7”的方法操作,將8個不同批次(S1-S8)的薔薇紅景天樣品測定結果通過2.2建立的線性回歸方程計算各樣品中絡塞維,絡塞琳和絡塞定的含量(表4)。

        表4 樣品含量測定結果 n=3

        3 討論

        3.1 檢測波長的選擇

        本實驗中采用紫外-可見分光光度法,在190~400 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描,發(fā)現(xiàn)絡塞維、絡塞琳和絡塞定在210 nm處均有良好的峰形。210 nm作為檢測波長,能夠適用于各組分的檢測,同時響應值均勻有效,結果具有代表性。

        3.2 流動相的選擇

        為實現(xiàn)供試品中絡塞維、絡塞琳和絡塞定有效的分離,并且不受溶劑和其他化學成分影響,對方法中流動相進行優(yōu)化,選用甲醇-水、甲醇-0.1%的磷酸溶液、乙腈-0.1%的磷酸溶液和甲醇-乙腈-0.1%的磷酸溶液分別作為流動相進行梯度洗脫。結果顯示,甲醇-乙腈-0.1%的磷酸溶液流動相系統(tǒng)具有良好的分離效果,故優(yōu)選該流動相系統(tǒng)對樣品進行梯度洗脫。

        3.3 提取方法的選擇

        本實驗考察了提取溶劑體積和提取時間對樣品提取率的影響,選用25、50 mL的甲醇溶劑對同一批薔薇紅景天藥材粉末進行超聲處理30 min,溶劑體積為25 mL時,可將樣品中絡塞維、絡塞琳和絡塞定3種成分完全提取,故選用25 mL甲醇溶劑進行樣品提取。對提取時間的考察,采用25 mL甲醇為提取溶劑,分別超聲提取20、 30、60 min,結果顯示,提取時間為30 min時上述3種成分可以完全被提取。因此,優(yōu)選25 mL甲醇,超聲提取30 min為提取條件。

        3.4 含量測定

        研究中考察了不同批次樣品中絡塞維、絡塞琳和絡塞定的含量,收集了新疆省8個不同批次的薔薇紅景天藥材,研究結果顯示,不同批次薔薇紅景天中絡塞維、絡塞琳和絡塞定的含量存在較大差異,含量范圍為0.01%~1.85%、0.04%~0.51%和0.11%~3.26%,這可能與藥材的生長年限、采集時間、氣候等有較大的相關性。絡塞維、絡塞琳和絡塞定是薔薇紅景天中特殊的有效活性成分,絡塞維不僅具有抗氧化、抗疲勞等基本功效還有良好的抗炎和治療肺纖維化的作用,絡塞琳和絡塞定也可以促進神經(jīng)興奮,具有抗抑郁和抗癌等功效。通過對其含量測定可明確藥物有效成分的含量,對薔薇紅景天以及相關制劑的安全性和有效性進行評價和控制,為改善藥物的藥理作用,提高藥用價值提供基礎。

        綜上,本研究所建立的薔薇紅景天中絡塞維、絡塞琳和絡塞定的含量測定方法,具有靈敏度和精確度高,簡單快捷,準確性和重現(xiàn)性良好,穩(wěn)定性高,可應用于薔薇紅景天的含量測定,優(yōu)化其質(zhì)量控制。該研究為薔薇紅景天的藥動學以及系統(tǒng)藥理學等研究奠定一定的基礎,同時為其制劑研發(fā)和臨床應用提供依據(jù)。

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